Despite the fact that Glycosyl Hydrolase Family 32 present 4 467 enzyme entries, only 14 of them have been characterized structurally. From the ten protein crystal structures deposited for Bifidobacterium adolescentis ATCC 15703 at PDB just one enzyme is related to the processing of non-digestible sugars and there is no structure of a β-fructofuranosidase. In this research we studied the biochemical properties and the structural features of a recombinant β-fructofuranosidase (BaFFse) from the healthy gut bacteria B. adolescentis ATCC 15703 (gen BAD_1325) heterologously expressed in Escherichia coli Rosetta. The enzyme was purified by nickel ion affinity chromatography and molecular exclusion chromatography; the purification process was judged by denaturing SDS-PAGE gel. Sucrose was used as a substrate for the enzyme activity assays and the amount of reducing sugars, detected by Dinitrosalycilic acid, was taken as indicator of the optimum conditions of hydrolysis for the enzyme. BaFFase crystal, grown in PEG 8K 25% (w/v) and buffer MES 0.1M pH 6.5, was diffracted at 2.44 Å and processed using the CCP4 program package. The enzyme presented a classical four-stranded five-bladed β-propeller and a C-terminal β-sandwich characteristic from the GH 32 family; however, connected to the β-propeller through a loop of 38 residues, BaFFase also presented an N-terminal β-sandwich domain, which sequence (residues 3-100 from BaFFase) did not match with any protein sequence when aligned against PDB database. Assays with Gel filtration calibration, DLS and SAXS showed that the enzyme was a stable homodimer in solution. Based on the superposition of structures using the a β-fructofuranosidase from B. longum KN29.1 we could deduced the three key aminoacids involved in the transferring of fructosyl moieties by BaFFase. A nucleophile attack is performed by the carboxylate of Asp 131, forming the fructose BaFFase intermediate; Glu 375 donates a proton, acting as an acid base catalyst and Asp 269 stabilizes the transitions state in the fructosyl transferring activity. This is the first GH32 oligomeric enzyme belonging to the bacteria kingdom. We have described a novel additional β-sandwich domain for a GH32 enzyme that increases the region of contact to form a dimer. This is the first β-fructofuranosidase crystal structure from the microorganism B. adolescentis ATCC 15703. / O presente trabalho disserta sobre os estudos das propriedades bioquímicas e as características estruturais de uma β-frutofuranosidase recombinante (BaFFse) da bactéria Bifidobacterium adolescentis ATCC 15703 (gen BAD_1325) presente em intestinos saudáveis. A proteína foi expressa heterologamente em Escherichia coli Rosetta. A enzima foi purificada por cromatografia de afinidade (íons de níquel) e cromatografia de exclusão por massa molecular; o processo de purificação foi avaliado por gel desnaturante tipo SDS-PAGE. A sacarose foi usada como substrato para os ensaios de atividade enzimática e a quantidade de açúcares redutores, detectados por ácido dinitrosalicílico, foi tomada como indicador das condições ótimas de hidrólise para a enzima. Cristais de BaFFase, crescidos em solução contendo PEG 8 k em tampão Hepes pH 6,5, foram difratados a uma resolução de 2,44 Å e processados utilizando o pacote de programas CCP4. A enzima apresentou um clássico enovelamento tipo composto por cinco pás de quatro-fitas β cada e um domínio C-terminal sanduíche-β característico da família GH32; no entanto, ligado ao β-propeller, através de um loop de 38 resíduos, a BaFFase apresentou um inédito domínio N-terminal sanduíche-β (resíduos 3-100 de BaFFase) ainda sem precedentes, quando alinhado contra a base de dados PDB. Ensaios de gel filtração, DLS e SAXS mostraram que a enzima se apresenta como um homodímero estável em solução. Com base na superposição estrutural, utilizando uma β-frutofuranosidase de B. longum KN29.1, foi possível inferir os três aminoácidos essenciais envolvidos na transferência de unidades de frutosil pela BaFFase. Um ataque nucleofílico é realizado pelo grupo carboxílico do Asp131, formando um intermediário frutose-BaFFase; o Glu375 doa um próton, atuando como um catalisador ácido-base e o Asp269 estabiliza o estado transições na atividade de transferência frutose. Um novo domínio sanduíche-β adicional para uma enzima GH32 é descrito. Esse domínio é responsável pelo aumento da região de contato e essencial para a formação do homodímero. Esta é a primeira estrutura cristalina da β-frutofuranosidase do microrganismo B. adolescentis ATCC 15703, além de ser a primeira enzima GH32 descrita neste estado oligomérico pertencente ao reino das bactérias.

Made available in DSpace on 2016-06-02T20:21:37Z (GMT). No. of bitstreams: 1 6599.pdf: 2881840 bytes, checksum: f0c91115276cbdeae047c039f2676980 (MD5) Previous issue date: 2015-02-27 / Universidade Federal de Sao Carlos / The sugar cane represents one of the most Important agricultural segments in Brazil, which is the largest producer and exporter of sugar in the world as well the second largest ethanol producer. The Sphenophorus levis (Curculionidae) is an important sugarcane pest which lacks effective methods of control. The larvae of this insect feed the sugar cane plant decreasing productivity and causing the plant death. In view of identify the insect digestive arsenal enzymes, a transcriptome study was previously performed from S. levis larvae. Thereby, an invertase (P-fructofuranosidases class) coding sequence was identified and characterized. Considering the scarcity of functional studies on insect P-fructofuranosidases and their apparent non-occurrence among coleopterans, the aim of the present study was to investigate the occurrence and characterize the P-fructofuranosidase transcript identified. To validate that the P-fructofuranosidase sequence (herein denominated Sl-fi-fruct) is indeed encoded by the S. levis genome, PCRs were performed using genomic DNA extracted from the larval fat body as well as DNA from the midgut with microbial content. Amplification of Sl-fi-fruct gene using larval fat body DNA indicated its presence in the insect's genomic DNA. Quantitative PCR (qRT-PCR) analyses indicated that the production of mRNA only occurs in the midgut and reaches the greatest expression level in 30-day-old larvae, which is the expected pattern for digestive enzymes. Chromatography of glycosidases from S. levis midguts showed two enzymes acting as P-fructofuranosidase, indicating the presence of a Sl-fi-fruct isoform or a P-fructofuranosidase from insect intestinal microbiota. Moreover, it was found that a-glucosidases do not act on sucrose hydrolysis. Phylogenetic analyses indicated this enzyme to be similar to enzymes found in other coleopteran and lepidopteran P-fructofuranosidases, but also closely similar to bacterial enzymes, suggesting potential horizontal gene transfer. Despite this, the enzyme seems to be restricted to different groups of bacteria, which suggests distinct origin events. The Sl-fi-fruct gene was cloned in Pichia pastoris to produce the recombinant enzyme (rSl-P-fruct). Molecular weight of the recombinant protein was about 64 kDa, indicating possible glycosylation, since the theoretical weight was 54.8 kDa. The substrate specificity test revealed that rSl-P-fruct hydrolyzes sucrose and raffinose, but not melibiose or maltose, thereby confirming invertase activity. The pH curve revealed greatest activity at pH 5.0, demonstrating rSl-P-fruct to be an acidic P-fructofuranosidase. The enzymatic characterization was done and the optimum temperature was 50 °C, thermal resistance at 36 °C and pH maximum resistance at 6.0. The Michaelis-Menten curve showed Km=20.02 μM, Kcat=520.9 s-1 and Vmax=105.7 μM.s-1. 5 mM of SDS and MgCl2 cause inhibition of rSl-β-fruct activity. The present study expands the concept of the occurrence of P-fructofuranosidase in insects. Despite the few descriptions of this gene in the animal kingdom, it is possible to state that P-fructofuranosidase is crucial to the establishment of some insects throughout their evolutionary history, especially members of the Lepidoptera and Coleoptera clades. Considering the rSl-P-fruct potential to industrial application, they are promising if the thermal properties are improved. / O coleóptero Sphenophorus levis é uma Importante praga da cana-de-açúcar, para o qual ainda não existe um método de controle adequado. Considerando a Importância da cultura canavieira no Brasil, maior produtor e exportador de açúcar e segundo maior produtor de etanol no mundo, um estudo transcriptômico das larvas do inseto foi realizado anteriormente a este trabalho para a identificação do seu arsenal digestivo. Dentre as prováveis enzimas digestivas, foram identificadas sequências que codificam uma enzima da classe das P-frutofuranosidases. O sequenciamento do clone de cDNA foi totalizado e verificou-se a presença de sinal de poliadenilação e cauda poli-A característica de eucariotos, bem como uma região codificadora para um provável peptídeo sinal para secreção da enzima. A comparação da sequência proteica deduzida com o banco de dados do NCBI aponta maior similaridade com invertases bacterianas. A amplificação do gene da P-frutofuranosidase de S. levis (Sl-fi-fruci) por PCR a partir de DNA genômico, livre de contaminação bacteriana, sugere que S. levis realmente codifica uma P-frutofuranosidase. Comparando-se sequências de aminoácidos de P-frutofuranosidases de coleópteros, observam-se regiões conservadas entre membros da família Curculionidae. O ensaio bioquímico das glicosidases intestinais de S. levis mostrou que existem provavelmente duas P-frutofuranosidases responsáveis pela digestão de sacarose. Portanto, o inseto pode apresentar uma isoforma da Sl-fí-fruct ou se beneficiar de uma invertase produzida pela própria microbiota. As análises de expressão via PCR quantitativo em tempo real revelaram que o gene é expresso em intestino médio, nas fases de alimentação do inseto, característica de uma enzima digestiva. As análises filogenéticas indicaram que Sl-P-fruct é similar a outras P-frutofuranosidases de lepidópteros e coleópteros, mas se apresenta mais próxima das enzimas bacterianas. Essa proximidade se dá a grupos distintos de bactérias, quando comparada com enzimas de lepidópteros, levando-nos a propor um evento de transferência horizontal independente do que ocorreu em lepidópteros. A fase aberta de leitura (ORF) codificadora da enzima, excluindo o peptídeo sinal, foi clonada no plasmídeo pPICZa-A para sua produção heteróloga em Pichia pastoris. A enzima produzida (rSl-P-fruc) apresentou-se glicosilada, com massa molecular aproximada de 65 kDa. Os ensaios de especificidade ao substrato confirmaram que a enzima é uma P-frutofuranosidase. A rSl-P-fruc apresentou pH de maior atividade próximo a 5,0 e temperatura de atividade máxima próxima a 50 °C. Os ensaios de termoestabilidade e resistência térmica sugerem uma baixa capacidade térmica para rSl-P-fruc, que se desnatura com facilidade. Os sais Dodecil Sulfato de Sódio (SDS) e MgCl2 provocam inibição da rSl-P-fruc na concentração de 1 mM. As constantes cinéticas estimadas para a rSl-P-fruct foram Km = 20,02 mM, Vmax = 105,7 |iM.s-1 e kcat = 520,9 s-1. O presente estudo expande o conceito da ocorrência de P-frutofuranosidases em coleópteros. Apesar dos poucos relatos desse gene no reino animal, é possível afirmar que a P-frutofuranosidase é importante e vem sendo mantida entre algumas espécies de lepidópteros e coleópteros. Tratando-se das potencialidades que a rSl-P-fruct apresenta para uma aplicação industrial, observa-se um potencial positivo caso haja melhorias em sua estabilidade térmica.

Despite the fact that Glycosyl Hydrolase Family 32 present 4 467 enzyme entries, only 14 of them have been characterized structurally. From the ten protein crystal structures deposited for Bifidobacterium adolescentis ATCC 15703 at PDB just one enzyme is related to the processing of non-digestible sugars and there is no structure of a β-fructofuranosidase. In this research we studied the biochemical properties and the structural features of a recombinant β-fructofuranosidase (BaFFse) from the healthy gut bacteria B. adolescentis ATCC 15703 (gen BAD_1325) heterologously expressed in Escherichia coli Rosetta. The enzyme was purified by nickel ion affinity chromatography and molecular exclusion chromatography; the purification process was judged by denaturing SDS-PAGE gel. Sucrose was used as a substrate for the enzyme activity assays and the amount of reducing sugars, detected by Dinitrosalycilic acid, was taken as indicator of the optimum conditions of hydrolysis for the enzyme. BaFFase crystal, grown in PEG 8K 25% (w/v) and buffer MES 0.1M pH 6.5, was diffracted at 2.44 Å and processed using the CCP4 program package. The enzyme presented a classical four-stranded five-bladed β-propeller and a C-terminal β-sandwich characteristic from the GH 32 family; however, connected to the β-propeller through a loop of 38 residues, BaFFase also presented an N-terminal β-sandwich domain, which sequence (residues 3-100 from BaFFase) did not match with any protein sequence when aligned against PDB database. Assays with Gel filtration calibration, DLS and SAXS showed that the enzyme was a stable homodimer in solution. Based on the superposition of structures using the a β-fructofuranosidase from B. longum KN29.1 we could deduced the three key aminoacids involved in the transferring of fructosyl moieties by BaFFase. A nucleophile attack is performed by the carboxylate of Asp 131, forming the fructose BaFFase intermediate; Glu 375 donates a proton, acting as an acid base catalyst and Asp 269 stabilizes the transitions state in the fructosyl transferring activity. This is the first GH32 oligomeric enzyme belonging to the bacteria kingdom. We have described a novel additional β-sandwich domain for a GH32 enzyme that increases the region of contact to form a dimer. This is the first β-fructofuranosidase crystal structure from the microorganism B. adolescentis ATCC 15703. / O presente trabalho disserta sobre os estudos das propriedades bioquímicas e as características estruturais de uma β-frutofuranosidase recombinante (BaFFse) da bactéria Bifidobacterium adolescentis ATCC 15703 (gen BAD_1325) presente em intestinos saudáveis. A proteína foi expressa heterologamente em Escherichia coli Rosetta. A enzima foi purificada por cromatografia de afinidade (íons de níquel) e cromatografia de exclusão por massa molecular; o processo de purificação foi avaliado por gel desnaturante tipo SDS-PAGE. A sacarose foi usada como substrato para os ensaios de atividade enzimática e a quantidade de açúcares redutores, detectados por ácido dinitrosalicílico, foi tomada como indicador das condições ótimas de hidrólise para a enzima. Cristais de BaFFase, crescidos em solução contendo PEG 8 k em tampão Hepes pH 6,5, foram difratados a uma resolução de 2,44 Å e processados utilizando o pacote de programas CCP4. A enzima apresentou um clássico enovelamento tipo composto por cinco pás de quatro-fitas β cada e um domínio C-terminal sanduíche-β característico da família GH32; no entanto, ligado ao β-propeller, através de um loop de 38 resíduos, a BaFFase apresentou um inédito domínio N-terminal sanduíche-β (resíduos 3-100 de BaFFase) ainda sem precedentes, quando alinhado contra a base de dados PDB. Ensaios de gel filtração, DLS e SAXS mostraram que a enzima se apresenta como um homodímero estável em solução. Com base na superposição estrutural, utilizando uma β-frutofuranosidase de B. longum KN29.1, foi possível inferir os três aminoácidos essenciais envolvidos na transferência de unidades de frutosil pela BaFFase. Um ataque nucleofílico é realizado pelo grupo carboxílico do Asp131, formando um intermediário frutose-BaFFase; o Glu375 doa um próton, atuando como um catalisador ácido-base e o Asp269 estabiliza o estado transições na atividade de transferência frutose. Um novo domínio sanduíche-β adicional para uma enzima GH32 é descrito. Esse domínio é responsável pelo aumento da região de contato e essencial para a formação do homodímero. Esta é a primeira estrutura cristalina da β-frutofuranosidase do microrganismo B. adolescentis ATCC 15703, além de ser a primeira enzima GH32 descrita neste estado oligomérico pertencente ao reino das bactérias.