An important element of metabolic regulation of cardiac and skeletal muscle energetics is the interaction of mitochondria with cytoskeleton. Mitochondria are in charge of supplying the cells with energy, adjusting its functional activity under conditions of stress or other aspects of life. Mitochondria display a tissue-specific distribution. In adult rat cardiomyocytes, mitochondria are arranged regularly in a longitudinal lattice at the level of A band between the myofibrils and located within the limits of the sarcomeres. In interaction with cytoskeleton, sarcomeres and sarcoplasmic reticulum they form the functional complexes, the intracellular energetic units (ICEUs). The ICEUs have specialized pathways of energy transfer and metabolic feedback regulation between mitochondria and ATPases, mediated by CK and AK. The central structure of ICEUs is the mitochondrial interactosome (MI) containing ATP Synthasome, respiratory chain, mitochondrial creatine kinase and VDAC, regulated by tubulins. The main role of MI is the regulation of respiration and the intracellular energy fluxes via phosophotransfer networks. The regulation of ICEUs is associated with structural proteins. The association of mitochondria with several cytoskeletal proteins described by several groups has brought to light the importance of structure-function relationship in the metabolic regulation of adult rat cardiomyocytes. To purvey a better understanding of these findings, the present work investigated the mechanism of energy fluxes control and the role of structure-function relationship in the metabolic regulation of adult rat cardiomyocytes. To show these complex associations in adult cardiac cells several proteins were visualized by confocal microscopy: α-actinin and β-tubulin isotypes. For the first time, it was showed the existence of the specific distribution of β-tubulin isotypes in adult cardiac cells. Respiratory measurements were performed to study the role of tubulins in the regulation of oxygen consumption. These results together confirmed the crucial role of cytoskeletal proteins -i.e. tubulins, α-actinin, plectin, desmin, and others- for the normal shape of cardiac cells as well as mitochondrial arrangement and regulation. In addition, in vivo - in situ mitochondrial dynamics were studied by the transfection of GFP-α-actinin, finding that fusion phenomenon does not occur as often as it is believed in healthy adult cardiac cells. / Un élément important de la régulation du métabolisme énergétique des muscles cardiaque et squelettiques est l'interaction des mitochondries avec le cytosquelette. Les mitochondries sont responsables de l'approvisionnement des cellules en énergie, elles sont capables d'ajuster leur activité fonctionnelle en fonction des conditions de stress ou d'autres aspects de la vie. Les mitochondries ont une distribution spécifique selon les tissus. Dans les cardiomyocytes de rats adultes, les mitochondries sont disposées régulièrement dans un entrelacement longitudinal au niveau des bandes A, entre les myofibrilles et dans les limites des sarcomères. En interaction avec le cytosquelette, le sarcomère et le réticulum sarcoplasmique, elles forment des complexes fonctionnels appelés unités énergétiques intracellulaires (ICEUs). Les ICEUs ont des voies spécialisées de transfert d'énergie et de régulation des feedback métaboliques entre les mitochondries et les ATPases, médiée par la CK et l'AK. La structure centrale des ICEUs est l'interactosome mitochondrial (MI) qui confient l'ATP synthasome, la chaîne respiratoire, la créatine kinase mitochondriale et VDAC, qui pourrait être régulé par les tubulines. Le rôle principal du MI est la régulation de la respiration et des flux d'énergie intracellulaires via les réseaux de phosphotransfert. La régulation des ICEUs est liée aux protéines structurales. L'association des mitochondries avec plusieurs protéines du cytosquelette, décrite par plusieurs groupes, a mis en évidence l'importance de la relation structure-fonction dans la régulation métabolique des cardiomyocytes de rats adultes. Pour fournir une meilleure compréhension de ces résultats, le présent travail étudie le mécanisme de contrôle des flux d'énergie et le rôle des relations structure-fonction dans la régulation métabolique de cardiomyocytes de rats adultes. Pour montrer ces associations complexes dans les cellules cardiaques adultes, plusieurs protéines ont été visualisées par microscopie confocale: l'α-actinine et les isoformes des β-tubulines. Pour la première fois, l'existence d'une distribution spécifique des isoformes de β-tubuline dans les cellules cardiaques adultes a été montré. Des mesures respiratoires ont été réalisées pour étudier le rôle des tubulines dans la régulation de la consommation d'oxygène. Ces résultats ont confirmé le rôle déterminant des protéines du cytosquelette -tubulines, α-actinine, plectine, desmine, et autres- pour le maintien de la forme normale des cellules cardiaques, ainsi que de l'arrangement et de la régulation mitochondrial. En outre, la dynamique mitochondriale a été étudiée in vivo et in situ par la transfection de la GFP-α-actinine, ceci permettant la mise en évidence du fait que le phénomène de fusion ne se produit pas aussi souvent qu'on ne le croit pour des cellules cardiaques adultes en bonne santé.

Les canaux potassiques sensibles à l'ATP (K-ATP) jouent un rôle fondamental au sein de la cellule, puisqu'ils ajustent le potentiel de membrane en fonction de l'état métabolique. Ils combinent deux types de protéines: le récepteur des Sulfonylurée (SUR), protéine régulatrice faisant partie des transporteurs ABC, et le canal potassique rectifiant entrant Kir6. Elles s'associent en formant un hétérooctamère (4 SUR/4 Kir6) d'une taille de ~ 1MDa. A l'heure actuelle, l'unique structure disponible de ce complexe est une structure basse-résolution de 18 Å qui ne permet pas de visualiser correctement l'arrangement des différentes sous-unités. Le but principal de ce projet de thèse était d'obtenir des informations à la fois structurales et fonctionnelles sur le couplage entre Kir6.2 et SUR.Il existe 2 isoformes du Kir6 humain (Kir6.1 et 6.2) et 3 isoformes de SUR : SUR1, principalement exprimée avec Kir6.2 dans les cellules β pancréatiques et les neurones ; SUR2A, très abondante avec Kir6.1 dans les muscles cardiaques et squelettiques ; et SUR2B, présent avec Kir6.1 au niveau des muscles lisses. La façon dont SUR est capable de moduler l'ouverture du canal en réponse à la fixation d'un ligand est encore mal comprise.Au sein du canal K-ATP, SUR a un rôle de modulateur du gating de Kir6.2. Il a été montré que trois résidus (E1305, I1910, L1313) dans SUR2A, étaient impliqués dans la « voie d'activation » liant la fixation d'un ligand sur SUR2A et l'ouverture du canal Kir6. Afin d'examiner le rôle des résidus correspondants au sein de SUR1, nous avons réalisé des chimères entre SUR1 et le transporteur ABC MRP1 (qui n'interagit pas avec Kir6.2) et utilisé la technique du patch-clamp pour évaluer leur fonctionnalité. Nos résultats ont montré que les mêmes résidus au sein de SUR1 et SUR2A sont impliqués dans l'association fonctionnelle avec Kir6.2, mais que les spécificités au niveau de la chaine latérale pourraient expliquer les propriétés propres aux canaux pancréatiques et cardiaques. En effet, dans le pancréas, les canaux SUR1/Kir6.2 sont partiellement actifs au repos tandis que les canaux SUR2A/Kir6.2 du cœur sont principalement fermés. Cette spécificité peut être expliquée par les interactions spécifiques de SUR1 et SUR2A avec Kir6.2.La participation du canal Kir6.2 dans le couplage avec SUR ne peut être facilement étudiée puisque la région allant du N-terminal de Kir6.2 jusqu'à sa première hélice est physiquement associée à SUR. Des mutations à ce niveau pourraient affecter à la fois l'interaction physique et fonctionnelle avec SUR. Pour passer outre cet obstacle, nous avons utilisé la technologie ICCR développée dans notre laboratoire. Les ICCRs sont des protéines artificielles créées par couplage physique du C-terminal d'un RCPG au N-terminal de Kir6.2. Cette technologie permet l'étude de la fonction du N-ter de Kir6.2 puisque la fusion entre le RCPG et le canal assure une association fonctionnelle : le signal électrique généré par le canal ionique est directement lié à la fixation du ligand sur le RCPG. Le domaine reliant les deux protéines est essentiel pour la fonction de l'ICCR et sa longueur affecte la régulation du canal. De façon intéressante, deux ICCRs de même longueur mais ayant 9 résidus de différence présentent deux phénotypes différents : un fonctionnel, un inactif. L'ICCR inatif est caractérisé par la perte des résidus 26 à 34 du N-ter contenant 5 arginines. Nous avons réalisé la cartographie fonctionnelle de ces résidus essentiels pour la régulation de Kir6.2. Successivement, nous avons effectué les mêmes mutations d'arginines au sein du canal naturel K-ATP, mais n'avons pas observé de différence entre le canal muté et sauvage. Ces résultats suggèrent qu'il existe au moins deux voie de régulation pour le gating de Kir6.2 : une via les arginines du N-ter (utilisé par les RCPGs) et l'autre, toujours inconnue, utilisée par SUR. / ATP-sensitive potassium (K-ATP) channels play a key role in adjusting the membrane potential to the metabolic state of cells. They result from the unique combination of two proteins: the SulfonylUrea Receptor (SUR), a protein of the ABC transporters family, and the inward rectifier K+ channel Kir6. Both subunits associate to form a heterooctamer (4 SUR/4 Kir6) of ~ 1MDa. A high-resolution structure of the complex is still missing. To date, only a 18 Å structure of the full complex is available. Unfortunately, the low resolution prevent visualization of subunits arrangement. This PhD project aimed at obtaining structural and functional information on the functional coupling between Kir6.2 and SUR. Structural studies are still in progress.While 2 isoforms of the human Kir6 protein exists (Kir6.1 and 6.2), 3 isoforms of the SUR protein are known: SUR1, mostly expressed in pancreatic β-cells and neurons mainly with Kir6.2, SUR2A, abundant in cardiac and skeletal muscle mainly with Kir6.2, and SUR2B, found in smooth muscle mostly with Kir6.1. How SUR modulates channel gating in response to the binding of ligands is still poorly understood.The SUR protein belongs to a family of transporters but in K-ATP works as a gating modulator. How a 'transporter' modulate Kir6 gating? In SUR2A three residues (E1305, I1310, L1313) were found to be implicated in the ‘activation pathway' linking binding of openers to SUR2A and channel opening. To examine the role of the matching residues in the SUR1 isoform, we designed chimeras between SUR1 and the ABC transporter MRP1 (which does not interact with Kir6.2), and used patch clamp to assess the functionality of SUR1/MRP1 K-ATP chimeric channels. Our results reveal that the same residues in SUR1 and SUR2A are involved in the functional association with Kir6.2, but they display side-chain specificities that could account for the contrasted properties of pancreatic and cardiac K-ATP channels. In fact, in pancreas, SUR1/Kir6.2 channels are partly active at rest while in cardiomyocytes SUR2A/Kir6.2 channels are mostly closed. This divergence of function could be related to differences in the interaction of SUR1 and SUR2A with Kir6.2.The participation of the Kir6.2 channel in the coupling with SUR cannot be easily studied, as the region spanning from Kir6.2 N-terminal to its first helix is in thigh physical association with SUR. Mutations at this level could affect both physical and functional interaction with the regulatory subunit. To overcome this obstacle we used the ICCR technology developed in our laboratory. ICCRs are artificial proteins created by physical and functional linkage of a GPCR C-terminus to the Kir6.2 N-terminus. ICCRs provide a unique method to study the function of the Kir6.2 channel N-terminal, as the fusion between GPCR and channel ensure physical association. In ICCRs the electrical signal generated by the ion channel is directly linked to ligand binding on the GPCR. The domain linking GPCR and channel is crucial for ICCR function and its length affects channel regulation. Interestingly, two ICCRs, having identical linker length but nine residues differences at the fusion point, showed different phenotypes: one functional, one inactive (no channel regulation). The inactive ICCR is characterized by the lack of residues 26 to 34 in the channel N-terminus containing 5 arginines. We functionally mapped these arginines and identify specific residues essential for Kir6.2 regulation. Successively, we transferred this knowledge to the K-ATP mutating the previously found essential arginines. Here, we did not observe any change compared to wild-type channels. This result suggest that there are at least two ways to modulate Kir6.2 gating: one through the arginines in the N-terminal (used by the GPCR) and another, still unknown, used by SUR.

L’attention et l’Adaptation Saccadique (AS) sont des composants essentiels de la perception visuelle, le premier renforce le traitement sensoriel des items sélectionnés, le second maintient la précision des mouvements des yeux vers ceux-ci. Ils partagent aussi une dichotomie : les saccades volontaires et l’orientation endogène de l’attention suivent nos buts internes tandis que les saccades réactives et l’orientation exogène répondent aux changements soudains dans l’espace visuel. Leurs substrats neuronaux se superposent en partie. Enfin, chacun impacte l’autre au niveau comportemental. Ce travail de doctorat étudie l’hypothèse d’un couplage fonctionnel entre attention et AS.Toutes nos études chez l’humain sain reposent sur la mesure des performances attentionnelles avant et après l’exposition à l’AS (ou contrôle). Dans la première nous avons exploré les bases neurophysiologiques du couplage réactif/exogène en magnétoencéphalographie. Dans la suivante nous avons comparé l’orientation exogène mesurée par un paradigme de Posner avant et après AS réactive. La dernière, basée sur le même modèle, explorait la modalité volontaire/endogène. Nos résultats montrent que l’AS augmente l’activité oscillatoire gamma et renforce l’orientation de l’attention spatiale. Nous proposons que le couplage repose sur la co-activation de populations neuronales par la plasticité oculomotrice et l’attention au niveau du Cortex Pariétal Postérieur (CPP). Cette activation émerge initialement d’un double effet du cervelet qui inhibe le CPP gauche et active le CPP droit. Cet effet augmente la dominance hémisphérique droite et le biais attentionnel vers la gauche. Notre travail ouvre des perspectives de rééducation des déficits visuo-attentionels / Attention and Saccadic Adaptation (SA) are critical components of visual perception, the former enhancing sensory processing of selected objects, the latter maintaining the eye movements accuracy towards them. Also, a similar dichotomy could be applied to both: voluntary saccades and endogenous attentional shifts follow internal goals while reactive saccades and exogenous shifts are elicited by sudden changes in the environment. Further, their neural substrates partially overlap and they impact each other behaviorally. This PhD work investigates the hypothesis of a functional coupling linking attention and SA in healthy humans. Our experimental contributions all rely on the measurement of attentional performances before and after an exposure to SA (or control). In the first study, we recorded brain magnetic fields to investigate neurophysiological bases of the reactive/exogenous coupling. In the second study, we compared exogenous orienting measured in a Posner-like paradigm before and after reactive SA. Finally, using the same design, the third experiment investigated the voluntary/endogenous modality. We found that SA increased gamma band activity and boosted the orienting of spatial attention. We thus propose that this functional coupling relies on neuronal populations co-activated by both oculomotor plasticity and attention in the Posterior Parietal Cortex (PPC). The initial activation would emerge from a dual effect of the cerebellum inhibiting the left PPC and activating the right PPC. This effect would increase the right hemispheric dominance and the leftward attentional bias. This work opens new perspectives for the rehabilitation of visuoattentional deficits

Cell functions are steered by complex interactions of gene products, like forming a temporary or stable complex, altering gene expression or catalyzing a reaction. Mapping these interactions is the key in understanding biological processes and therefore is the focus of numerous experiments and studies. Small-scale experiments deliver high quality data but lack coverage whereas high-throughput techniques cover thousands of interactions but can be error-prone. Unfortunately all of these approaches can only focus on one type of interaction at the time. This makes experimental mapping of the genome-wide network a cost and time intensive procedure. However, to overcome these problems, different computational approaches have been suggested that integrate multiple data sets and/or different evidence types. This widens the stringent definition of an interaction and introduces a more general term - functional association.  FunCoup is a database for genome-wide functional association networks of Homo sapiens and 16 model organisms. FunCoup distinguishes between five different functional associations: co-membership in a protein complex, physical interaction, participation in the same signaling cascade, participation in the same metabolic process and for prokaryotic species, co-occurrence in the same operon. For each class, FunCoup applies naive Bayesian integration of ten different evidence types of data, to predict novel interactions. It further uses orthologs to transfer interaction evidence between species. This considerably increases coverage, and allows inference of comprehensive networks even for not well studied organisms.  BinoX is a novel method for pathway analysis and determining the relation between gene sets, using functional association networks. Traditionally, pathway annotation has been done using gene overlap only, but these methods only get a small part of the whole picture. Placing the gene sets in context of a network provides additional evidence for pathway analysis, revealing a global picture based on the whole genome. PathwAX is a web server based on the BinoX algorithm. A user can input a gene set and get online network crosstalk based pathway annotation. PathwAX uses the FunCoup networks and 280 pre-defined pathways. Most runs take just a few seconds and the results are summarized in an interactive chart the user can manipulate to gain further insights of the gene set's pathway associations. / <p>At the time of the doctoral defense, the following paper was unpublished and had a status as follows: Paper 2: Manuscript.</p>

Mapping of the human genome has been instrumental in understanding diseasescaused by changes in single genes. However, disease mechanisms involvingmultiple genes have proven to be much more elusive. Their complexityemerges from interactions of intracellular molecules and makes them immuneto the traditional reductionist approach. Only by modelling this complexinteraction pattern using networks is it possible to understand the emergentproperties that give rise to diseases.The overarching term used to describe both physical and indirect interactionsinvolved in the same functions is functional association. FunCoup is oneof the most comprehensive networks of functional association. It uses a naïveBayesian approach to integrate high-throughput experimental evidence of intracellularinteractions in humans and multiple model organisms. In the firstupdate, both the coverage and the quality of the interactions, were increasedand a feature for comparing interactions across species was added. The latestupdate involved a complete overhaul of all data sources, including a refinementof the training data and addition of new class and sources of interactionsas well as six new species.Disease-specific changes in genes can be identified using high-throughputgenome-wide studies of patients and healthy individuals. To understand theunderlying mechanisms that produce these changes, they can be mapped tocollections of genes with known functions, such as pathways. BinoX wasdeveloped to map altered genes to pathways using the topology of FunCoup.This approach combined with a new random model for comparison enables BinoXto outperform traditional gene-overlap-based methods and other networkbasedtechniques.Results from high-throughput experiments are challenged by noise and biases,resulting in many false positives. Statistical attempts to correct for thesechallenges have led to a reduction in coverage. Both limitations can be remediedusing prioritisation tools such as MaxLink, which ranks genes using guiltby association in the context of a functional association network. MaxLink’salgorithm was generalised to work with any disease phenotype and its statisticalfoundation was strengthened. MaxLink’s predictions were validatedexperimentally using FRET.The availability of prioritisation tools without an appropriate way to comparethem makes it difficult to select the correct tool for a problem domain.A benchmark to assess performance of prioritisation tools in terms of theirability to generalise to new data was developed. FunCoup was used for prioritisationwhile testing was done using cross-validation of terms derived fromGene Ontology. This resulted in a robust and unbiased benchmark for evaluationof current and future prioritisation tools. Surprisingly, previously superiortools based on global network structure were shown to be inferior to a localnetwork-based tool when performance was analysed on the most relevant partof the output, i.e. the top ranked genes.This thesis demonstrates how a network that models the intricate biologyof the cell can contribute with valuable insights for researchers that study diseaseswith complex genetic origins. The developed tools will help the researchcommunity to understand the underlying causes of such diseases and discovernew treatment targets. The robust way to benchmark such tools will help researchersto select the proper tool for their problem domain. / <p>At the time of the doctoral defense, the following papers were unpublished and had a status as follows: Paper 5: Manuscript. Paper 6: Manuscript.</p>