A família das galectinas compreende um grupo de lectinas cujos domínios de reconhecimento de carboidratos (CRDs) possuem afinidade específica para ß-galactosídeos. Estas se encontram amplamente distribuídas em células normais e neoplásicas de diferentes organismos e estão envolvidas em uma grande diversidade de mecanismos celulares. As galectinas têm sido foco de estudos recentes, principalmente pelo seu envolvimento em processos inflamatórios e neoplásicos, entretanto, muitas perguntas sobre as interações com diferentes carboidratos, a especificidade destas interações e o papel específico das galectinas em inflamação, adesão celular, progressão tumoral e metástase permanecem ainda sem resposta. O presente projeto focou os estudos estruturais dos domínios de reconhecimento de carboidratos (CRDs) da galectina-4 humana (HGal-4). Nosso trabalho envolveu a clonagem, expressão, purificação dos domínios de reconhecimento de carboidratos (CRD-I e CRD-II) de forma independente. O domínio CRD-I da HGal-4 foi cristalizado e sua estrutura determinada por técnicas de cristalografia de raios-X a 2 Å de resolução. A estrutura cristalográfica do domínio CRD-I da galectina-4 humana possue duas folhas- compostas de seis fitas (S1- S6) e cinco fitas (F1-F6) enoveladas na forma de um -sanduiche. Uma comparação estrutural entre membros da classe das galectinas mostra que este enovelamento global dos CRDs é conservado e que e a diferença em especificidade pelos carboidratos observado pelas diferentes galectinas é consequência de mutações pontuais de aminoácidos. Os resultados obtidos no desenvolvimento do presente projeto serão utilizados como uma ferramenta importante para o entendimento de processos celulares que envolvem a galectina-4 humana, como inflamação, progressão celular e metástase, e conseqüentemente, contribuir para o planejamento de novas estratégias de diagnóstico e tratamento de neoplasias. / The galectin family comprises a group of lectins where the carbohydrate-recognition domains (CRDs) display specific affinity for ß-galactosides. They are widely distributed in normal and neoplasic cells of different organisms and are involved in a great diversity of cellular mechanisms. The galectins have been focus of recent studies, mainly for their involvement in inflammatory and neoplasic processes, however, many questions about the interactions with different carbohydrates, the specificity of these interactions and the specific role of the galectins in inflammation, cell adhesion, tumor progression and metastasis remain unanswered.The present project focused the strctural studies of human galectin-4 (HGal-4) carbohydrate-recognition domains (CRDs). Our work involved the independent cloning, heterologous expression and purification of both carbohydrate-recognition domains (CRD-I and CRD-II). The HGal-4 CRD-I domain has been successfully crystallized and its structure solved by X-ray crystallography techniques at 2 Å resolution. The crystallographic structure of HGal-4 CRD-I domain comprises two -sheets containing six (S1- S6) and five strands (F1-F6) each packed as a -sandwich domain. A structural comparison among members of galectin class of proteins shows that this folding is highly conserved and that the difference in specificity for carbohydrate molecules is consequence of punctual aminoacid mutations. Our results will be used as an important tool towards a better understanding of cellular processes such as inflammation, cell progression and metastasis, and consequently, contribute for the development of new strategies for diagnosis and treatment of neoplasies.

A família das galectinas compreende um grupo de lectinas cujos domínios de reconhecimento de carboidratos (CRDs) possuem afinidade específica para ß-galactosídeos. Estas se encontram amplamente distribuídas em células normais e neoplásicas de diferentes organismos e estão envolvidas em uma grande diversidade de mecanismos celulares. As galectinas têm sido foco de estudos recentes, principalmente pelo seu envolvimento em processos inflamatórios e neoplásicos, entretanto, muitas perguntas sobre as interações com diferentes carboidratos, a especificidade destas interações e o papel específico das galectinas em inflamação, adesão celular, progressão tumoral e metástase permanecem ainda sem resposta. O presente projeto focou os estudos estruturais dos domínios de reconhecimento de carboidratos (CRDs) da galectina-4 humana (HGal-4). Nosso trabalho envolveu a clonagem, expressão, purificação dos domínios de reconhecimento de carboidratos (CRD-I e CRD-II) de forma independente. O domínio CRD-I da HGal-4 foi cristalizado e sua estrutura determinada por técnicas de cristalografia de raios-X a 2 Å de resolução. A estrutura cristalográfica do domínio CRD-I da galectina-4 humana possue duas folhas- compostas de seis fitas (S1- S6) e cinco fitas (F1-F6) enoveladas na forma de um -sanduiche. Uma comparação estrutural entre membros da classe das galectinas mostra que este enovelamento global dos CRDs é conservado e que e a diferença em especificidade pelos carboidratos observado pelas diferentes galectinas é consequência de mutações pontuais de aminoácidos. Os resultados obtidos no desenvolvimento do presente projeto serão utilizados como uma ferramenta importante para o entendimento de processos celulares que envolvem a galectina-4 humana, como inflamação, progressão celular e metástase, e conseqüentemente, contribuir para o planejamento de novas estratégias de diagnóstico e tratamento de neoplasias. / The galectin family comprises a group of lectins where the carbohydrate-recognition domains (CRDs) display specific affinity for ß-galactosides. They are widely distributed in normal and neoplasic cells of different organisms and are involved in a great diversity of cellular mechanisms. The galectins have been focus of recent studies, mainly for their involvement in inflammatory and neoplasic processes, however, many questions about the interactions with different carbohydrates, the specificity of these interactions and the specific role of the galectins in inflammation, cell adhesion, tumor progression and metastasis remain unanswered.The present project focused the strctural studies of human galectin-4 (HGal-4) carbohydrate-recognition domains (CRDs). Our work involved the independent cloning, heterologous expression and purification of both carbohydrate-recognition domains (CRD-I and CRD-II). The HGal-4 CRD-I domain has been successfully crystallized and its structure solved by X-ray crystallography techniques at 2 Å resolution. The crystallographic structure of HGal-4 CRD-I domain comprises two -sheets containing six (S1- S6) and five strands (F1-F6) each packed as a -sandwich domain. A structural comparison among members of galectin class of proteins shows that this folding is highly conserved and that the difference in specificity for carbohydrate molecules is consequence of punctual aminoacid mutations. Our results will be used as an important tool towards a better understanding of cellular processes such as inflammation, cell progression and metastasis, and consequently, contribute for the development of new strategies for diagnosis and treatment of neoplasies.

Piptadenia stipulacea belongs to the Fabaceae family,and is widely distributed in the caatinga. This species is commonly known in the Brazilian Northeast as jurema-branca , carcará and rasga-beiço , and is used in folk medicine in inflammation.In this study, we attempted to identify the possible antinociceptive and anti-inflammatory activities of the aqueous phase, the ethyl acetate phase and one flavonoid obtained from aerial parts of Piptadenia stipulacea. Aerial parts of Piptadenia stipulaceawere used and after fractionation, the flavonoid Galetin 3,6-dimethyl ether(FGAL) was obtained of the chloroformic phase of this plant. Experiments were conducted on Swiss mice using the acetic acid-induced writhing test, the hot plate test, the formalin test and zymosan A-induced peritonitis test. To characterize the mechanism(s) responsible for these antinociceptive and anti-inflammatory actions of FGAL, COX inhibitor screening assay kit and test of DPPH was used. The aqueous and ethyl acetate phases (100 mg/kg, p.o.); and the flavonoid FGAL (100 μmol/kg, p.o. or i.p.), reduced the nociception produced by acetic acid, by 49,9 ± 11,2, 54,6 ± 5,3, 39,0 ± 6,8 and64,8% ± 8,1, respectively. As FGAL have greater antinociceptive activity when administered intraperitoneally compared to oral route, we chose this route you follow up the study with FGAL. The ethyl acetate phase (100 mg/kg, p.o.) reduced nociception in the hot plate, indicating that this fraction exhibited central activity. The ethyl acetate phase (100 mg/kg, p.o.) reduced the formalin effects in both phases by 40,2± 10,3 and59,9% ± 6,5, respectively. Treatment with the aqueous phase (100 mg/kg, p.o.) and FGAL (100_mol/kg, i.p.) only protected the second phase by 78,5± 5,5 and 64,0% ± 8,0, respectively. In addition, it was observed in the zymosan A-induced peritonitis test that the aqueous phase, the ethyl acetate phase and FGAL exhibited anti-inflammatory activity, reducing significantly the number of recruit cells by 35,8 ± 4,9, 37,7 ± 6,2 and 31,3% ± 13,3, respectively. Moreover, FGAL at 0,2μM was able to inhibit COX-1 (79,5% ± 0,6) and COX-2 (56,0% ± 3,8), with an inhibition profile similar to indomethacin in the same concentration (93.0 ±2.6and79.0±1.5%, respectively), showinginhibitionofCOX-1 in greaterproportionthanCOX-2. Furthermore, indomethacin was more effective, both COX-1 andCOX-2 when compared to FGAL. In the test of DPPH, FGAL showed high radical scavenging activity. These results infer that the aqueous phase, the ethyl acetate phase and FGAL obtained from aerial parts of Piptadeniastipulacea are able to modulate the peripheral nociception and acute inflammatory response. TheflavonoidFGALinhibitCOX-1 andCOX-2, probably for its ability to scavenge free radicals, this being one of its mechanism of action in nociception and inflammation. Moreover, the results corroborate the popular use of Piptadenia stipulacea by their anti-inflammatory property. / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Piptadenia stipulacea,pertence à família Fabaceae, é amplamente distribuída na caatinga. Esta espécie é conhecida no Nordeste brasileiro como jurema-branca, carcará e rasga-beiço, sendo utilizada na medicina popular para tratar inflamação. Neste trabalho, buscou-se investigar a atividade antinociceptiva e anti-inflamatória da fase aquosa, fase acetato de etila e de um flavonoide isolado das partes aéreas de Piptadenia stipulacea. As partes aéreas de Piptadenia stipulacea foram usadas para o fracionamento e, posteriormente o flavonóide galetina 3,6-dimetil éter(FGAL)foi obtido da fase clorofórmica da planta. Experimentos foram realizados em camundongos Swiss usando o modelo de contorções abdominais induzidas por ácido acético, ensaio da placa quente, teste de formalina e peritonite induzida por zymosan A. Para caracterizar o mecanismo de ação de FGAL responsável por sua ação antinociceptiva, o ensaio de inibição de cicloxigenase (COX) in vitro e a análise da atividade sequestrante radicalar através do método fotocolorimétrico de consumo de 2,2-difenil-1-picrihidrazila(DPPH) foram utilizados. As fases aquosa e acetato de etila(100 mg/kg, v.o.); e o flavonoide FGAL (100 μmol/kg, v.o. ou i.p.) reduziram a nocicepção produzida por ácido acético, na proporção de 49,9 ± 11,2, 54,6 ± 5,3, 39,0 ± 6,8 e 64,8% ± 8,1, respectivamente.Por FGAL apresentar maior atividade antinociceptiva ao ser administrado pela via intraperitoneal quando comparado com a via oral, escolheu-se essa via para dar sequência ao estudo com FGAL. Posteriormente, verificou-se também a inibição da nocicepção no ensaio de placa quente através do tratamento com a fase acetato de etila (v.o., 100 mg/kg), indicando que esta fase apresenta atividade central. A fase acetato de etila (v.o., 100 mg/kg) reduziu a nocicepção gerada pela aplicação de formalina em ambas as fases do teste, apresentando porcentagem de inibição de 40,2 ± 10,3e 59,9% ± 6,5, respectivamente. O tratamento com a fase aquosa (100 mg/kg, v.o.) e FGAL (100 μmol/kg, i.p.) apenas se mostraram ativos na segunda fase do teste de formalina na proporção de 72,6± 5,5 e 66,0% ± 8,0, respectivamente. Além disso, as fases aquosa (100 mg/kg, v.o.), acetato deetila (100 mg/kg, v.o.) e FGAL (100 μmol/kg, i.p.) tambémapresentaram efeito anti-inflamatório significante quando comparadas ao grupo controle, apresentando porcentagem de inibição de recrutamento celular na peritonite induzida por zymosan A de 35,8 ± 4,9, 37,7 ± 6,2 e 31,3% ± 13,3, respectivamente.FGAL, na concentração de 0,2 μM inibiu COX-1 (79,5% ± 0,6) e COX-2 (56,0% ± 3,8), com um perfil de inibição similar ao observado para indometacina na mesma concentração (93,0 ± 2,6 e 79,0% ± 1,5, respectivamente), apresentando inibição de COX-1 em maior proporção do que COX-2. Além disso, indometacina inibiu de forma mais eficaz, tanto COX-1 como COX-2 quando comparado a FGAL. No teste de2,2-difenil-1-picriidrazila(DPPH), FGAL, na concentração de 0,3 mM, mostrou alta atividade sequestrante radicalar. Estes resultados inferem que a fase aquosa, a fase acetato e FGAL obtidos das partes aéreas de Piptadenia stipulacea são capazes de modular a antinocicepção e a resposta inflamatória aguda.O flavonoide FGAL inibe COX-1 e COX-2, provavelmente por sua capacidade de sequestrar radicais livres, sendo este um dos seus mecanismos de ação na nocicepção e inflamação. Além disso, os resultados encontrados corroboram com o uso popular de Piptadenia stipulacea por suas propriedade anti-inflamatória.