Eine erhöhte Konzentration von Homocystein im Plasma (Hyperhomocysteinämie) gilt als unabhängiger Risikoindikator für neuronale und kardiovaskuläre Erkrankungen. Der Präcursor des Homocysteins, Methionin, ist eine essentielle Aminosäure, die bei Fehlernährung übermäßig verzehrt werden kann. Es wurde untersucht, ob tatsächlich durch langfristigen erhöhten Methioninverzehr via Erhöhung des Homocysteinspiegels im Plasma ein reales Gesundheitsrisiko besteht. Als Modell wurde eine Füttterungsstudie an Ratten gewählt, deren Bedingungen bezüglich Fütterungsdauer und Methioningehalt der Diät (0,4 % Methionin für 4 Wochen) an eine mögliche Fehlernährung des Menschen angepasst waren. Bei diesen Ratten war die Plasmahomocystein-Konzentration ca. 2-fach höher, als bei Ratten, die im gleichen Zeitraum eine "normale" Diät mit einem 3-4 fach niedrigeren Methioningehalt bekamen. Neben der Auswirkung der Diät auf den Homocystein-Stoffwechsel wurde geprüft, welche der in der Literatur dargestellten potentiellen Pathomechanismen für Hyperhomocysteinämie-induzierte Schäden Anwendung in diesem Modell finden. Obwohl die Konzentration von Homocystein im Plasma verändert war, wurde keine Beeinträchtigung der Gefäßfunktion gefunden. Auch die Plasmakonzentration von asymmetrischem Dimethylarginin, einem weiteren Risikoindikator für Herz-Kreislauf-Erkrankungen blieb unverändert, obwohl dieser Parameter bei Hyperhomocysteinämie oftmals erhöht ist. Eine Konzentrationsverdoppelung von Homocystein durch erhöhte alimentäre Methioninzufuhr ohne gleichzeitige Erhöhung von ADMA scheint also keine Verschlechterung der Gefäßfunktion bei Ratten zu bewirken. In diesem Punkt kann man von in anderen Modellen der Hyperhomocysteinämie gefundenen Resultaten keine Rückschlüsse auf die durch alimentäres Methionin verursachte Hyperhomocysteinämie ziehen. Andere Modelle zur Induktion einer Hyperhomocysteinämie ist Homocyst(e)in-Fütterung. In weiteren Rattenstudien wurden Effekte homocystin- und methioninreiche Diät verglichen. In diesen Studien zeigte sich, dass bei ähnlichen applizierten Dosen (tägliche Aufnahme ca. 1,0 bzw. 1,4 g/kg Körpergewicht) methionin- und homocystinreiche Diät bei Ratten zu vergleichbaren Plasma-Homocysteinspiegeln führen (methioninreich: 27,32 ± 2,80 µmol/l; homocystinreich: 40,61 ± 2,22 µmol/l). Als Vergleichsparameter zur Beurteilung pathophysiologischer Veränderungen diente zum einen der Gewebsgehalt an Homocystein, zum anderen wurden die intrazellulären Konzentrationen von S-Adenosyl-Methionin (SAM) und S-Adenosyl-Homocystein (SAH) betrachtet. Es zeigten sich besonders in Leber und Niere signifikante Unterschiede zwischen einer methioninreichen und einer homocystinreichen Diät bei Ratten. Dies ist eine mögliche Erklärung dafür, dass die bei vierwöchiger methioninreicher Diät gefundenen Ergebnisse nicht mit Literaturdaten übereinstimmen. Abschließend wurde der Frage nachgegangen, ob eine homocytinreiche Ernährung, wie in der vorherigen Studie angewandt, überhaupt möglich ist. Da zwar die Gehalte von Methionin in fast allen Lebensmitteln bekannt sind, nicht aber die von Homocystein, wurde untersucht, in welchen Konzentrationen Homocystein in Lebensmitteln enthalten ist. In Schwarzbier (0,03 mg/l), Weißbrot (0,95 mg/kg), Roquefort-Käse (0,50 mg/kg), Thunfisch (0,25 mg/kg) und Schweineleber (0,31 mg/kg) konnte Homocystein bestimmt werden. Da die Homocysteinkonzentrationen in diesen Beispiellebensmitteln mindestens um den Faktor 105 geringer waren als die Methioninkonzentrationen ist ein Einfluss von alimentärem Homocystein auf den Plasmaspiegel sehr unwahrscheinlich. Es wurde weiterhin geprüft, ob durch Darmbakterien ein Teil des alimentär aufgenommenen Methionins bereits im Dünndarm in Homocyt(e)in umgewandelt werden könnte. Dabei wurde eine vermehrte Homocysteinproduktion nach Methionin-Zugabe zu Dünndarmisolaten gefunden. Quantitativ kommt dieser Homocysteinquelle eine untergeordnete Bedeutung zu.

Eine erhöhte Konzentration von Homocystein im Plasma (Hyperhomocysteinämie) gilt als unabhängiger Risikoindikator für neuronale und kardiovaskuläre Erkrankungen. Der Präcursor des Homocysteins, Methionin, ist eine essentielle Aminosäure, die bei Fehlernährung übermäßig verzehrt werden kann. Es wurde untersucht, ob tatsächlich durch langfristigen erhöhten Methioninverzehr via Erhöhung des Homocysteinspiegels im Plasma ein reales Gesundheitsrisiko besteht. Als Modell wurde eine Füttterungsstudie an Ratten gewählt, deren Bedingungen bezüglich Fütterungsdauer und Methioningehalt der Diät (0,4 % Methionin für 4 Wochen) an eine mögliche Fehlernährung des Menschen angepasst waren. Bei diesen Ratten war die Plasmahomocystein-Konzentration ca. 2-fach höher, als bei Ratten, die im gleichen Zeitraum eine "normale" Diät mit einem 3-4 fach niedrigeren Methioningehalt bekamen. Neben der Auswirkung der Diät auf den Homocystein-Stoffwechsel wurde geprüft, welche der in der Literatur dargestellten potentiellen Pathomechanismen für Hyperhomocysteinämie-induzierte Schäden Anwendung in diesem Modell finden. Obwohl die Konzentration von Homocystein im Plasma verändert war, wurde keine Beeinträchtigung der Gefäßfunktion gefunden. Auch die Plasmakonzentration von asymmetrischem Dimethylarginin, einem weiteren Risikoindikator für Herz-Kreislauf-Erkrankungen blieb unverändert, obwohl dieser Parameter bei Hyperhomocysteinämie oftmals erhöht ist. Eine Konzentrationsverdoppelung von Homocystein durch erhöhte alimentäre Methioninzufuhr ohne gleichzeitige Erhöhung von ADMA scheint also keine Verschlechterung der Gefäßfunktion bei Ratten zu bewirken. In diesem Punkt kann man von in anderen Modellen der Hyperhomocysteinämie gefundenen Resultaten keine Rückschlüsse auf die durch alimentäres Methionin verursachte Hyperhomocysteinämie ziehen. Andere Modelle zur Induktion einer Hyperhomocysteinämie ist Homocyst(e)in-Fütterung. In weiteren Rattenstudien wurden Effekte homocystin- und methioninreiche Diät verglichen. In diesen Studien zeigte sich, dass bei ähnlichen applizierten Dosen (tägliche Aufnahme ca. 1,0 bzw. 1,4 g/kg Körpergewicht) methionin- und homocystinreiche Diät bei Ratten zu vergleichbaren Plasma-Homocysteinspiegeln führen (methioninreich: 27,32 ± 2,80 µmol/l; homocystinreich: 40,61 ± 2,22 µmol/l). Als Vergleichsparameter zur Beurteilung pathophysiologischer Veränderungen diente zum einen der Gewebsgehalt an Homocystein, zum anderen wurden die intrazellulären Konzentrationen von S-Adenosyl-Methionin (SAM) und S-Adenosyl-Homocystein (SAH) betrachtet. Es zeigten sich besonders in Leber und Niere signifikante Unterschiede zwischen einer methioninreichen und einer homocystinreichen Diät bei Ratten. Dies ist eine mögliche Erklärung dafür, dass die bei vierwöchiger methioninreicher Diät gefundenen Ergebnisse nicht mit Literaturdaten übereinstimmen. Abschließend wurde der Frage nachgegangen, ob eine homocytinreiche Ernährung, wie in der vorherigen Studie angewandt, überhaupt möglich ist. Da zwar die Gehalte von Methionin in fast allen Lebensmitteln bekannt sind, nicht aber die von Homocystein, wurde untersucht, in welchen Konzentrationen Homocystein in Lebensmitteln enthalten ist. In Schwarzbier (0,03 mg/l), Weißbrot (0,95 mg/kg), Roquefort-Käse (0,50 mg/kg), Thunfisch (0,25 mg/kg) und Schweineleber (0,31 mg/kg) konnte Homocystein bestimmt werden. Da die Homocysteinkonzentrationen in diesen Beispiellebensmitteln mindestens um den Faktor 105 geringer waren als die Methioninkonzentrationen ist ein Einfluss von alimentärem Homocystein auf den Plasmaspiegel sehr unwahrscheinlich. Es wurde weiterhin geprüft, ob durch Darmbakterien ein Teil des alimentär aufgenommenen Methionins bereits im Dünndarm in Homocyt(e)in umgewandelt werden könnte. Dabei wurde eine vermehrte Homocysteinproduktion nach Methionin-Zugabe zu Dünndarmisolaten gefunden. Quantitativ kommt dieser Homocysteinquelle eine untergeordnete Bedeutung zu.

Kardiovaskuläre Erkrankungen bilden weltweit die häufigste Todesursache. Neben vielfach untersuchten verhaltensabhängigen und verhaltensunabhängigen Risikofaktoren gilt insbesondere das ‚Rauchen‘ als maßgeblicher, beeinflussbarer Risikofaktor. Rauchen fördert die Entwicklung von atherosklerotischen Gefäßläsionen und Plaques im Sinne einer Atherosklerose sowie die damit assoziierte Entwicklung einer endothelialen Dysfunktion und Induktion von proinflammatorischen Prozessen. Im Rahmen der Promotionsarbeit wurden an humanen Gefäßbiopsien der A. thoracica interna die Wirkungen von Zigarettenrauch auf die arterielle Gefäßfunktion sowie molekularbiologische und histologische Parameter untersucht. Des Weiteren wurden mithilfe von ex vivo Stimulationsversuchen die pathologischen Wirkungen von konventionellen Zigaretten mit den Wirkungen des Heat-not-Burn Tabakprodukts (HnB-TP) IQOS verglichen. Die Forschungshypothesen lauten, dass Raucher (R) im Vergleich zu Nichtrauchern (NR) eine eingeschränkte Gefäßfunktion, eine erhöhte Expression von antioxidativen Stoffwechselwegen sowie proinflammatorischen Signalmolekülen und vermehrte atherosklerotische Gefäßveränderungen aufweisen. Bei der Gegenüberstellung des alternativen Heat-not Burn Tabakproduktes mit konventionellen Zigaretten wurde eine verminderte, jedoch weiterhin nachweisbare pathogene Wirkung von alternativen Produkten auf die Gefäßfunktion und Genexpression erwartet. Die Untersuchung der arteriellen Gefäßfunktion von Segmenten der A. thoracica interna männlicher KHK-Patienten im Alter zwischen 60 und 75 Jahren am Mulvany-Myograph beinhaltete die Bestimmung der Kalium- und Noradrenalin-abhängigen Kontraktionsfähigkeit, sowie die Untersuchung der Acetylcholin- und Natrium-Nitroprussid-abhängigen Relaxationsfähigkeit. Für den Vergleich des Einflusses von konventionellen Zigaretten und dem alternativen Tabakprodukt IQOS erfolgte, der Gefäßfunktionsmessung vorangehend, die Lagerung der Gefäßsegmente in wässrigen Rauchextrakten (AqE) der Referenzzigarette 3R4F und dem AqE des HnB-TP IQOS für 90 Minuten in nikotinäquivalenten Konzentrationen. Zur Untersuchung der mRNA-Expression von ausgewählten Zielgenen wurden qPCR Analysen des Arteriengewebes durchgeführt. Der Einfluss von Rauchen auf die Gefäßstruktur der A. thoracica interna wurde histologisch untersucht und CD 45+ Färbungen zur Untersuchung der Adhäsion von Leukozyten am Gefäßendothel angefertigt. In der Analyse der Patientendaten hatten R im Vergleich zu NR zum Zeitpunkt der Bypass OP ein signifikant jüngeres Alter. Aufgrund der multifaktoriellen Genese der koronaren Herzerkrankung (KHK) zeigten verschiedenen Kohorten eine Erhöhung des HbA1c-Wertes, sowie eine altersbedingte Reduktion den glomerulären Filtrationsrate (GFR). Der Einfluss des Zigarettenkonsums auf arterielle Gefäße konnte durch eine eingeschränkte Kontraktionsfähigkeit der A. thoracica interna sowie eine eingeschränkte endothel-unabhängige Relaxationskapazität der Gefäßproben von R bestätigt werden. Der Vergleich der ACh-induzierten, endothelabhängigen Relaxation zeigte keine signifikanten Unterschiede zwischen R und NR. Als Ursachen der eingeschränkten Kontraktions- und endothelunabhängigen Relaxationsfähigkeit bei R wurden zytotoxische Effekte von Komponenten des Zigarettenrauchs auf die glatten Muskelzellen der Gefäßwand, eine Degradation des dilatativ wirkenden NO durch einen Anstieg der Radikalkonzentration im Gewebe, sowie eine Beeinträchtigung der Adrenozeptor Expression und Funktion diskutiert. Die mRNA-Expression des α1b Adrenozeptors war bei R im Vergleich zu NR signifikant reduziert. Einen Hinweis auf die Induktion von inflammatorischen Prozessen durch das Rauchen bietet eine signifikant erhöhte ICAM 1 mRNA-Expression bei R. Direkte Effekte des Zigarettenkonsums auf die Funktion und die mikroskopische Struktur des Endothels der A. thoracica interna wurden hingegen nicht beobachtet. In den Stimulationsversuchen mit dem AqE der Referenzzigarette 3R4F konnten die Ergebnisse der Raucherkohorte bei den nicht-stimulierten Versuchen repliziert und damit die Methodik der AqE-Stimulationen validiert werden. Dementsprechend zeigte sich nach der 3R4F-Stimulation eine reduzierte arterielle Kontraktionsfähigkeit und eine signifikant reduzierte endothelunabhängige Maximalrelaxation. Eine vermehrte Freisetzung der proinflammatorischen Zytokine IL-1ß und IFN-γ weist auf die Induktion von inflammatorischen Prozessen durch 3R4F hin. Im Vergleich zur Stimulation mit der Referenzzigarette konnte bei der Stimulation mit dem AqE des HnB TP IQOS keine relevante Veränderung der Gefäßfunktion in der A. thoracica interna beobachtet werden. Hinweisend auf eine Beeinflussung des Gefäßsystems auch durch alternative Tabakprodukte ist eine signifikant erhöhte IL-1ß Freisetzung nach der Stimulation mit IQOS. Zusammenfassend können die Ergebnisse dieser Arbeit die pathologischen Auswirkungen von Rauchen auf einige Aspekte des arteriellen Gefäßsystems aufzeigen und das methodische Vorgehen zur experimentellen Untersuchung von Wirkungen des Rauchens unter der Verwendung von flüssigen Rauchextrakten verifizieren. Die Ergebnisse der Stimulationsversuche bilden zudem einen Beitrag zur Einordnung der kardiovaskulären Beeinträchtigungen von alternativen Tabakprodukten. Im Vergleich zwischen dem konventionellen und dem alternativen HnB-TP IQOS wird ein verringerter pathologischer Einfluss des neuartigen Tabakproduktes auf die Gefäßfunktion sowie molekularbiologische Parameter deutlich. Dennoch kommt anhand der Studienergebnisse eine Aktivierung von proinflammatorischen Prozessen auch durch HnB-TP in Frage. Um in Zukunft eine umfassende Einschätzung zu den gesundheitlichen Einflüssen von HnB TP geben zu können, sind jedoch weitere Studien zur Untersuchung aller beeinträchtigten Organsysteme und insbesondere die Analyse von langzeitigen Auswirkungen der neuartigen Tabakprodukte unumgänglich.:I. Abbildungsverzeichnis I II. Tabellenverzeichnis III III. Abkürzungsverzeichnis IV 1 Einleitung 1 1.1 Gefäßaufbau 1 1.2 Arteria thoracica interna und aortokoronarer Bypass 2 1.3 Atherosklerose und endotheliale Dysfunktion 3 1.4 Risikofaktoren der Atherosklerose 11 1.5 Der kardiovaskuläre Risikofaktor ‚Rauchen‘ 13 1.5.1 Zusammensetzung von Zigarettenrauch 13 1.5.2 Biologische Wirkungen des Zigarettenrauches im Gefäßsystem 14 1.5.3 Einfluss von Rauchen auf die Gefäßfunktion 16 1.5.4 Alternative Tabakprodukte 17 2 Zielsetzung und Hypothesen 21 3 Material und Methoden 22 3.1 Materialien und Chemikalien 22 3.1.1 Kitsysteme 22 3.1.2 Enzyme und Inhibitoren 23 3.1.3 Geräte 24 3.1.4 Zusammensetzung der Lösungen und Puffer 25 3.1.5 Wässriger Rauchextrakt 27 3.2 Studienkohorten 29 3.3 Transport und Präparation der Arteria thoracica interna 30 3.4 Gefäßfunktionsmessung 31 3.4.1 Chemikalien und Pufferlösungen 31 3.4.2 Stimulation der Gefäßringe mittels wässriger Rauchextrakte 32 3.4.3 Aufbau der Messkammer am Mulvany-Myograph 32 3.4.4 Protokoll der Gefäßfunktionsmessung 33 3.4.5 Auswertung der Gefäßfunktionsdaten 37 3.5 Molekularbiologische Analysen 38 3.5.1 Genexpressionsanalyse 38 3.5.2 Multiplex Cytokine Assay 42 3.6 Histologie 42 3.6.1 Vorbereitung der Proben 42 3.6.2 Elastika – van Gieson Färbung und Intima-Thickness Index 43 3.6.3 Immunhistochemische CD45+-Färbung 45 3.7 Funktionelle Assays 48 3.7.1 Amplex® Red Hydrogen Peroxide Assay 48 3.7.2 NO-Messung 49 3.8 Statistik 50 4 Ergebnisse 51 4.1 Vergleich zwischen Rauchern und Nichtrauchern 51 4.1.1 Gefäßfunktionsmessung 51 4.1.2 Molekularbiologische Analysen bei Nichtrauchern, Rauchern und Exrauchern 59 4.1.3 Histologische Analysen 69 4.2 Stimulation mittels AqE 74 4.2.1 Beschreibung der Studienkohorten 74 4.2.2 Ergebnisse der Gefäßfunktionsmessung nach Stimulation mit 3R4F und IQOS 76 4.2.3 Genexpression nach Stimulation 94 4.2.4 Zytokinfreisetzung nach Stimulation 97 4.2.5 Funktionelle Assays 100 5 Diskussion 102 5.1 Einfluss von Zigarettenkonsum auf A. thoracica interna 102 5.1.1 Studiengruppen-spezifische Unterschiede zwischen Nichtrauchern, Rauchern und Exrauchern 102 5.1.2 Einfluss von Rauchen auf die ex vivo Gefäßfunktion 103 5.1.3 Einfluss von Rauchen auf die Genexpression und die leukozytäre Adhäsion 108 5.1.4 Einfluss von Rauchen auf die Tunica Intima 110 5.2 Ergebnisse der Stimulation mit wässrigen Rauchextrakten 112 5.2.1 Wirkungen von 3R4F und IQOS auf die Gefäßkontraktilität und die mRNA-Expression 112 5.2.2 Wirkungen von 3R4F und IQOS auf die Gefäßrelaxation 115 5.2.3 Vergleich der Nikotinäquivalenzkonzentrationen zwischen 3R4F und IQOS 116 6 Limitationen 119 7 Zusammenfassung 121 8 Summary 123 9 Literaturverzeichnis 125 Anhang i Publikationen und Abstracts v Danksagung vi