Die NO-sensitive Guanylyl-Cyclase (NO-GC) ist der wichtigste Rezeptor für das freigesetzte Signalmolekül NO und katalysiert die Bildung des second Messenger cGMP. Die NO/cGMP Signalkaskade ist im kardiovaskulären System essentiell für die Hemmung der Thrombozytenaggregation und des Tonus der glatten Gefäßmuskulatur und trägt damit zur Regulation des Blutdrucks bei. In der Arbeitsgruppe wurden Mauslinien generiert, bei denen die NO-GC ubiquitär (GCKO) oder spezifisch in glatten Muskelzellen (SM-GCKO) ausgeschaltet ist. Beide Mausstämme zeigen eine arterielle Hypertonie mit einem Anstieg des systolischen Blutdrucks um 30 mmHg im Vergleich zu den jeweiligen Kontrolltieren. Neben cGMP ist auch cAMP als weiterer second messenger in einer Reihe von Regulationsprozessen im kardiovaskulären System involviert. Die Intensität und Dauer eines cAMP-Signals wird zum einen durch seine Synthese durch die Adenylyl-Cyclasen, zum anderen durch seine Hydrolyse durch die Phosphodiesterasen (PDE) bestimmt. Dabei spielt die PDE3 als cGMP-inhibierte, cAMP-abbauende PDE eine wichtige Rolle im sogenannten cGMP/cAMP-Crosstalk. Ein wichtiges Instrument zur Untersuchung PDE3-abhängiger Prozesse ist der spezifische Hemmstoff Milrinon. Innerhalb dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass die PDE3-Expression abhängig ist von der Expression des cGMP-produzierenden Enzyms NO-GC: So zeigte sich in Thrombozyten wie auch in glatten Gefäßmuskelzellen nach Deletion der NO-GC im Vergleich zu den Kontrolltieren eine Reduktion der PDE3 um die Hälfte. Diese Reduktion der PDE3-Expression war sowohl in den glatten Muskelzellen von GCKO wie auch von SM-GCKO-Mäusen zu finden. Weiterhin konnte dargestellt werden, dass die Down-Regulation der PDE3 in glatter Gefäßmuskulatur in SM-GCKO-Mäusen parallel zur Reduktion der NO-GC und nicht parallel zum daraus resultierenden Anstieg des Blutdrucks verläuft. Die Reduktion der PDE3-Expression ging mit einer Verminderung der Aktivität in den Thrombozyten und glatten Muskelzellen des GCKOs einher. In Herzmuskelgewebe dagegen änderten sich Expression und Aktivität der PDE3 nicht. Der spezifische PDE3-Hemmstoff Milrinon führte zu einem weiteren Anstieg des systolischen Blutdrucks in den KO-Linien, nicht aber in Kontrolltieren. Zusammenfassend spielt die PDE3 eine wichtige Rolle im cGMP/cAMP-Crosstalk sowohl in Thrombozyten als auch in glatten Gefäßmuskelzellen von Mäusen. / Role of PDE3 on cGMP/cAMP crosstalk in mice deficient in NO-sensitive guanylyl cyclase

Doctor en Ciencias de la Ingeniería, Mención Ingeniería Química y Biotecnología / El alcoholismo es un grave problema socio-económico. El costo asociado al abuso del alcohol se ha estimado en 1.300 millones de dólares para la economía chilena y en 185 billones para Estados Unidos, costo que se debe principalmente a la perdida de la productividad, tratamientos médicos y costos sociales. El etanol es metabolizado en el hígado en dos pasos. El primero depende de la enzima Alcohol deshidrogenasa (ADH) y el segundo de la enzima Aldehído deshidrogenasa (ALDH2). En individuos de la población asiática existe una alta prevalencia de una mutación en el gen de la ALDH2, por lo que tienen una capacidad reducida para metabolizar el acetaldehído, produciendo fuertes efectos como mareos, hipotensión, palpitaciones, etc. Esto resulta en un rechazo al consumo de etanol y protección frente al alcoholismo. Este fenómeno sugiere que la modulación de la expresión de la ALDH2 mediante tecnologías genéticas puede resultar en un fenotipo similar. Por lo tanto, la terapia génica se presenta como una alternativa atractiva para el tratamiento del alcoholismo, simulando el fenotipo asiático, mediante la inhibición específica de la enzima ALDH2, utilizando vectores virales codificantes de un shRNA como herramienta silenciadora. Los virus adeno-asociados (AAV) han sido utilizados como poderosas herramientas para la transferencia de genes en estudios in vivo, en modelos animales y en ensayos clínicos en humanos, con resultados prometedores. La única terapia génica aprobada en el mundo occidental para comercialización es Glybera y está formulada con vectores AAV. En este trabajo se utilizaron vectores scAAV2 que codifican un ALDH2 shRNA, para silenciar la expresión del gen de ALDH2 en líneas celulares humanas. Las líneas celulares HEK-293 y HepG2 se infectaron con el virus scAAV2/shRNA resultando en una reducción de la expresión de ALDH2 a nivel de RNA y proteínas en las dos concentraciones virales probadas (1x104 y 1x105 vg/cel) cada una probada en dos periodos de tiempos. En ambas líneas celulares los niveles de RNA de ALDH2 se redujeron en un 90% y la expresión a nivel proteico se inhibió en un 90% y 52% respectivamente, cinco días después de la infección. Las células HepG2 VL17A (ADH+) tratadas y expuestas a etanol mostraron un aumento de hasta el 50% en los niveles de acetaldehído. Estos resultados sugieren que la terapia génica puede ser una herramienta útil para el tratamiento del alcoholismo, a través del silenciamiento de la expresión de ALDH2 utilizando tecnología shRNA entregada las células por vectores AAV.

Aachen, Techn. Hochsch., Diss., 2007.

Köln, University, Diss., 2005.

Ulm, Univ., Diss., 2007.

Zugl.: Berlin, Humboldt-Univ., Diss., 2008

Ulm, Univ., Diss., 2002.

Stuttgart, Univ., Diss., 2002.

Ulm, Univ. Diss., 2006.

Thesis (doctoral)--Swedish University of Agricultural Sciences, 2000. / Includes bibliographical references.