Humboldt-Universiẗat, Diss.--Berlin, 2007.

Techn. University, Habil.-Schr., 2006--München.

München, Techn. Univ., Diss., 2004.

München, Techn. Univ., Diss., 2004.

University, Diss., 2004--Köln.

Zugl.: Hannover, Universiẗat, Diss., 2008.

Infektionen mit dem intestinalen Parasiten Giardia duodenalis, verursachen weltweit eine der häufigsten humanen Parasitosen. Bislang konnten keine eindeutigen Virulenz- oder Pathogenitätsmarker des Erregers beschrieben werden. Es wird allerdings vermutet, dass potentielle G. duodenalis Virulenzfaktoren Enzyme sind, die während des Kontaktes des Erregers mit den Dünndarmepithelzellen sezerniert werden. Eines dieser Enzyme ist die Arginin Deiminase (ADI), die Arginin zu Citrullin umwandelt. Ziel dieser Arbeit war es Merkmale zu identifizieren, die für die ADI als Virulenzfaktor sprechen. Dazu wurde das Enzym zunächst hinsichtlich seiner Bedeutung für die Wirt-Pathogen-Interaktion untersucht. Die mit rekombinanter, katalytisch aktiver ADI (Assemblage A) behandelten LPS-stimulierten humanen moDC zeigten eine Veränderung in ihrem Phänotyp als auch in ihrer Cytokinsekretion. Diese ließ sich auf die durch das Enzym hervorgerufene Arginindepletion und/oder auf die Bildung der Metabolite, Citrullin und NH4+, zurückführen. Weiterhin konnte gezeigt werden, dass Parasitenisolate verschiedener G. duodenalis Assemblage A-Subtypen, vermutlich durch die katalytische Aktivität der ADI, die Stickstoffmonoxid-Bildung einer intestinalen Epithelzelllinie inhibiert. Neben dem Einfluss auf die Wirtsimmunantwort wurde auch die Variabilität in der kodierenden Sequenz des Enzyms in verschiedenen Parasitenisolaten analysiert. Anschließend erfolgte die funktionelle Charakterisierung des nativen (verschiedene Assemblage A-Subtypen) als auch des rekombinant aufgereinigten Enzyms (Assemblage A, B und E). Dabei zeigten sich Unterschiede in der Substrataffinität der ADI für Arginin, sowohl zwischen unterschiedlichen Assemblage A-Subtypen als auch unterschiedlichen Assemblage-Klassen. Zusammenfassend wurde gezeigt, dass die G. duodenalis ADI immunmodulatorische Effekte hat und das vermutlich eine Korrelation zwischen der Variation in der Primärstruktur und der Funktion des Enzyms besteht. / Giardia duodenalis (G. duodenalis) is an intestinal protozoan parasite that causes giardiasis, one of the most prevalent parasitic diseases worldwide. So far, little is known concerning host-parasite interaction, in particular what determines the parasite’s pathogenicity. Several potential virulence factors, among them the arginine deiminase (ADI) that hydrolyzes arginine into citrulline and NH4+, are discussed. The ADI was identified to be released upon contact with intestinal epithelium by Giardia trophozoites and was recognized as an immunoreactive protein during acute human giardiasis. Aim of the study was to identify hints for G. duodenalis ADI to be a virulence factor. First, to analyze the enzyme’s impact on host-parasite interplay, its influence on human monocyte-derived dendritic cells (moDC) was investigated. Treatment of LPS-stimulated cells with recombinant ADI of assemblage A changed DC phenotype (CD83, CD86) and cytokine secretion (TNF-α, IL-10, IL-12p40). These immunomodulatory changes in DC response were due to arginine depletion and the formation of reaction products, in particular, ammonium ions. Furthermore, trophozoites of different assemblage subtypes were shown, probably due to consumption of arginine by ADI, to reduce nitric oxide formation by intestinal epithelial cells in vitro. Second, variation in the ADI coding sequence of different G. duodenalis isolates being collected in a Giardia biobank was analyzed by sequencing. Subsequently, functional genetics were performed with native ADI of different assemblage A subtypes expressed by these strains as well as with purified, recombinant ADI of assemblage A, B and E. It was recognized that enzymes of the same subtype as well as of different assemblages types had different substrate affinities for arginine. To sum up, this report identified G. duodenalis ADI to be immunomodulatory and gives first indications of a correlation between enzyme function and variation of the protein primary structure.

Mit Mineralölkohlenwasserstoffen (MKWs) kontaminierte Böden stellen ein weitverbreitetes Umweltproblem dar. Da Böden ein wertvolles Schutzgut darstellen und nur über lange Zeit erneuerbar sind, existieren verschiedenste Sanierungsmaßnahmen, um den Boden wieder nutzbar zu machen. Die off-site Sanierung in Form von Bodenmieten ist dabei die am häufigsten angewendete Sanierungsmethode. Bei diesem Verfahren werden die Mieten, um eine optimale Sauerstoff- und Nährstoffversorgung der autochtonen Mikroflora zu gewährleisten, während des gesamten Sanierungsprozesses belüftet und ggf. zu Beginn mit Mineraldünger versetzt. Die Zugabe von Fremdorganismen mit entsprechendem Abbaupotential führte in solchen Fällen meist nicht zu einem gesteigerten Sanierungserfolg. Die zu einem Zeitpunkt gegebene Abbauaktivität der Organismen kann über die Messung der Temperatur im Mieteninneren abgeschätzt werden. Ansonsten werden Bodenreinigungsverfahren hinsichtlich der Mikrobiologie bisher als "black box" betrieben. Da bisher noch wenig über die mikrobielle Diversität aktiver Bodenmieten und das im Boden vorhandene Abbaupotential bekannt ist, sollte die Anwendung molekulargenetischer Methoden Aufschluss darüber geben. Die Charakterisierung der aktiven Mikroflora erfolgte zunächst durch die Klonierung der cDNA der 16S rRNA, da durch die 16S rRNA fast ausschließlich Mikroorganismen mit aktiver Proteinsynthese nachgewiesen werden. Die dabei als häufig charakterisierten Gattungen wurden über den gesamten Sanierungsverlauf mittels Membranhybridisierung quantifiziert. Die DNA-Sonden dafür wurden entweder selbst entworfen oder aus der Literatur übernommen. Der Nachweis des Abbaupotentials erfolgte anhand der Gene für die Schlüsselenzyme Alkan-Hydroxylase (AlkB) und Catechol-2,3-Dioxygenase (C23O). Die Quantifizierung der Abbaugene wurde auf DNA-Ebene mit Hilfe der kompetitiven PCR mit einem internen Standard durchgeführt. Das in der Arbeit untersuchte Bodenmaterial stammt aus dem Teerverarbeitungswerk Rositz. Es standen davon drei Mieten mit unterschiedlicher Konzentration an MKW zur Verfügung. Das Material von Rositz 3 wurde über den gesamten Sanierungsverlauf beprobt. Eine Probe der aktiven Miete Rositz 3 wurde zur Diversitätsanalyse herangezogen. Die Mieten Rositz 1 und Rositz 2 sowie das Mietenausgangsmaterial der Tanklager Grimma und Espenhain dienten zu Vergleichsuntersuchungen. Mit der verwendeten Methode zur Nukleinsäure-Extraktion war es möglich, gleichzeitig die RNA und die DNA einer Probe zu erhalten. Die nach Aufschluss mit Glaskugeln erhaltenen sequentiellen Extrakte 1 und 2/3 wurden getrennt voneinander weiter untersucht. Im 1. Aufschluss wurden vermutlich bevorzugt die Mikroorganismen extrahiert, die sich an der Oberfläche der Bodenpartikel befanden, und im 2./3. die aus dem Innern der Bodenpartikel. Die Sequenzierung der SSU rRNA zeigte eine relativ hohe Diversität der Mikroflora, wobei allerdings beide Klonbanken der sequentiellen Nukleinsäureextrakte von den Gammaproteobakterien, besonders von Pseudomonaden dominiert wurden. Die Dominanz der Gammaproteobakterien kann auf das Phänomen des ‚gamma-shifts’ zurückgeführt werden. Aufgrund der hohen MKW-Konzentration im Bodenmaterial, was für die zum Abbau fähigen Bakterien ein hohes Substratangebot darstellt, fand möglicherweise eine Anreicherung der Gammaproteobakterien statt. Alpha- und Betaproteobakterien stellten ebenfalls zwei weitere große Gruppen in den Klonbanken dar. Die erhaltenen Sequenzen waren häufig ähnlich zu denen von kultivierten Mikroorganismen, bildeten in den Dendrogrammen jedoch eigene Cluster, wobei die ähnlichsten Sequenzen meist aus Bodenuntersuchungen stammen. Eine Ausnahme stellen dabei die zu den gefundenen Betaproteobakterien ähnlichen Sequenzen dar. Sie waren vor allem in aquatischen Ökosystemen dominierend. Interessant war, dass manche Gattungen, wie Sphingomonaden oder Zymomonas spp. nur in einem der beiden sequentiellen RNA-Extrakte nachgewiesen werden konnten. Gattungen, wie Acidovorax spp., konnten in beiden Extrakten detektiert werden, wobei die Sequenzen der einzelnen sequentiellen Extrakte im Dendrogramm häufig separate Cluster bildeten. Für alle detektierten Gattungen sind Vertreter bekannt, die in der Lage sind, Bestandteile von MKW abzubauen. Der Vergleich der Sequenzen zeigte, dass der Schadstoffbau hauptsächlich an der Oberfläche der Bodenpartikel stattfinden muss, da viele ähnliche Sequenzen des 2./3. Aufschlusses unter mikroaeroben Bedingungen gefunden wurden. Für die Quantifizierung der dominierenden Gattungen mittels Membranhybridisierung konnten Sonden für Pseudomonas, Sphingomonas, Acinetobacter und Acidovorax aus der Literatur übernommen werden. Auf der Basis der Sequenzdaten wurden für die Gattungen Rhodoferax, Thiobacillus und für die zum Klon TRS13 ähnlichen Sequenzen drei neue "Rositz"–Sonden entwickelt. Im 1. Extrakt war der Anteil der einzelnen Gattungen in den meisten Fällen jeweils höher als im 2./3. Extrakt. Sphingomonaden und Thiobacillen konnten in allen Phasen des Abbauprozesses nachgewiesen werden. Alle anderen genannten Gattungen waren zumeist nur zu Beginn und während des frühen aktiven Schadstoffabbaus detektierbar. Es konnte dabei ein besonders hoher Anteil an Sphingomonaden, Pseudomonaden und Rhodoferax spp. nachgewiesen werden. Das Verschwinden der Pseudomonaden nach der schnellen Abbauphase, d.h. nach dem Abbau der gut bioverfügbaren Schadstoffe, ist ein bekanntes Phänomen. Schlecht bioverfügbare Verbindungen werden wahrscheinlich von anderen Gattungen abgebaut, die aber in dieser Arbeit nicht identifiziert worden sind. Die drastische Änderung der mikrobiellen Gemeinschaft wurde in dieser Form nicht erwartet. Die Schadensfälle Rositz 1 und Rositz 2 wiesen einen geringeren Anteil an Pseudomonaden auf als Rositz 3. Am Ende des Sanierungsprozesses konnten in diesen beiden Mieten auch noch mehr von den detektierten Gattungen nachgewiesen werden. Die Gattung Acinetobacter konnte nur zu Beginn der Sanierung und der aktiven Phase der Miete Rositz 1 detektiert werden, was möglicherweise auf ein Sondenproblem zurückzuführen ist. Die ausgewählten Abbaugene konnten in relativ konstanter Menge über den gesamten Abbauprozess im Bodenmaterial von Rositz 1 und Rositz 3 nachgewiesen werden. In der Miete Rositz 2 war die Kopienzahl der Abbaugene zu Beginn der Sanierung geringer als im aktiven Bodenmaterial, was die Entwicklung der abbauenden Gemeinschaft während des Sanierungsprozesses zeigt. Die Kopienzahl für AlkB lag in allen Fällen deutlich über denen für C23O. Dies ist vermutlich darauf zurückzuführen, dass im Schadensfall Rositz die Alkane den Hauptteil der Kontamination ausmachten. In den meisten Fällen wurde im 1. Extrakt eine höhere Kopienzahl für AlkB und C23O nachgewiesen als im 2./3. Extrakt. Anhand der verwendeten Nachweismethode lässt sich also schlussfolgern, dass sich die meisten zum MKW-Abbau fähigen Mikroorganismen auf der Oberfläche der Bodenpartikel befanden. Trotz unterschiedlicher MKW-Ausgangskonzentration und Sanierungsdauer unterschieden sich die Schadensfälle Grimma und Espenhain kaum in der ermittelten Kopienzahl für AlkB und C23O sowie im Anteil der nachgewiesenen Gattungen. Es sind auch nur geringe Unterschiede zu den Rositz-Mieten erkennbar. In den zu sanierenden Böden liegt ein ausreichend hohes Abbaupotential vor. Der limitierende Faktor für eine erfolgreiche Sanierung scheint demzufolge die ausreichende Sauerstoffversorgung der zum Abbau befähigten Mikroorganismen zu sein.

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