Zugl.: Basel, Univ., Diss.

Thesis (doctoral)--Göteborg University, 2005. / Includes bibliographical references (p. 438-449) and index.

Mit Mineralölkohlenwasserstoffen (MKWs) kontaminierte Böden stellen ein weitverbreitetes Umweltproblem dar. Da Böden ein wertvolles Schutzgut darstellen und nur über lange Zeit erneuerbar sind, existieren verschiedenste Sanierungsmaßnahmen, um den Boden wieder nutzbar zu machen. Die off-site Sanierung in Form von Bodenmieten ist dabei die am häufigsten angewendete Sanierungsmethode. Bei diesem Verfahren werden die Mieten, um eine optimale Sauerstoff- und Nährstoffversorgung der autochtonen Mikroflora zu gewährleisten, während des gesamten Sanierungsprozesses belüftet und ggf. zu Beginn mit Mineraldünger versetzt. Die Zugabe von Fremdorganismen mit entsprechendem Abbaupotential führte in solchen Fällen meist nicht zu einem gesteigerten Sanierungserfolg. Die zu einem Zeitpunkt gegebene Abbauaktivität der Organismen kann über die Messung der Temperatur im Mieteninneren abgeschätzt werden. Ansonsten werden Bodenreinigungsverfahren hinsichtlich der Mikrobiologie bisher als "black box" betrieben. Da bisher noch wenig über die mikrobielle Diversität aktiver Bodenmieten und das im Boden vorhandene Abbaupotential bekannt ist, sollte die Anwendung molekulargenetischer Methoden Aufschluss darüber geben. Die Charakterisierung der aktiven Mikroflora erfolgte zunächst durch die Klonierung der cDNA der 16S rRNA, da durch die 16S rRNA fast ausschließlich Mikroorganismen mit aktiver Proteinsynthese nachgewiesen werden. Die dabei als häufig charakterisierten Gattungen wurden über den gesamten Sanierungsverlauf mittels Membranhybridisierung quantifiziert. Die DNA-Sonden dafür wurden entweder selbst entworfen oder aus der Literatur übernommen. Der Nachweis des Abbaupotentials erfolgte anhand der Gene für die Schlüsselenzyme Alkan-Hydroxylase (AlkB) und Catechol-2,3-Dioxygenase (C23O). Die Quantifizierung der Abbaugene wurde auf DNA-Ebene mit Hilfe der kompetitiven PCR mit einem internen Standard durchgeführt. Das in der Arbeit untersuchte Bodenmaterial stammt aus dem Teerverarbeitungswerk Rositz. Es standen davon drei Mieten mit unterschiedlicher Konzentration an MKW zur Verfügung. Das Material von Rositz 3 wurde über den gesamten Sanierungsverlauf beprobt. Eine Probe der aktiven Miete Rositz 3 wurde zur Diversitätsanalyse herangezogen. Die Mieten Rositz 1 und Rositz 2 sowie das Mietenausgangsmaterial der Tanklager Grimma und Espenhain dienten zu Vergleichsuntersuchungen. Mit der verwendeten Methode zur Nukleinsäure-Extraktion war es möglich, gleichzeitig die RNA und die DNA einer Probe zu erhalten. Die nach Aufschluss mit Glaskugeln erhaltenen sequentiellen Extrakte 1 und 2/3 wurden getrennt voneinander weiter untersucht. Im 1. Aufschluss wurden vermutlich bevorzugt die Mikroorganismen extrahiert, die sich an der Oberfläche der Bodenpartikel befanden, und im 2./3. die aus dem Innern der Bodenpartikel. Die Sequenzierung der SSU rRNA zeigte eine relativ hohe Diversität der Mikroflora, wobei allerdings beide Klonbanken der sequentiellen Nukleinsäureextrakte von den Gammaproteobakterien, besonders von Pseudomonaden dominiert wurden. Die Dominanz der Gammaproteobakterien kann auf das Phänomen des ‚gamma-shifts’ zurückgeführt werden. Aufgrund der hohen MKW-Konzentration im Bodenmaterial, was für die zum Abbau fähigen Bakterien ein hohes Substratangebot darstellt, fand möglicherweise eine Anreicherung der Gammaproteobakterien statt. Alpha- und Betaproteobakterien stellten ebenfalls zwei weitere große Gruppen in den Klonbanken dar. Die erhaltenen Sequenzen waren häufig ähnlich zu denen von kultivierten Mikroorganismen, bildeten in den Dendrogrammen jedoch eigene Cluster, wobei die ähnlichsten Sequenzen meist aus Bodenuntersuchungen stammen. Eine Ausnahme stellen dabei die zu den gefundenen Betaproteobakterien ähnlichen Sequenzen dar. Sie waren vor allem in aquatischen Ökosystemen dominierend. Interessant war, dass manche Gattungen, wie Sphingomonaden oder Zymomonas spp. nur in einem der beiden sequentiellen RNA-Extrakte nachgewiesen werden konnten. Gattungen, wie Acidovorax spp., konnten in beiden Extrakten detektiert werden, wobei die Sequenzen der einzelnen sequentiellen Extrakte im Dendrogramm häufig separate Cluster bildeten. Für alle detektierten Gattungen sind Vertreter bekannt, die in der Lage sind, Bestandteile von MKW abzubauen. Der Vergleich der Sequenzen zeigte, dass der Schadstoffbau hauptsächlich an der Oberfläche der Bodenpartikel stattfinden muss, da viele ähnliche Sequenzen des 2./3. Aufschlusses unter mikroaeroben Bedingungen gefunden wurden. Für die Quantifizierung der dominierenden Gattungen mittels Membranhybridisierung konnten Sonden für Pseudomonas, Sphingomonas, Acinetobacter und Acidovorax aus der Literatur übernommen werden. Auf der Basis der Sequenzdaten wurden für die Gattungen Rhodoferax, Thiobacillus und für die zum Klon TRS13 ähnlichen Sequenzen drei neue "Rositz"–Sonden entwickelt. Im 1. Extrakt war der Anteil der einzelnen Gattungen in den meisten Fällen jeweils höher als im 2./3. Extrakt. Sphingomonaden und Thiobacillen konnten in allen Phasen des Abbauprozesses nachgewiesen werden. Alle anderen genannten Gattungen waren zumeist nur zu Beginn und während des frühen aktiven Schadstoffabbaus detektierbar. Es konnte dabei ein besonders hoher Anteil an Sphingomonaden, Pseudomonaden und Rhodoferax spp. nachgewiesen werden. Das Verschwinden der Pseudomonaden nach der schnellen Abbauphase, d.h. nach dem Abbau der gut bioverfügbaren Schadstoffe, ist ein bekanntes Phänomen. Schlecht bioverfügbare Verbindungen werden wahrscheinlich von anderen Gattungen abgebaut, die aber in dieser Arbeit nicht identifiziert worden sind. Die drastische Änderung der mikrobiellen Gemeinschaft wurde in dieser Form nicht erwartet. Die Schadensfälle Rositz 1 und Rositz 2 wiesen einen geringeren Anteil an Pseudomonaden auf als Rositz 3. Am Ende des Sanierungsprozesses konnten in diesen beiden Mieten auch noch mehr von den detektierten Gattungen nachgewiesen werden. Die Gattung Acinetobacter konnte nur zu Beginn der Sanierung und der aktiven Phase der Miete Rositz 1 detektiert werden, was möglicherweise auf ein Sondenproblem zurückzuführen ist. Die ausgewählten Abbaugene konnten in relativ konstanter Menge über den gesamten Abbauprozess im Bodenmaterial von Rositz 1 und Rositz 3 nachgewiesen werden. In der Miete Rositz 2 war die Kopienzahl der Abbaugene zu Beginn der Sanierung geringer als im aktiven Bodenmaterial, was die Entwicklung der abbauenden Gemeinschaft während des Sanierungsprozesses zeigt. Die Kopienzahl für AlkB lag in allen Fällen deutlich über denen für C23O. Dies ist vermutlich darauf zurückzuführen, dass im Schadensfall Rositz die Alkane den Hauptteil der Kontamination ausmachten. In den meisten Fällen wurde im 1. Extrakt eine höhere Kopienzahl für AlkB und C23O nachgewiesen als im 2./3. Extrakt. Anhand der verwendeten Nachweismethode lässt sich also schlussfolgern, dass sich die meisten zum MKW-Abbau fähigen Mikroorganismen auf der Oberfläche der Bodenpartikel befanden. Trotz unterschiedlicher MKW-Ausgangskonzentration und Sanierungsdauer unterschieden sich die Schadensfälle Grimma und Espenhain kaum in der ermittelten Kopienzahl für AlkB und C23O sowie im Anteil der nachgewiesenen Gattungen. Es sind auch nur geringe Unterschiede zu den Rositz-Mieten erkennbar. In den zu sanierenden Böden liegt ein ausreichend hohes Abbaupotential vor. Der limitierende Faktor für eine erfolgreiche Sanierung scheint demzufolge die ausreichende Sauerstoffversorgung der zum Abbau befähigten Mikroorganismen zu sein.

Acidophilic iron oxidizing bacteria of the betaproteobacterial genus “Ferrovum” are ubiquitously distributed in acid mine drainage (AMD) habitats worldwide. Since their isolation and maintenance in the laboratory has proved to be extremely difficult, members of this genus are not accessible to a “classical” microbiological characterization with exception of the designated type strain “Ferrovum myxofaciens” P3G. The present study reports the characterization of “Ferrovum” strains at genome and transcriptome level. “Ferrovum” sp. JA12, “Ferrovum” sp. PN-J185 and “F. myxofaciens” Z-31 represent the iron oxidizers of the mixed cultures JA12, PN-J185 and Z-31. The mixed cultures were derived from the mine water treatment plant Tzschelln close to the lignite mining site in Nochten (Lusatia, Germany). The mixed cultures also contain a heterotrophic strain of the genus Acidiphilium. The genome analysis of Acidiphilium sp. JA12-A1, the heterotrophic contamination of the mixed culture JA12, indicates an interspecies carbon and phosphate transfer between Acidiphilium and “Ferrovum” in the mixed culture, and possibly also in their natural habitat. The comparison of the inferred metabolic potentials of four “Ferrovum” strains and the analysis of their phylogenetic relationships suggest the existence of two subgroups within the genus “Ferrovum” (i.e. the operational taxonomic units OTU-1 and OUT-2) harboring characteristic metabolic profiles. OTU-1 includes the “F. myxofaciens” strains P3G and Z-31, which are predicted to be motile and diazotrophic, and to have a higher acid tolerance than OTU-2. The latter includes two closely related proposed species represented by the strains JA12 and PN-J185, which appear to lack the abilities of motility, chemotaxis and molecular nitrogen fixation. Instead, both OTU-2 strains harbor the potential to use urea as alternative nitrogen source to ammonium, and even nitrate in case of the JA12-like species. The analysis of the genome architectures of the four “Ferrovum” strains suggests that horizontal gene transfer and loss of metabolic genes, accompanied by genome reduction, have contributed to the evolution of the OTUs. A trial transcriptome study of “Ferrovum” sp. JA12 supports the ferrous iron oxidation model inferred from its genome sequence, and reveals the potential relevance of several hypothetical proteins in ferrous iron oxidation. Although the inferred models in “Ferrovum” spp. share common features with the acidophilic iron oxidizers of the Acidithiobacillia, it appears to be more similar to the neutrophilic iron oxidizers Mariprofundus ferrooxydans (“Zetaproteobacteria”) and Sideroxydans lithotrophicus (Betaproteobacteria). These findings suggest a common origin of ferrous iron oxidation in the Beta- and “Zetaproteobacteria”, while the acidophilic lifestyle of “Ferrovum” spp. may have been acquired later, allowing them to also colonize acid mine drainage habitats.

Acidophilic iron oxidizing bacteria of the betaproteobacterial genus “Ferrovum” are ubiquitously distributed in acid mine drainage (AMD) habitats worldwide. Since their isolation and maintenance in the laboratory has proved to be extremely difficult, members of this genus are not accessible to a “classical” microbiological characterization with exception of the designated type strain “Ferrovum myxofaciens” P3G. The present study reports the characterization of “Ferrovum” strains at genome and transcriptome level. “Ferrovum” sp. JA12, “Ferrovum” sp. PN-J185 and “F. myxofaciens” Z-31 represent the iron oxidizers of the mixed cultures JA12, PN-J185 and Z-31. The mixed cultures were derived from the mine water treatment plant Tzschelln close to the lignite mining site in Nochten (Lusatia, Germany). The mixed cultures also contain a heterotrophic strain of the genus Acidiphilium. The genome analysis of Acidiphilium sp. JA12-A1, the heterotrophic contamination of the mixed culture JA12, indicates an interspecies carbon and phosphate transfer between Acidiphilium and “Ferrovum” in the mixed culture, and possibly also in their natural habitat. The comparison of the inferred metabolic potentials of four “Ferrovum” strains and the analysis of their phylogenetic relationships suggest the existence of two subgroups within the genus “Ferrovum” (i.e. the operational taxonomic units OTU-1 and OUT-2) harboring characteristic metabolic profiles. OTU-1 includes the “F. myxofaciens” strains P3G and Z-31, which are predicted to be motile and diazotrophic, and to have a higher acid tolerance than OTU-2. The latter includes two closely related proposed species represented by the strains JA12 and PN-J185, which appear to lack the abilities of motility, chemotaxis and molecular nitrogen fixation. Instead, both OTU-2 strains harbor the potential to use urea as alternative nitrogen source to ammonium, and even nitrate in case of the JA12-like species. The analysis of the genome architectures of the four “Ferrovum” strains suggests that horizontal gene transfer and loss of metabolic genes, accompanied by genome reduction, have contributed to the evolution of the OTUs. A trial transcriptome study of “Ferrovum” sp. JA12 supports the ferrous iron oxidation model inferred from its genome sequence, and reveals the potential relevance of several hypothetical proteins in ferrous iron oxidation. Although the inferred models in “Ferrovum” spp. share common features with the acidophilic iron oxidizers of the Acidithiobacillia, it appears to be more similar to the neutrophilic iron oxidizers Mariprofundus ferrooxydans (“Zetaproteobacteria”) and Sideroxydans lithotrophicus (Betaproteobacteria). These findings suggest a common origin of ferrous iron oxidation in the Beta- and “Zetaproteobacteria”, while the acidophilic lifestyle of “Ferrovum” spp. may have been acquired later, allowing them to also colonize acid mine drainage habitats.:EIDESSTATTLICHE ERKLÄRUNG ... 2 CONTENT ... 4 SUMMARY ... 9 CHAPTER I ... 11 ORIGIN AND MICROBIOLOGY OF ACID MINE DRAINAGE ... 11 ACIDOPHILIC IRON OXIDIZING BACTERIA OF THE GENUS “FERROVUM” ... 12 APPLICATION OF OMICS-BASED APPROACHES TO CHARACTERIZE ACIDOPHILES ... 14 AIMS OF THE PRESENT WORK ... 15 CHAPTER II ... 17 ABSTRACT ... 18 INTRODUCTION ... 18 METHODS ... 19 GENOME PROJECT HISTORY ... 19 GROWTH CONDITIONS AND GENOMIC DNA PREPARATION ... 20 GENOME SEQUENCING AND ASSEMBLY ... 20 GENOME ANNOTATION ... 21 RESULTS ... 21 CLASSIFICATION AND FEATURES ... 21 GENOME PROPERTIES ... 24 INSIGHTS FROM THE GENOME SEQUENCE ... 24 COMPARATIVE GENOMICS ... 28 CONCLUSIONS ... 30 ACKNOWLEDGMENTS ... 32 AUTHOR CONTRIBUTIONS ... 32 CHAPTER III ... 33 ABSTRACT ... 34 INTRODUCTION ... 34 METHODS ... 36 ORIGIN AND CULTIVATION OF “FERROVUM” STRAIN JA12 ... 36 GENOME SEQUENCING, ASSEMBLY AND ANNOTATION ... 37 VISUALIZATION OF THE NEARLY COMPLETE GENOME ... 38 PHYLOGENETIC ANALYSIS ... 39 PREDICTION OF MOBILE GENETIC ELEMENTS ... 39 NUCLEOTIDE SEQUENCE ACCESSION NUMBER ... 39 RESULTS AND DISCUSSION ... 39 PHYLOGENETIC CLASSIFICATION OF “FERROVUM” STRAIN JA12 ... 39 GENOME PROPERTIES ... 40 NUTRIENT ASSIMILATION AND BIOMASS PRODUCTION ... 44 Carbon dioxide fixation ... 44 Central carbon metabolism ... 45 Nitrogen ... 47 Phosphate ... 49 Sulfate ... 50 ENERGY METABOLISM ... 50 Ferrous iron oxidation ... 50 Other redox reactions connected to the quinol pool ... 54 Predicted formate dehydrogenase ... 55 STRATEGIES TO ADAPT TO ACIDIC ENVIRONMENTS, HIGH METAL LOADS AND OXIDATIVE STRESS ... 55 Acidic environment ... 55 Strategies to cope with high metal and metalloid loads ... 58 Oxidative stress ... 59 HORIZONTAL GENE TRANSFER ... 60 CONCLUSIONS ... 61 ACKNOWLEDGMENTS ... 62 AUTHORS\' CONTRIBUTIONS ... 62 CHAPTER IV ... 63 ABSTRACT ... 64 INTRODUCTION ... 64 METHODS ... 66 ORIGIN AND CULTIVATION OF “FERROVUM” STRAINS PN-J185 AND Z-31 ... 66 GENOME SEQUENCING, ASSEMBLY AND ANNOTATION ... 66 PREDICTION OF MOBILE GENETIC ELEMENTS ... 67 COMPARATIVE GENOMICS ... 68 Phylogenomic analysis ... 68 Assignment of protein-coding genes to the COG classification ... 68 Identification of orthologous proteins ... 68 Comparison and analysis of genome architectures ... 69 RESULTS ... 69 GENERAL GENOME FEATURES AND PHYLOGENETIC RELATIONSHIP OF THE FOUR “FERROVUM” STRAINS ... 69 COMPARISON OF INFERRED METABOLIC TRAITS ... 71 Identification of core genes and flexible genes ... 71 Comparison of the central metabolism ... 74 Central carbon metabolism ... 74 Nitrogen metabolism ... 77 Energy metabolism ... 78 Cell mobility and chemotaxis ... 78 Diversity of predicted stress tolerance mechanisms ... 78 Maintaining the intracellular pH homeostasis ... 78 Coping with high metal loads ... 79 Oxidative stress management ... 79 IDENTIFICATION OF POTENTIAL DRIVING FORCES OF GENOME EVOLUTION ... 80 Prediction of mobile genetic elements ... 81 Linking the differences in the predicted metabolic profiles to the genome architectures ... 82 Gene cluster associated with flagella formation and chemotaxis in “F. myxofaciens” ... 84 Gene clusters associated with the utilization of alternative nitrogen sources ... 86 Gene cluster associated with carboxysome formation in “F. myxofaciens” and OTU-2 strain JA12 ... 87 Putative genomic islands in the OTU-strain JA12 ... 89 CRISPR/Cas in “F. myxofaciens” Z-31: a defense mechanism against foreign DNA ... 91 DISCUSSION ... 92 THE COMPARISON OF THEIR METABOLIC PROFILES INDICATES THE EXISTENCE OF OTU- AND STRAIN-SPECIFIC FEATURES ... 92 GENOME EVOLUTION OF THE “FERROVUM” STRAINS APPEARS TO BE DRIVEN BY HORIZONTAL GENE TRANSFER AND GENOME REDUCTION ... 94 Horizontal gene transfer ... 94 Mechanisms of genome reduction ... 95 CONCLUDING REMARKS ... 98 ACKNOWLEDGMENTS ... 98 AUTHOR CONTRIBUTIONS ... 98 CHAPTER V ... 99 ABSTRACT ... 100 INTRODUCTION ... 100 METHODS ... 102 CULTIVATION OF THE “FERROVUM”-CONTAINING MIXED CULTURE JA12 ... 102 Up-scaling of pre-cultures for the transcriptome study ... 103 Experimental setup of the transcriptome study ... 103 Cell harvest from large culture volumes ... 106 EXTRACTION OF TOTAL RNA ... 106 LIBRARY CONSTRUCTION AND SEQUENCING ... 107 DATA ANALYSIS ... 107 Processing of raw data ... 107 Quantification of gene expression levels ... 108 Functional analysis ... 108 RESULTS ... 108 CULTIVATION OF THE MIXED CULTURE JA12 IN THE MULTIPLE BIOREACTOR SYSTEM ... 108 Growth monitoring ... 108 Microbial composition ... 111 RNA SEQUENCING (RNA-SEQ) ... 112 FUNCTIONAL CATEGORIZATION OF EXPRESSED GENES ... 113 Functional assignment of highly expressed genes ... 117 Functional assignment of poorly expressed genes ... 121 COMPARISON OF EXPRESSION LEVELS OF GENES PREDICTED TO BE INVOLVED IN OXIDATIVE STRESS MANAGEMENT ... 122 DISCUSSION ... 124 METABOLIC PATHWAYS RELEVANT UNDER CULTURE CONDITIONS MIMICKING THE NATURAL CONDITIONS IN THE MINE WATER TREATMENT PLANT ... 125 Novel insights into the energy metabolism of “Ferrovum” sp. JA12 ... 125 Insights from poorly expressed genes ... 126 VARIATION OF GENE EXPRESSION PATTERNS UNDER THE DIFFERENT CONDITIONS ... 128 EVALUATION OF THE EXPERIMENTAL SET-UP INVOLVING THE MULTIPLE BIOREACTOR SYSTEM ... 129 CONCLUDING REMARKS: SIGNIFICANCE OF THE PRESENT TRANSCRIPTOME STUDY ... 130 ACKNOWLEDGMENTS ... 131 AUTHOR CONTRIBUTIONS ... 131 CHAPTER VI ... 133 ABSTRACT ... 133 EXTENDED INSIGHTS INTO THE FERROUS IRON OXIDATION IN BETAPROTEOBACTERIA ... 133 MECHANISMS OF PHYLOGENETIC AND METABOLIC DIVERSIFICATION WITHIN THE GENUS “FERROVUM” ... 136 INFERRED ROLES OF “FERROVUM” SPP. IN THE MICROBIAL NETWORK OF THE MINE WATER TREATMENT PLANT ... 138 PERSPECTIVES ... 143 REFERENCES ... 145 SUPPLEMENTARY MATERIAL ... 170 DATA DVD ... 170 SUPPLEMENTARY MATERIAL FOR CHAPTER III ... 171 NUCLEOTIDE ACCESSION NUMBERS ... 171 PHYLOGENETIC ANALYSIS ... 171 GENOME PROPERTIES ... 173 NUTRIENT ASSIMILATION ... 174 Carbon metabolism ... 174 FERROUS IRON OXIDATION ... 176 HORIZONTAL GENE TRANSFER ... 179 SUPPLEMENTARY MATERIAL FOR CHAPTER IV ... 180 PHYLOGENETIC ANALYSIS ... 180 ASSIGNMENT OF PROTEIN-CODING GENES TO THE COG CLASSIFICATION ... 180 COMPARISON OF THE CENTRAL METABOLISM ... 181 Predicted metabolic potential of the four “Ferrovum” strains ... 181 Genes predicted to be involved in the central metabolism, energy metabolism, cell motility and stress management in the four “Ferrovum” strains ... 183 PREDICTED MOBILE GENETIC ELEMENTS IN THE GENOMES OF THE FOUR “FERROVUM” STRAINS ... 184 THE FLAGELLA AND CHEMOTAXIS GENE CLUSTER ... 184 THE UREASE GENE CLUSTER ... 185 THE CARBOXYSOME GENE CLUSTER ... 186 PUTATIVE GENOMIC ISLANDS IN “FERROVUM” SP. JA12 ... 187 Gene content of the genomic islands ... 187 Flanking sites of the putative genomic islands 1 and 2 ... 188 SUPPLEMENTARY MATERIAL FOR CHAPTER V ... 189 ORGANIZATION AND OPERATION OF THE LABFORS 5 MULTIPLE BIOREACTOR SYSTEM ... 189 INVESTIGATION OF THE MICROBIAL COMPOSITION IN THE IRON OXIDIZING MIXED CULTURE JA12 ... 192 SUPPLEMENTARY DATA OF THE TRANSCRIPTOME DATA ANALYSIS ... 193 RNA-Seq statistics ... 193 Expression strength of protein-coding genes ... 194 Expression of genes involved in carboxysome formation ... 197 Expression of a ribosomal proteins-encoding gene cluster ... 199 Expression of a gene cluster presumably involved in ferrous iron oxidation ... 202 Lowest expressed genes ... 205 Expression of genes predicted to be involved in oxidative stress response ... 206 ACKNOWLEDGMENTS ... 208 COLLEAGUES ... 208 ERFOLGSTEAM “JUNGE FRAUEN AN DIE SPITZE” (“YOUNG WOMEN TO THE TOP“) ... 208 FAMILY AND FRIENDS ... 209 FUNDING ... 209 CURRICULUM VITAE ... 210 LIST OF PUBLICATIONS ... 212 RESEARCH ARTICLES ... 212 CONFERENCE PROCEEDINGS ... 212 ORAL PRESENTATIONS AND POSTERS ... 213