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La verticilliose de la luzerne cultivée (Medicago sativa L.) est une maladie de flétrissement vasculaire causée par le champignon du sol Verticillium alfalfae. C’est une des maladies les plus dévastatrices et les plus difficiles à contrôler. Les symptômes sont un jaunissement des feuilles suivi de flétrissement et défoliation. Les structures de dormance produites en fin de cycle de maladie constituent une source de contamination pour plusieurs années. Aucun traitement fongicide n’est efficace, la seule méthode de contrôle reste la production de variétés résistantes. En raison de sa nature tétraploïde et de son allogamie, il est difficile de réaliser des études génétiques sur M. sativa. Un pathosystème entre la légumineuse modèle Medicago truncatula et V. alfalfae a été mis au point pour étudier les mécanismes mis en place au cours de l’interaction entre V. alfalfae et son hôte. Les lignées A17 et F83005.5 ont été identifiées comme étant respectivement résistante et sensible à la souche V31-2 de V. alfalfae. La première partie de ce travail de thèse est une étude comparative du processus d’infection de V. alfalfae V31-2 au cours d’une interaction compatible et incompatible. Nous avons étudié la cinétique de colonisation des racines d’A17 et F83005.5 avec la souche V31-2 exprimant le gène marqueur GFP ce qui confère une fluorescence verte au champignon. Les observations en microscopie confocale ont montré que le champignon se développait dans les racines des deux lignées contrastées de façon similaire pendant les premières étapes d’infection. Quelques jours plus tard, il n’était plus détectable dans la lignée résistante, tandis qu’il colonisait les vaisseaux du xylème dans la lignée sensible et avançait vers les parties aériennes. La lignée résistante A17 était donc capable d’inhiber totalement le développement du pathogène dans la partie racinaire. Ce résultat a été confirmé par la quantification de l’ADN du pathogène dans la racine et dans les parties aériennes. Nous avons conclu que la lignée A17 exprime une résistance totale à V. alfalfae. Dans la deuxième partie de cette thèse, nous avons cherché à identifier le rôle des hormones dans les mécanismes de défense de M. truncatula en réalisant des traitements exogènes avec l’acide salicylique (SA), le méthyl jasmonate (MeJA), l’éthylène (ET), l’auxine et l’acide abscissique (ABA). Ces traitements n’avaient aucun effet sur la résistance d’A17, mais toutes les hormones, à l’exception du MeJA, protégeaient la lignée sensible contre les symptômes de la maladie. La quantification de l’ADN du champignon in planta a montré que seule l’ABA inhibait significativement le développement du pathogène. Dans la troisième partie, nous avons cherché à identifier des acteurs moléculaires impliqués dans la résistance et la sensibilité en comparant le transcriptome de la lignée F83005.5 et A17 dans la phase précoce de l’infection. L’analyse des gènes différentiellement exprimés en réponse à l’inoculation montre que les deux lignées induisent des gènes impliqués dans la production de métabolites secondaires, et des gènes des voies de signalisation hormonale. Mais seule la lignée résistante montre une induction de l’expression de gènes de résistance et de gènes impliqués dans les voies de signalisation tels que des gènes de la synthèse de l’ABA et des facteurs de transcription. Ces résultats renforcent l’hypothèse que l’ABA serait un facteur important dans la résistance à V. alfalfae chez M. truncatula. L’analyse des réseaux de gènes coexprimés a montré une désorganisation de la réponse de la lignée F83005.5. En revanche, dans la lignée A17, on observe une réponse organisée et orientée vers la défense. Ce travail décrit pour la première fois les mécanismes de défense de M. truncatula contre V. alfalfae. L’ensemble des résultats montre que la résistance exprimée chez la lignée A17 est différente des mécanismes de résistance contre la verticilliose décrits chez la tomate et le coton. / Verticllium wilt of alfalfa (Medicago sativa L.) is a vascular disease caused by the soil fungus Verticillium alfalfae. It is one of the most devastating diseases and most difficult to control. Symptoms are leaf yellowing followed by wilting and defoliation. Survival structures which are produced at the end of the disease cycle are a source of inoculum for many years. Fungicide treatment is not efficient, and the only way to control this disease is to breed resistant cultivars. Genetic studies are difficult in M. sativa because it is tetraploid and outcrossing. A pathosystem has been set up in our laboratory in order to study the mechanisms involved in the interaction between V. alfalfae and its host. It involves the model legume plant M. truncatula and strain V31-2 of V. alfalfae. The lines A17 and F83005.5 were identified as respectively resistant and susceptible to V31-2. The first part of this thesis is a comparative study of the infection process of V. alfalfae V31-2 in a compatible and incompatible interaction. The time course of root colonization in lines A17 and F83005.5 was studied with a GFP-expressing strain which confers green fluorescence to the fungus. Observations by confocal microscopy showed that the fungus developed in a similar way in roots of both lines during the first stage of the interaction. Some days later the fungus was not detectable anymore in roots of the resistant line, but has colonized the xylem vessels and grew towards the aerial part of the plant in the susceptible line. Quantification of fungal DNA in roots and aerial parts confirmed these results. This showed that the resistant line A17 was able to suppress the pathogen’s development in the root. It can be concluded that line A17 presents total resistance towards V. alfalfae. The second part of the thesis concerns the role of phytohormones for defence mechanisms against V. alfalfae in M. truncatula. Susceptible and resistant plants were treated with salicylic acid (SA), methyl jasmonate (MeJA), ethylene (ET), auxine and abscissic acid (ABA). Resistance of line A17 was not affected by these treatments, but all hormones except MeJA protected the susceptible line against disease symptoms. However, when fungal DNA was quantified in planta in these assays, only ABA inhibited the pathogen’s development significantly. The third part of this thesis aims at identifying molecular factors involved in resistance and susceptibility. To address this topic, the transcriptome of lines A17 and F83005.5 was compared during the early stages of infection, in inoculated or mock-inoculated plants. A bioinformatics analysis of differentially expressed genes showed that both lines responded to inoculation by inducing genes involved in secondary metabolism and hormone signaling pathways. However, only resistant line A17 showed induction of the expression of putative resistance and signaling genes, genes involved in ABA synthesis and transcription factors. This result confirms our hypothesis that ABA might be an important factor in M. truncatula resistance against V. alfalfae. Gene network analysis of co-expressed genes showed a disorganised response in the susceptible line, whereas in the resistant line the response was highly organised and turned to defence. Taken together, this work describes for the first time defence mechanisms against V. alfalfae in M. truncatula. The results show that resistance of line A17 is different from resistance mechanisms Verticillium resistance described in tomato and cotton. Several approaches for future research are presented in order to test our hypotheses concerning genes and molecules putatively involved in this interaction. With regard to applied research, defence and signaling genes identified in this work may be useful for the improvement of alfalfa, after functional validation.

L’objectif de ce travail est de mettre au point une nouvelle approche automatique pour identifier les réseaux de gènes concourant à une même fonction biologique. Ceci permet une meilleure compréhension des phénomènes biologiques et notamment des processus impliqués dans les maladies telles que les cancers. Différentes stratégies ont été développées pour essayer de regrouper les gènes d’un organisme selon leurs relations fonctionnelles : génétique classique et génétique moléculaire. Ici, nous utilisons une propriété connue des réseaux de gènes fonctionnellement liés à savoir que ces gènes sont généralement co-régulés et donc co-exprimés. Cette co-régulation peut être mise en évidence par des méta-analyses de données de puces à ADN (micro-arrays) telles que Gemma ou COXPRESdb. Dans un travail précédent [Al Adhami et al., 2015], la topologie d’un réseau de co-expression de gènes a été caractérisé en utilisant deux paramètres de description des réseaux qui discriminent des groupes de gènes sélectionnés aléatoirement (modules aléatoires, RM) de groupes de gènes avec des liens fonctionnels connus (modules fonctionnels, FM), c’est-à-dire des gènes appartenant au même processus biologique GO. Dans le présent travail, nous avons cherché à généraliser cette approche et à proposer une méthode, appelée TopoFunc, pour améliorer l’annotation existante de la fonction génique. Nous avons d’abord testé différents descripteurs topologiques du réseau de co-expression pour sélectionner ceux qui identifient le mieux des modules fonctionnels. Puis, nous avons constitué une base de données rassemblant des modules fonctionnels et aléatoires, pour lesquels, sur la base des descripteurs sélectionnés, nous avons construit un modèle de discrimination LDA [Friedman et al., 2001] permettant, pour un sous-ensemble de gènes donné, de prédire son type (fonctionnel ou non). Basée sur la méthode de similarité de gènes travaillée par Wang et ses collègues [Wang et al., 2007], nous avons calculé un score de similarité fonctionnelle entre les gènes d’un module. Nous avons combiné ce score avec celui du modèle LDA dans une fonction de fitness implémenté dans un algorithme génétique (GA). À partir du processus biologique d’ontologie de gènes donné (GO-BP), AG visait à éliminer les gènes faiblement co-exprimés avec la plus grande clique de GO-BP et à ajouter des gènes «améliorant» la topologie et la fonctionnalité du module. Nous avons testé TopoFunc sur 193 GO-BP murins comprenant 50-100 gènes et avons montré que TopoFunc avait agrégé un certain nombre de nouveaux gènes avec le GO-BP initial tout en améliorant la topologie des modules et la similarité fonctionnelle. Ces études peuvent être menées sur plusieurs espèces (homme, souris, rat, et possiblement poulet et poisson zèbre) afin d’identifier des modules fonctionnels conservés au cours de l’évolution. / The aim of this work is to develop a new automatic approach to identify networks of genes involved in the same biological function. This allows a better understanding of the biological phenomena and in particular of the processes involved in diseases such as cancers. Various strategies have been developed to try to cluster genes of an organism according to their functional relationships : classical genetics and molecular genetics. Here we use a well-known property of functionally related genes mainly that these genes are generally co-regulated and therefore co-expressed. This co-regulation can be detected by microarray meta-analyzes databases such as Gemma or COXPRESdb. In a previous work [Al Adhami et al., 2015], the topology of a gene coexpression network was characterized using two description parameters of networks that discriminate randomly selected groups of genes (random modules, RM) from groups of genes with known functional relationship (functional modules, FM), e.g. genes that belong to the same GO Biological Process. We first tested different topological descriptors of the co-expression network to select those that best identify functional modules. Then, we built a database of functional and random modules for which, based on the selected descriptors, we constructed a discrimination model (LDA)[Friedman et al., 2001] allowing, for a given subset of genes, predict its type (functional or not). Based on the similarity method of genes worked by Wang and co-workers [Wang et al., 2007], we calculated a functional similarity score between the genes of a module. We combined this score with that of the LDA model in a fitness function implemented in a genetic algorithm (GA). Starting from a given Gene Ontology Biological Process (GO-BP), AG aimed to eliminate genes that were weakly coexpressed with the largest clique of the GO-BP and to add genes that "improved" the topology and functionality of the module. We tested TopoFunc on the 193 murine GO-BPs comprising 50-100 genes and showed that TopoFunc aggregated a number of novel genes to the initial GO-BP while improving module topology and functional similarity. These studies can be conducted on several species (humans, mice, rats, and possibly chicken and zebrafish) to identify functional modules preserved during evolution.