Orientador: Érika Veruska Paiva Ortolan / Banca: Bonifácio Katsumori Takegawa / Banca: José Roberto de Souza Baratella / Resumo: Com a finalidade de avaliar a repercussão no prognóstico e na morbidade dos pacientes com TCG em função da adesão do cirurgião ao protocolo cirúrgico, foram analisados retrospectivamente, com ênfase nos aspectos cirúrgicos, 64 pacientes de 0 a 18 anos completos, durante o período de junho de 1996 a janeiro de 2009 em dois centros de referência para o tratamento do paciente oncológico pediátrico: Hospital Amaral Carvalho de Jaú e o Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina de Botucatu (UNESP). Os dados coletados eram referentes a variáveis qualitativas e, desse modo, foram obtidas frequências e porcentagens para cada variável. As associações entre as variáveis de interesse foram feitas obtendo-se tabelas de contingência e testes qui-quadrado ou exato de Fisher. Em todos os testes foi adotado o nível de significância de 5%. Dos 64 pacientes estudados, 22 do Hospital Amaral Carvalho e 42 do Hospital das Clínicas - UNESP, com relação ao local primário, houve predomínio do ovário, seguido de testículo, sacrococcígeo, retroperitoneal, mediastino, orofaringe e útero. O tipo histológico predominante foi o teratoma puro, e o estadio I foi o mais freqüente. Quarenta e quatro pacientes foram classificados como baixo risco, e todos os 64 pacientes receberam tratamento cirúrgico, sendo em 44 deles exclusivo. A cirurgia pediátrica foi quem mais encaminhou casos operados dos serviços de origem, enquanto a ginecologia foi a especialidade que mais operou nas instituições de estudo. Quinze casos foram encaminhados com algum tipo de cirurgia e 49 encaminhados sem cirurgia. A quantidade de casos encaminhados sem cirurgia prévia foi estatisticamente significante quando comparado aos casos encaminhados com algum tipo de cirurgia. Dos 15 pacientes encaminhados com algum tipo de cirurgia, 10 seguiram o protocolo... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: In order to assess the impact on prognosis and morbidity of patients with GCT according to the surgeon's accession to the surgical protocol were analyzed retrospectively, with emphasis on surgery, 64 patients 0-18 years of age, during the period of June 1996 to January 2009 in two hospitals for the treatment of pediatric cancer patients: Hospital Amaral Carvalho de Jau and the Hospital of the Medical School of Botucatu (UNESP). Data were collected regarding the qualitative variables, and thus, frequencies and percentages were obtained for each variable. The associations between the variables of interest were made by obtaining contingency tables and chisquare or Fisher exact test. In all tests, we adopted the significance level of 5%. Of the 64 patients studied, 22 of 42 Amaral Carvalho Hospital and the Hospital das Clinicas - UNESP, with respect to the primary site, there was a predominance of the ovary, followed by testis, sacrococcygeal, retroperitoneal, mediastinal, oropharynx and uterus. The predominant histological type was pure teratoma, and the stage I was the most frequent. Forty-four patients were classified as low risk, and all 64 patients received surgical treatment in 44 of them being unique. The pediatric surgery was the most referred cases operated source of services, while gynecology was the specialty that most institutions operated in the study. Fifteen cases were referred to some type of surgery and 49 conveyed without surgery. The number of cases referred without previous surgery was statistically significant when compared to cases presenting with some type of surgery. Of the 15 patients referred with type of surgery, 10 followed the protocol and not 5, while the 49 patients referred without surgery, 24 were operated on following the protocol and not 25. Although there was no statistically significant differences... (Complete abstract click electronic access below) / Mestre

Introducción: La producción ovina es el principal recurso de familias que habitan a gran altura. Sin embargo, presenta una eficiencia reproductiva pobre en relación con lo registrado a nivel del mar. La hipoxia hipobárica propia de ambientes a gran altura produce estrés oxidativo, lo que también produce efectos perjudiciales en el aparato reproductor. Bajas tasas de fertilidad, desarrollo intrauterino y bajos pesos al nacimiento son algunos de los efectos perjudiciales de la gran altura. La terapia antioxidante en ovejas mantenidas en la altura ha mostrado reducir el daño oxidativo causado por la hipoxia e incrementar la capacidad reproductiva. Por esta razón, se evaluó si la suplementación con vitaminas antioxidantes C y E atenúa los efectos perjudiciales del estrés oxidativo causado por hipoxia en la función reproductiva de carneros expuestos a la altura por corto y largo tiempo. Materiales y Métodos: Se utilizaron carneros nativos y mantenidos a nivel del mar (BB; n=20); nativos del nivel del mar, expuestos a la altura (BA; n=50); nativos de la altura, mantenidos en la altura (AA; n=50). La mitad de los animales de cada grupo fueron suplementados diariamente con 600 mg de vitamina C y 450 UI de vitamina E, vía oral, durante 240 días. Se analizaron las poblaciones celulares presentes en el epitelio seminífero, la morfología espermática en el eyaculado y el estatus antioxidante del plasma seminal. Resultados: La suplementación con vitaminas evitó y/o amortiguó la reducción de la población de espermatogonias, la reducción de la altura del epitelio seminífero y el diámetro tubular, la disminución de la capacidad antioxidante total y redujo el grado de arresto espermatogénico al día 30 en carneros no adaptados a la altura. Sin embargo, no tuvo efectos sobre la morfología espermática y las enzimas presentes en el plasma seminal de carneros expuestos a gran altura por corto y largo tiempo. Conclusión: La suplementación con vitaminas antioxidantes favorece la espermatogénesis y la capacidad antioxidante total del plasma seminal de carneros no adaptados a la altura en el corto plazo. / Introduction: The sheep production is the main resource of families living at high altitude. However, has a poor reproductive efficiency in relation to that recorded at sea level. Hypobaric hypoxia at high altitude environments produces oxidative stress, which leads to detrimental effects on the reproductive system. Low fertility rates, low intrauterine development and low birth weights are some of the damaging effects of exposure to high altitude. Therapy with antioxidant in ewes maintained at high altitude has been shown to reduce oxidative damage caused by hypoxia and increase reproductive capacity. For these reasons, supplementation with antioxidant vitamins C and E was evaluated in its capacity to attenuate the oxidative deleterious effects on reproductive function in rams exposed to high altitude for short or long periods. Materials and Methods: Three groups of rams were evaluated, rams born and kept at sea level (BB, n = 20); rams born at sea level and exposed to high altitude (BA; n = 50); born and kept at high altitude (AA; n = 50). Half of the animals in each group were daily supplemented with 600 mg of vitamin C and 450 IU of vitamin E, orally, for 240 days. The cell populations present in the seminiferous epithelium, the sperm morphology in the ejaculate and the antioxidant status of seminal plasma were analyzed. Results: Oral supplementation with vitamins C and E prevented and / or softened the reduction of the spermatogonial population, the reduction of the height of the seminiferous epithelium and the tubular diameter, the decrease of the total antioxidant capacity and reduced the degree of spermatogenic arrest at day 30 in rams not adapted to high altitude However, it did not have effects on sperm morphology and enzymes present in the seminal plasma of rams exposed at high altitude for a short and long periods. Conclusion: Supplementation with antioxidant vitamins favors the spermatogenesis and the total antioxidant capacity of the seminal plasma of rams not adapted to high altitude in the short term. / Introduction: The sheep production is the main resource of families living at high altitude. However, has a poor reproductive efficiency in relation to that recorded at sea level. Hypobaric hypoxia at high altitude environments produces oxidative stress, which leads to detrimental effects on the reproductive system. Low fertility rates, low intrauterine development and low birth weights are some of the damaging effects of exposure to high altitude. Therapy with antioxidant in ewes maintained at high altitude has been shown to reduce oxidative damage caused by hypoxia and increase reproductive capacity. For these reasons, supplementation with antioxidant vitamins C and E was evaluated in its capacity to attenuate the oxidative deleterious effects on reproductive function in rams exposed to high altitude for short or long periods. Materials and Methods: Three groups of rams were evaluated, rams born and kept at sea level (BB, n = 20); rams born at sea level and exposed to high altitude (BA; n = 50); born and kept at high altitude (AA; n = 50). Half of the animals in each group were daily supplemented with 600 mg of vitamin C and 450 IU of vitamin E, orally, for 240 days. The cell populations present in the seminiferous epithelium, the sperm morphology in the ejaculate and the antioxidant status of seminal plasma were analyzed. Results: Oral supplementation with vitamins C and E prevented and / or softened the reduction of the spermatogonial population, the reduction of the height of the seminiferous epithelium and the tubular diameter, the decrease of the total antioxidant capacity and reduced the degree of spermatogenic arrest at day 30 in rams not adapted to high altitude However, it did not have effects on sperm morphology and enzymes present in the seminal plasma of rams exposed at high altitude for a short and long periods. Conclusion: Supplementation with antioxidant vitamins favors the spermatogenesis and the total antioxidant capacity of the seminal plasma of rams not adapted to high altitude in the short term. / Financiamiento: Proyecto Fondecyt 1130181

As células germinativas primordiais (CGPs) são as precursoras dos gametas, capazes de gerar um novo indivíduo os quais transmitirão os materiais genéticos para as futuras gerações. Normalmente, a linha germinal de mamífero é determinada por fatores genéticos e epigenéticos que possuem funções essenciais para guiar na direção e desenvolvimento das CGPs, bem como das células germinativas embrionárias (CGEs). A reprogramação epigenética é fundamental para a regulação do genoma durante o desenvolvimento das células germinativas responsáveis por originar a linhagem gametogênica nos mamíferos. A metilação e desmetilação em CGPs são um evento único, essencial para apagar a memória epigenética e também prevenir transmissões de epimutações para a próxima geração. Assim, o completo entendimento das vias e mecanismos para a migração inicial e diferenciação destas células em CGEs podem ser importantes para identificar e corrigir falhas possíveis nesses processos, o que será importante, no futuro, para o desenvolvimento e desempenho reprodutivo. A maioria dos estudos com CGPs e CGEs é realizado em camundongos, porém nem sempre esta espécie torna-se o melhor modelo de estudo quando se quer transpor esses conhecimentos a humanos. O cão doméstico (Canis lúpus familiaris) apresenta-se como um modelo ideal para o estudo do desenvolvimento em mamíferos, pois possui inúmeras similaridades com a bioquímica, fisiologia e genética. Deste modo, torna-se interessante expandir os estudos sobre as CGPs e CGEs na espécie canina, a fim de mostrar a importância de diferentes modelos que se assemelham a seres humanos. Portanto, objetiva-se, nesta proposta, identificar qual é a dinâmica de marcadores pluripotentes, germinativos e epigenéticos que são importantes para o desenvolvimento das CGPs e CGEs caninas. Para tal procedimento, essa pesquisa foi dividida em duas fases: a primeira, consiste no processo in vivo, desde o desenvolvimento inicial do embrião até a completa formação da crista gônadal. Análises de RTq-PCR e imunofluorescência para marcadores pluripotentes POU5F1 (OCT4) e NANOG, germinativos DDX4 (VASA), DAZL e DPPA3 (STELLA) e epigenéticos 5mC, 5hmC, H3K27me3 e H3K9me2 foram realizados para criar um perfil de genes que são importantes para o desenvolvimento das CGPs caninas. Prosseguiu-se para a segunda fase in vitro, que incide na derivação e caracterização das CGEs caninas. Ensaios de Fosfatase Alcalina, imunofluorescência para os marcadores: pluripotente POU5F1 (OCT4), germinativos DDX4 (VASA), DAZL e DPPA3 (STELLA), mesodérmico THY-1 (CD90) e epigenéticos 5mC, 5hmC, H3K27me3 e H3K9me2, RT-qPCR para os genes NANOG e DDX4 e formação de teratoma foram efetivados para comprovar a linhagem de células CGEs. Como resultado in vivo, percebe-se que diferentes padrões de marcações e genes foram expressos nas CGPs, comprovando que a espécie canina se assemelha mais com os humanos do que com os camundongos. Os resultados in vitro mostraram que foi possível derivar as células CGEs e que estas conseguem reter sua pluripotencialidade e que diminuem a expressão dos genes germinativos. Porém, essas células tendem a se diferenciar em outros tecidos somáticos, mesmo com a adição de suplementos, fato também notado em CGEs humanas. / Primordial germ cells (PGCs) are known as the only cells capable of generating a new individual, they originate the gametes which then will transmit genetic material to future generations. Normally, the mammalian germ line is determined by genetic and epigenetic factors that have essential functions to guide the direction and development of PGCs as well as embryonic germ cells (EGCs). Epigenetic reprogramming is fundamental for the regulation of the genome during the development of the germ cells responsible for originating the gametogenic lineage in mammals. Methylation and demethylation in PGCs is a unique event, essential for erasing epigenetic memory and also preventing transmissions of epimutations to the next generation. Thus, the understanding of the patterns of differentiation of PGCs in EGCs can be important in identifying and correcting possible failures in these processes, which will be important in the future for development and reproductive performance. Most of the studies with PGCs in EGCs are carried out in mice, but this species is not always the best model of study when transposing this knowledge to humans. In canines, no study has ever been reported on canine PGCs and maybe the Canine species has become interesting as a new animal model for studies. It is known that the study material of human embryos are scarce samples and difficult to obtain, so it is necessary to use other animal models, such as the Canids, which also resemble humans. Dogs were the first fundamental models for the development of bone marrow transplantation in humans, but also made valuable contributions to the development of therapies for cardiovascular and orthopedic diseases. Then, it has become interesting to expand the studies on PGCs in the canine species in order to show the importance of different models that might resemble humans. Therefore, we had how proposal identify which were pluripotent, germinative and epigenetic markers that are important for the development of PGCs and canine EGCs. It research was divided into two phases: the first consists of the in vivo process, from the initial development of the embryo to the complete formation of the gonadal ridge. We analyzed through the techniques of real-time PCR (RT-qPCR) and immunofluorescence for pluripotent markers POU5F1 (OCT4) and NANOG, germline DDX4 (VASA), DAZL and DPPA3 (STELLA) and epigenetic 5mC, 5hmC, H3K27me3 and H3K9me2 were performed to create a profile of genes that are important for the development of canine PGCs. We proceeded to the second in vitro phase, which focuses on the derivation and characterization of canine EGCs. Alkaline Phosphatase (AP), immunofluorescence for the markers: pluripotent POU5F1 (OCT4), germinative DDX4 (VASA), DAZL and DPPA3 (STELLA), mesodermal THY-1 (CD90) and epigenetic 5mC, 5hmC, H3K27me3 and H3K9me2. We also analyzed RT-qPCR for NANOG and DDX4 genes and teratoma formation were performed to prove the EGCs cell lineage. As a result in vivo, different marking patterns and genes had been expressed in CGPs, proving that the canine species is more similar to humans than to mice. The in vitro results showed that it was possible to derive the EGCs and that they are able to retain their pluripotency and decrease the expression of the germinative genes. However, these cells continue to differentiate into other somatic tissues, even with the addition of supplements, a fact also noted in human CGEs.

As células germinativas primordiais (CGPs) são as precursoras dos gametas, capazes de gerar um novo indivíduo os quais transmitirão os materiais genéticos para as futuras gerações. Normalmente, a linha germinal de mamífero é determinada por fatores genéticos e epigenéticos que possuem funções essenciais para guiar na direção e desenvolvimento das CGPs, bem como das células germinativas embrionárias (CGEs). A reprogramação epigenética é fundamental para a regulação do genoma durante o desenvolvimento das células germinativas responsáveis por originar a linhagem gametogênica nos mamíferos. A metilação e desmetilação em CGPs são um evento único, essencial para apagar a memória epigenética e também prevenir transmissões de epimutações para a próxima geração. Assim, o completo entendimento das vias e mecanismos para a migração inicial e diferenciação destas células em CGEs podem ser importantes para identificar e corrigir falhas possíveis nesses processos, o que será importante, no futuro, para o desenvolvimento e desempenho reprodutivo. A maioria dos estudos com CGPs e CGEs é realizado em camundongos, porém nem sempre esta espécie torna-se o melhor modelo de estudo quando se quer transpor esses conhecimentos a humanos. O cão doméstico (Canis lúpus familiaris) apresenta-se como um modelo ideal para o estudo do desenvolvimento em mamíferos, pois possui inúmeras similaridades com a bioquímica, fisiologia e genética. Deste modo, torna-se interessante expandir os estudos sobre as CGPs e CGEs na espécie canina, a fim de mostrar a importância de diferentes modelos que se assemelham a seres humanos. Portanto, objetiva-se, nesta proposta, identificar qual é a dinâmica de marcadores pluripotentes, germinativos e epigenéticos que são importantes para o desenvolvimento das CGPs e CGEs caninas. Para tal procedimento, essa pesquisa foi dividida em duas fases: a primeira, consiste no processo in vivo, desde o desenvolvimento inicial do embrião até a completa formação da crista gônadal. Análises de RTq-PCR e imunofluorescência para marcadores pluripotentes POU5F1 (OCT4) e NANOG, germinativos DDX4 (VASA), DAZL e DPPA3 (STELLA) e epigenéticos 5mC, 5hmC, H3K27me3 e H3K9me2 foram realizados para criar um perfil de genes que são importantes para o desenvolvimento das CGPs caninas. Prosseguiu-se para a segunda fase in vitro, que incide na derivação e caracterização das CGEs caninas. Ensaios de Fosfatase Alcalina, imunofluorescência para os marcadores: pluripotente POU5F1 (OCT4), germinativos DDX4 (VASA), DAZL e DPPA3 (STELLA), mesodérmico THY-1 (CD90) e epigenéticos 5mC, 5hmC, H3K27me3 e H3K9me2, RT-qPCR para os genes NANOG e DDX4 e formação de teratoma foram efetivados para comprovar a linhagem de células CGEs. Como resultado in vivo, percebe-se que diferentes padrões de marcações e genes foram expressos nas CGPs, comprovando que a espécie canina se assemelha mais com os humanos do que com os camundongos. Os resultados in vitro mostraram que foi possível derivar as células CGEs e que estas conseguem reter sua pluripotencialidade e que diminuem a expressão dos genes germinativos. Porém, essas células tendem a se diferenciar em outros tecidos somáticos, mesmo com a adição de suplementos, fato também notado em CGEs humanas. / Primordial germ cells (PGCs) are known as the only cells capable of generating a new individual, they originate the gametes which then will transmit genetic material to future generations. Normally, the mammalian germ line is determined by genetic and epigenetic factors that have essential functions to guide the direction and development of PGCs as well as embryonic germ cells (EGCs). Epigenetic reprogramming is fundamental for the regulation of the genome during the development of the germ cells responsible for originating the gametogenic lineage in mammals. Methylation and demethylation in PGCs is a unique event, essential for erasing epigenetic memory and also preventing transmissions of epimutations to the next generation. Thus, the understanding of the patterns of differentiation of PGCs in EGCs can be important in identifying and correcting possible failures in these processes, which will be important in the future for development and reproductive performance. Most of the studies with PGCs in EGCs are carried out in mice, but this species is not always the best model of study when transposing this knowledge to humans. In canines, no study has ever been reported on canine PGCs and maybe the Canine species has become interesting as a new animal model for studies. It is known that the study material of human embryos are scarce samples and difficult to obtain, so it is necessary to use other animal models, such as the Canids, which also resemble humans. Dogs were the first fundamental models for the development of bone marrow transplantation in humans, but also made valuable contributions to the development of therapies for cardiovascular and orthopedic diseases. Then, it has become interesting to expand the studies on PGCs in the canine species in order to show the importance of different models that might resemble humans. Therefore, we had how proposal identify which were pluripotent, germinative and epigenetic markers that are important for the development of PGCs and canine EGCs. It research was divided into two phases: the first consists of the in vivo process, from the initial development of the embryo to the complete formation of the gonadal ridge. We analyzed through the techniques of real-time PCR (RT-qPCR) and immunofluorescence for pluripotent markers POU5F1 (OCT4) and NANOG, germline DDX4 (VASA), DAZL and DPPA3 (STELLA) and epigenetic 5mC, 5hmC, H3K27me3 and H3K9me2 were performed to create a profile of genes that are important for the development of canine PGCs. We proceeded to the second in vitro phase, which focuses on the derivation and characterization of canine EGCs. Alkaline Phosphatase (AP), immunofluorescence for the markers: pluripotent POU5F1 (OCT4), germinative DDX4 (VASA), DAZL and DPPA3 (STELLA), mesodermal THY-1 (CD90) and epigenetic 5mC, 5hmC, H3K27me3 and H3K9me2. We also analyzed RT-qPCR for NANOG and DDX4 genes and teratoma formation were performed to prove the EGCs cell lineage. As a result in vivo, different marking patterns and genes had been expressed in CGPs, proving that the canine species is more similar to humans than to mice. The in vitro results showed that it was possible to derive the EGCs and that they are able to retain their pluripotency and decrease the expression of the germinative genes. However, these cells continue to differentiate into other somatic tissues, even with the addition of supplements, a fact also noted in human CGEs.

Memoria para optar al Título Profesional de Médico Veterinario / El pollo (Gallus domesticus) es muy utilizado para el estudio de la embriología. La línea germinal compuesta por las células germinales primordiales (CGP) aparece en el embrión desde las 18 horas de incubación, la cuales comienzan a migrar dirigiéndose hacia el área ventromedial de la superficie del mesonefros, por medio de los vasos sanguíneos incipientes, pasando a ser parte fundamental del desarrollo de esta. Las hembras solo desarrollan la gónada izquierda mientras que la derecha degenera en el proceso de la embriogénesis, los machos desarrollan un par de gónadas igualmente funcionales, esto ocurre desde temprano en el desarrollo, (día 5). El proceso por el cual ocurre este fenómeno aun no esta claro , existiendo diversas teorías que lo explican, como hormonales, factores del crecimiento, entre otras, algunas muestran que el retroceso de la gónada derecha ocurre tempranamente en el desarrollo y otras de forma tardía como a los 17 días de incubación . El objetivo del presente trabajo fue conocer y describir etapas del desarrollo gonádico relacionadas a horas de incubación demostrativas de este proceso. Además de tratar de establecer una relación entre la llegada de células germinales a la futura gónada y su posterior desarrollo. El modelo experimental utilizado consistió en 30 huevos fértiles de pollo (Gallus domesticus), separados en 5 grupos de 6 huevos cada uno de acuerdo a horas de incubación, serán de 96 (grupo1) 120 (grupo2), 160 (grupo 3), 192 (grupo 4) y 208 horas de incubación (grupo5), de acuerdo a la tabla de Hamilton y Hamburger, a cada grupo se le realizaron dos tinciones: técnica histológica de hematoxilina eosina para identificar estructuras y la técnica histoquímica de PAS para identificar las CGP. Los resultados obtenidos indican que ya desde temprano en el desarrollo (Día 4) existe la tendencia de las células germinales de dirigirse hacia la cresta genital izquierda, independiente del futuro sexo del embrión, tendencia que se ve claramente hasta el establecimiento de la gónada ya diferenciada a partir del día 7 del desarrollo, donde en la gónada derecha de la hembra se encuentran una menor cantidad de células germinales y esta comienza a desaparecer. Además se observan asimetrías en otras estructuras como el mesogastrio que presenta un tejido mesenquimático muy laxo y con muchos espacios intercelulares al lado derecho y más denso al lado izquierdo. También el epitelio celómico presenta asimetrías en la altura de sus células, donde el esbozo gonádico derecho esta revestido por epitelio cúbico, mientras que el lado izquierdo presenta un epitelio cilíndrico. Esta tesis constituye un aporte al conocimiento de las asimetrías corporales de los cordados, y permite conocer el momento propicio (el día 6 de incubación) y el lugar adecuado (mesenterio dorsal) para el aislamiento de CGP y su posterior cultivo in Vitro, con los fines de obtener células pluripotenciales las cuáles presentan un interés para la investigación con fines productivos

Os transplantes de células germinativas e enxertos de testículo podem ser aplicados na reprodução de espécies comerciais e na conservação de espécies ameaçadas de extinção. No entanto, a maior limitação dos transplantes está na sua limitada eficiência, devido à baixa porcentagem de hospedeiros capazes de gerar gametas derivados do doador e da rejeição de enxertos de testículo alogênicos após poucas semanas de sua implantação. O sistema imunológico dos hospedeiros podem estar envolvidos na baixa de eficiência dos transplantes e na rejeição dos enxertos. Desta forma, este trabalho buscou verificar se a administração de drogas imunossupressoras como o tacrolimus e ciclosporina em emulsão poderiam ser utilizados para prolongar a viabilidade de enxertos de testículo em trutas arco-íris. Na primeira parte, experimentos in vitro com leucócitos do sangue periférico demonstraram que ambos o tacrolimus e a ciclosporina impedem a proliferação celular mesmo sob estímulo proliferativo da concanavalina. Nos ensaios in vivo, ambas as doses de tacrolimus (0,5 e 1,5 mg/kg) e a mais baixa de ciclosporina (20 mg/kg) inibiram significativamente a expressão de il2 no rim cefálico três dias após a injeção. Já a dose de 40 mg/kg de ciclosporina inibiu a expressão de il2 por até sete dias após a injeção. Na segunda parte, enxertos alogênicos de testículo foram realizados em animais tratados semanalmente com emulsões de tacrolimus. As análises histológicas (coloração H.E.) e as de RT-PCR (vasa e txdnc6) demonstraram a presença de espermatogônias na primeira semana e indicaram a presença de espermátides/espermatócitos na quinta semana, respectivamente, em alguns animais do grupo tratado com a dose de 0,5 mg/kg de tracrolimus. No grupo tratado com a dose mais alta de tacrolimus (1,5 mg/kg) e no grupo controle (sem imunossupressor), células germinativas ou marcadores destas não foram detectados. Estes resultados, portanto, fazem do tacrolimus um imunossupressor promissor para utilização em enxertos alogênicos e também em transplantes de células germinativas de truta arco-íris. A administração concomitante de um outro imunossupressor conjugado ao tacrolimus (na baixa dosagem) para inibir duas ou mais vias de ativação do sistema imunológico, conforme utilizado em transplantes de órgãos em humanos, pode ser uma alternativa para otimizar os efeitos imunossupressivos nos animais receptores. / Germ cell transplantation and testis graft can be applied for the reproduction of commercial or endangered species. However, mechanisms of rejection from the host immune system might limit the production of surrogate gametes and progeny after transplantation and induce rejection of testis allografts within few weeks. In this work, we aimed to administer immunosuppressants-containing emulsions in order to verify whether they are capable to prevent immune rejection and promote testis allograft survival in rainbow trout. In the first part of this study, it was demonstrated in vitro that tacrolimus and cyclosporine were able to inhibit leucocyte proliferation even under concanavalin-induced mitotic stimulation. In in vivo experiments, both dosage of tacrolimus (0,5 and 1,5 mg/kg) and a lower of cyclosporine (20 mg/kg) inhibited significantly the expression of il2 in head kidney at three days post-injection. A higher dosage of cyclosporine (40 mg/kg) was able to inhibit il2 expression for up to seven days post-injection. In the second part, testis allografts were conducted in fish treated weekly with tacrolimus-containing emulsions. Histological (H.E. staining) and RT-PCR (vasa and txdnc6) analysis demonstrated the presence of spermatogonias in the first week and indicated the presence of spermatids/spermatocytes in the fifth week, respectively, in some animals treated with 0,5 mg/kg of tacrolimus. In the group treated with the highest tacrolimus dose (1,5 mg/kg) and in the control group (without immunosupressant), no germ cells or their respective markers were detected. These results suggest that tacrolimus comprise a promising immunosuppressant, with applications to testis allografts or germ cell transplantation in rainbow trout. Co-administration combining tacrolimus (at lower dose) with other immunosuppressive drugs for inhibiting more than two activation pathways of the immune system, as done in human organ transplantation, can be an alternative to optimize the immunossupressive effects in host organisms.

Cerca de 10% dos casos de câncer de mama e/ou ovário são caracterizados como hereditários, onde a presença de mutações germinativas no gene de suscetibilidade BRCA1 aumenta o risco de desenvolver esses cânceres durante a vida da mulher. O BRCA1 é um gene supressor tumoral envolvido na resposta de danos ao DNA, controle do ciclo celular, na remodelação da cromatina, ubiquitinação e regulação da transcrição. O presente estudo tem como objetivo central caracterizar as mutações do gene BRCA1 associadas a Síndrome Hereditária do Câncer de Mama e/ou Ovário (HBOC) em pacientes atendidos no Serviço de Aconselhamento Genético do Câncer do Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto da Universidade de São Paulo (HCFMRP/USP). Os vinte e dois éxons codificantes do BRCA1 foram analisados utilizando o método de High Resolution Melting (HRM) para triagem de mutações pontuais, seguido pelo sequenciamento de DNA dos casos selecionados para validação. A técnica de MLPA (Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification) também foi usada para detectar grandes deleções e duplicações. Uma vez confirmada a mutação, membros da família considerados de alto risco, serão investigados para a mutação específica, a fim de proporcionar-lhes um aconselhamento genético apropriado para a detecção precoce do câncer. No presente estudo, foram investigados 41 pacientes que preencheram os critérios para o teste genético de acordo com NCCN Clinical Practice Guidelines in Oncology v.1.2010. Um total de 21 mutações foram identificadas, duas das quais são patogênicas: a deleção dos éxons 17-18 e a deleção dos éxon 19. Ambas estão localizadas no domínio BRCT do gene BRCA1, essencial para a ligação de fosfoproteínas críticas para a ativação do complexo de reparo do DNA. Outra mutação, a S616del, foi tratada como patogênica, mas apresenta informações controversas em diferentes estudos. O trabalho também identificou uma nova mutação, Val1117Ile. Um estudo de haplótipos das mutações identificadas nos pacientes foi realizado e revelou que um dos haplótipos, denominado de 6, contendo quatro resíduos mutados (871Leu, 1038Gly, 1183Arg e 1613Gly) estava presente em 50% das pacientes. O estudo de associação com 82 indivíduos saudáveis, mostrou diferença significativa (p=0,026) nos pacientes, sugerindo assim um risco aumentado de HBOC. Adicionalmente, foi analisada a mutação germinativa R337H no gene p53 para os casos suspeitos de Síndrome de Li-Fraumeni. Em síntese, o presente estudo contribui com a identificação de uma nova mutação não-sinônina no gene BRCA1 e sugere que o haplótipo 871Leu-1038Gly-1183Arg-1613Gly possa conferir risco aumentado do câncer de mama e/ou ovário em pacientes diagnosticados com HBOC. / About 10% of cases of breast and/or ovary cancer are characterized as hereditary, where the presence of germline mutations in susceptibility BRCA1 gene increases the risk of developing these cancers during womans lifetime. BRCA1 is a tumor suppressor gene involved in DNA damage response, cell cycle control, chromatin remodeling, ubiquitination and transcriptional regulation. The present study aims to characterize BRCA1 gene mutations associated with Hereditary Breast/Ovary Cancer Syndrome (HBOC) in patients from the Cancer Genetic Counseling Service of the General Hospital of the Medical School of Ribeirão Preto, University of São Paulo (HCFMRP-USP). The twenty two coding exons of BRCA1 were analyzed using High Resolution Melting (HRM) method for the screening of point mutations, followed by DNA sequencing of the cases selected to validation. MLPA (Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification) technique was also used to detect gross deletions and duplications. Once confirmed the mutation, family members most at risk will be analyzed for the specific mutation in order to provide them with an appropriate genetic counseling for early detection of cancer. In the present study, we investigated 41 patients that fulfilled the criteria for genetic testing according to NCCN Clinical Practice Guidelines in Oncology v.1.2010. A total of 21 mutations were identified, two of them are pathogenic: a deletion of exons 17-18 and a deletion of exon 19. Both of them are located in the BRCT domain of BRCA1 gene, impairing the binding of essential phosphoproteins critical to the activation of DNA repair complex. Another mutation, S616del, shows controversial information about its pathogenesis in different studies.The present study also describes a new mutation, Val1117Ile. A study of haplotypes of the mutations identified in patients was performed and revealed that one of the haplotypes, called 6, containing four mutated residues (871Leu, 1038Gly, and 1183Arg 1613Gly) was present in 50% of patients. The association study with 82 healthy subjects showed a significant difference (p = 0.026) in patients, thus suggesting an increased risk for HBOC. Additionally, the germline mutation R337H on p53 gene was also analyzed in the present study for suspected cases of Li-Fraumeni Syndrome. In summary, this study contributes to the identification of a new missense mutation in the BRCA1 gene and suggests that the haplotype-871Leu-1038Gly 1183Arg-1613Gly may confer increased risk of breast cancer and / or ovarian cancer in patients diagnosed with HBOC.

Introdução: a alta prevalência do câncer e o aumento significativo da sobrevivência em longo prazo geraram interesse quanto à preservação da fertilidade em mulheres jovens expostas a quimioterapia e radioterapia. Neste sentido estudos de congelamento de tecido ovariano para posterior transplante, abriram uma nova perspectiva de aplicação no tratamento e prevenção da infertilidade feminina. Objetivos: comparar dois protocolos de congelamento de tecido ovariano, um lento não automatizado e um por vitrificação, com o intuito de avaliar a viabilidade dos tecidos para posterior transplante autólogo. Método: Foram utilizadas 30 camundongos fêmea CF1 com aproximadamente 8 semanas e pesando 29,29g±2,9. •Os ovários extraídos foram vitrificados ou congelados, mantidos em nitrogênio líquido por 30 dias e descongelados. Após o descongelamento, o ovário esquerdo foi destinado às análises histológicas e caracterização por imuno histoquímica para o marcador mouse vasa homologue (MVH) e o ovário direito foi utilizado para os testes de viabilidade celular com exclusão por azul de trypan. Resultados: Nas análises de Hematoxilina e Eosina (HE) foram contados folículos primordiais, primários, pré-antrais e antrais. Não houve diferença significativa na proporção de folículos primordiais, primários e pré-antrais após descongelamento entre os grupos testados. A contagem de folículos antrais foi significativamente maior no grupo de vitrificação (p = 0,004). No ensaio de imunohistoquímica para o marcador MVH, folículos MVH + e MVH- foram contados e comparados com o número total de folículos. O grupo congelamento lento apresentou maior número de células não marcadas (p = 0,012). Conclusão: Embora ambos os protocolos tenham apresentado resultados semelhantes na análise histológica das contagens foliculares, o protocolo de vitrificação foi significativamente melhor para preservar a população de células tronco ovarianas. / Introduction: The high prevalence of cancer and the significant increase in long-term survival have generated interest as the preservation of fertility in young women exposed to chemotherapy and radiotherapy. Experimental techniques have been tried in an attempt to reverse the ovarian failure induced by these treatments. In this regard studies of ovarian tissue freezing for subsequent transplantation disclose a new application perspective in the treatment and prevention of female infertility. Objective: two ovarian tissue freezing protocols were tested, a non-automated slow-freezing and by vitrification, in order to assess the viability of the tissues for subsequent autologous transplantation. Methods: as ovaries donors, were used 30 female CF1 mice approximately 8 weeks and weighing 29,29g±2,9. • The ovaries were vitrified or frozen, stored in liquid nitrogen for 30 days and thawed. After thawing, the left ovary was intended for histological and immunohistochemical characterization by histochemical marker for MVH and right ovary was used for the tests with cell viability by trypan blue exclusion. Results: In HE slides was counting primordial, primary, pre antral and antral follicles. No significant difference was found in the proportion of high-quality primordial, primary and pre antral follicles after thawing/warming in the slow-freezing and vitrification group, respectively. The antral follicle counting was significant higher in vitrification group (p=0,004). In immunohistochemistry assay for MVH Antibody , MVH+ and MVH- follicles were counted and compared with the total number of follicles and slow freeze group had a higher number of not marked cells (p=0,012). Conclusion: Although both protocols showed similar results in the histological analysis for follicular counts, the vitrification protocol was significantly better for preserve the ovarian stem cell population.

Orientador: Classius de Oliveira / Banca: Rosicleire Verissimo Silveira / Banca: Sebastião Roberto Taboga / Resumo: O declínio das populações de anfíbios é um problema global com causas complexas. Atualmente há uma grande preocupação sobre os efeitos provocados por compostos que atuam como desreguladores endócrinos nos sistemas naturais. Os estrogênios são os principais contaminantes encontrados em corpos d'água e são responsáveis por causar uma série de distúrbios, principalmente ligados aos aspectos reprodutivos. O hormônio feminino 17β-estradiol é um potente contaminante que prevalece em águas superficiais, provenientes principalmente de efluentes municipais e industriais. É o hormônio responsável pela formação das características femininas, comportamento sexual e ovulação. Este estudo mostra o efeito do 17β-estradiol na gametogênese dos órgãos de Bidder e testículos e na resposta hepática de machos de Rhinella schneideri. Foram utilizados 40 machos adultos e analisada a gametogênese dos testículos e órgão de Bidder, além da avaliação da pigmentação hepática. Os animais foram tratados com 17β-estradiol durante 3, 7, (efeito de curto prazo) 15 e 30 (efeito de exposição prolongada) dias, utilizando injeções subcutâneas de 2mg/kg em dias alternados. Análises histoquímicas também foram realizadas para os três órgãos. Os resultados mostraram que o 17β-estradiol promoveu alterações tanto na espermatogênese, quanto na ovogênese bidderiana. Os tratamentos de curto prazo acarretaram em uma diminuição na quantidade de espermatozoides liberados no lume e um desequilíbrio na ocorrência de células iniciais da espermatogênese. Os tratamentos de exposição prolongada acarretaram principalmente na diminuição dos lóculos seminíferos e aumento na região intersticial, além da alteração de alguns tipos celulares como espermatogônias, espermatócitos e espermátides alongadas. Para o órgão de Bidder... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Amphibian's populations decline is a global problem with complex causes. Currently, it is known that this decline is related to endocrine disruptors compounds in natural systems. Estrogens are the main compounds found in water bodies and are responsible for causing a number of disturbances, mainly linked to reproductive aspects. The female hormone 17β-estradiol is a potent organic contaminant that prevails in surface waters, mainly disposed by municipal and industrial effluents. This hormone induces the formation of feminine characteristics, sexual behavior and ovulation. In this study, we describe the effect of 17β-estradiol in the gametogenesis of the Bidder's organ and testes, beyond the liver response in males of Rhinella schneideri. We collected 40 adult males and analyzed the testis and the Bidder's organ gametogenesis and the liver pigmentation. The animals were treated with 17β-estradiol for 3, 7, (short effect) 15 and 30 (extended effect) days, by subcutaneous injection of 2mg/kg on alternate days. Histochemical analyzes were also performed for the three organs. The results showed that 17β-estradiol promoted changes in spermatogenesis and in bidderian oogenesis. Short-treatments resulted in a decrease in the quantity of spermatozoa in the lume and an imbalance in the occurrence of initial cells of spermatogenesis. Long-treatments resulted in a decreased of the seminiferous locules and increased of the interstitial area, besides the alteration of some cell types, such as spermatogonias, spermatocytes and elongated spermatids. In the Bidder's organ, the short-treatment resulted in increased of the young follicles and degeneration oocytes, establishing a possible renewal of female cells. The treatment of 15 days decreased the amount of degenerating oocytes and increased late follicles. After 30 days of treatment were... (Complete abstract click electronic access below) / Mestre

Orientador: Alexandre Ninhaus Silveira / Banca: George Shigueki Yasui / Banca: Maria Angélica Spadella / Banca: Rafael Henrique Nóbrega / Banca: Carlos Alberto Vicentini / Resumo: O transplante de células germinativas é uma recente abordagem experimental que envolve a remoção de células germinativas indiferenciadas das gônadas de um animal doador, e transplante nas gônadas de um receptor originando espermatozoides com características genéticas do doador. Apesar de ser promissora em estudos que envolvem a biologia das células germinativas iniciais, preservação de espécies ameaçadas, biologia da reprodução e muitas outras abordagens biotecnológicas, a aplicação desta metodologia em peixes ainda é limitada. Deste modo, o transplante de células espermatogoniais de duas espécies filogeneticamente relacionadas, a piracanjuba Brycon orbignyanus em lambaris Astyanax altiparanae foi estudada. Para isto, a espermatogênese e a papila urogenital (via do transplante) da espécie receptora foram histologicamente analisadas, evidenciando a presença de nove gerações espermatogoniais e que a cada célula de Sertoli suporta o desenvolvimento de cerca de 140 espermátides. Além disso, a papila urogenital difere entre os sexos. Para o transplante, os testículos das piracanjuba foram enzimaticamente digeridos e as espermatogônias foram purificadas por um gradiente de densidade (Percoll), marcadas com PKH26, e injetadas, via papila urogenital, nos testículos dos lambaris, cuja espermatogênese endógena foi previamente suprimida por administração de busulfan (Myleran) associado com água quente (35°C) ou por sua manutenção nesta temperatura por um período maior. Cerca de 66,7% e 84,6% dos receptores tratados com busulfan + temperatura e somente temperatura, respectivamente, apresentaram cistos de células germinativas doadoras em seu epitélio. O transplante espermatogonial envolvendo B. orbignyanus e A. altiparanae foi realizado com sucesso e pode ser aplicado em pisciculturas auxiliando no aumento da produção e preservação da piracanjuba (criticamente ameaçada... / Abstract: Germ cell transplantation is a recent approach which involves removal of undifferentiated germ cells from the donor gonads and transplantation into the gonads of a host, giving origin to sperm with genetic characteristics from the donor. Despite this methodology promising in studies involving initial germ cell biology, preservation of threatened species, reproductive biology and many other biotechnological approaches, the application of such a methodology in fish is still limited. Thus, the transplantation of spermatogonial cells from two phylogenetically related species "piracanjuba" Brycon orbignyanus into "lambaris" Astyanax altiparanae testis was histologically studied. Host spermatogenesis and urogenital papilla (transplantation via) were analyzed, highlighting nine spermatogonial generations and that each Sertoli cell supports the development of about 140 spermatids. Moreover, urogenital papilla is different between the sexes. For transplantation, piracanjuba's testes were enzymatic digested and spermatogonia were purified by a density gradient (Percoll), labeled with PKH26 and injected, through urogenital papilla, into "lambaris" testes, whose endogenous spermatogenesis had been previously suppressed by administration ofbusulfan (Myleran) associated with warm water (35°C) or by their maintenance at this temperature for longer time. About 66.67% and 84.6% of the host animals treated with busulfan + temperature and only temperature, respectively, presented cysts of donor germ cells into their epithelium. Spermatogonial transplantation involving B. orbignyanus and A. altiparanae was successfully performed and it can be applied in fish farms helping production increase and preservation of donor species "piracanjuba" (critically endangered), since donor spermatozoon can be obtained up to three weeks after transplantation process / Doutor