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A feature of neoplastic cells is that mutations in the key intermediates of TGF-β signaling contribute to the loss of sensitivity to its anti-tumor effects. The role of SMAD3 and SMAD4 germline mutations in breast cancer predisposition is currently unclear. To address this, mutation analysis of the Mad-Homology 2 domains in 408 breast cancer cases and 710 controls recruited by the Breast Cancer Family Registry (BCFR) was performed using Denaturing High-Pressure Liquid Chromatography. This study identified 23 distinct intronic variants, and three coding variants c.1214T>C, c.1478G>A, and c.1701A>G in SMAD4. No aberrant splicing was observed, but qPCR analysis and tissue expression data showed significantly elevated SMAD3 expression relative to controls (p<0.05). For SMAD4, c.1478G>A from a familial breast cancer case showed a 5-fold expression change. Taken together, inactivating alterations are not driving tumorigenesis. Rather, aberrant germline expression provides novel insight into SMAD3 and SMAD4’s roles in breast cancer predisposition.

A feature of neoplastic cells is that mutations in the key intermediates of TGF-β signaling contribute to the loss of sensitivity to its anti-tumor effects. The role of SMAD3 and SMAD4 germline mutations in breast cancer predisposition is currently unclear. To address this, mutation analysis of the Mad-Homology 2 domains in 408 breast cancer cases and 710 controls recruited by the Breast Cancer Family Registry (BCFR) was performed using Denaturing High-Pressure Liquid Chromatography. This study identified 23 distinct intronic variants, and three coding variants c.1214T>C, c.1478G>A, and c.1701A>G in SMAD4. No aberrant splicing was observed, but qPCR analysis and tissue expression data showed significantly elevated SMAD3 expression relative to controls (p<0.05). For SMAD4, c.1478G>A from a familial breast cancer case showed a 5-fold expression change. Taken together, inactivating alterations are not driving tumorigenesis. Rather, aberrant germline expression provides novel insight into SMAD3 and SMAD4’s roles in breast cancer predisposition.

Cerca de 10% dos casos de câncer de mama e/ou ovário são caracterizados como hereditários, onde a presença de mutações germinativas no gene de suscetibilidade BRCA1 aumenta o risco de desenvolver esses cânceres durante a vida da mulher. O BRCA1 é um gene supressor tumoral envolvido na resposta de danos ao DNA, controle do ciclo celular, na remodelação da cromatina, ubiquitinação e regulação da transcrição. O presente estudo tem como objetivo central caracterizar as mutações do gene BRCA1 associadas a Síndrome Hereditária do Câncer de Mama e/ou Ovário (HBOC) em pacientes atendidos no Serviço de Aconselhamento Genético do Câncer do Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto da Universidade de São Paulo (HCFMRP/USP). Os vinte e dois éxons codificantes do BRCA1 foram analisados utilizando o método de High Resolution Melting (HRM) para triagem de mutações pontuais, seguido pelo sequenciamento de DNA dos casos selecionados para validação. A técnica de MLPA (Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification) também foi usada para detectar grandes deleções e duplicações. Uma vez confirmada a mutação, membros da família considerados de alto risco, serão investigados para a mutação específica, a fim de proporcionar-lhes um aconselhamento genético apropriado para a detecção precoce do câncer. No presente estudo, foram investigados 41 pacientes que preencheram os critérios para o teste genético de acordo com NCCN Clinical Practice Guidelines in Oncology v.1.2010. Um total de 21 mutações foram identificadas, duas das quais são patogênicas: a deleção dos éxons 17-18 e a deleção dos éxon 19. Ambas estão localizadas no domínio BRCT do gene BRCA1, essencial para a ligação de fosfoproteínas críticas para a ativação do complexo de reparo do DNA. Outra mutação, a S616del, foi tratada como patogênica, mas apresenta informações controversas em diferentes estudos. O trabalho também identificou uma nova mutação, Val1117Ile. Um estudo de haplótipos das mutações identificadas nos pacientes foi realizado e revelou que um dos haplótipos, denominado de 6, contendo quatro resíduos mutados (871Leu, 1038Gly, 1183Arg e 1613Gly) estava presente em 50% das pacientes. O estudo de associação com 82 indivíduos saudáveis, mostrou diferença significativa (p=0,026) nos pacientes, sugerindo assim um risco aumentado de HBOC. Adicionalmente, foi analisada a mutação germinativa R337H no gene p53 para os casos suspeitos de Síndrome de Li-Fraumeni. Em síntese, o presente estudo contribui com a identificação de uma nova mutação não-sinônina no gene BRCA1 e sugere que o haplótipo 871Leu-1038Gly-1183Arg-1613Gly possa conferir risco aumentado do câncer de mama e/ou ovário em pacientes diagnosticados com HBOC. / About 10% of cases of breast and/or ovary cancer are characterized as hereditary, where the presence of germline mutations in susceptibility BRCA1 gene increases the risk of developing these cancers during womans lifetime. BRCA1 is a tumor suppressor gene involved in DNA damage response, cell cycle control, chromatin remodeling, ubiquitination and transcriptional regulation. The present study aims to characterize BRCA1 gene mutations associated with Hereditary Breast/Ovary Cancer Syndrome (HBOC) in patients from the Cancer Genetic Counseling Service of the General Hospital of the Medical School of Ribeirão Preto, University of São Paulo (HCFMRP-USP). The twenty two coding exons of BRCA1 were analyzed using High Resolution Melting (HRM) method for the screening of point mutations, followed by DNA sequencing of the cases selected to validation. MLPA (Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification) technique was also used to detect gross deletions and duplications. Once confirmed the mutation, family members most at risk will be analyzed for the specific mutation in order to provide them with an appropriate genetic counseling for early detection of cancer. In the present study, we investigated 41 patients that fulfilled the criteria for genetic testing according to NCCN Clinical Practice Guidelines in Oncology v.1.2010. A total of 21 mutations were identified, two of them are pathogenic: a deletion of exons 17-18 and a deletion of exon 19. Both of them are located in the BRCT domain of BRCA1 gene, impairing the binding of essential phosphoproteins critical to the activation of DNA repair complex. Another mutation, S616del, shows controversial information about its pathogenesis in different studies.The present study also describes a new mutation, Val1117Ile. A study of haplotypes of the mutations identified in patients was performed and revealed that one of the haplotypes, called 6, containing four mutated residues (871Leu, 1038Gly, and 1183Arg 1613Gly) was present in 50% of patients. The association study with 82 healthy subjects showed a significant difference (p = 0.026) in patients, thus suggesting an increased risk for HBOC. Additionally, the germline mutation R337H on p53 gene was also analyzed in the present study for suspected cases of Li-Fraumeni Syndrome. In summary, this study contributes to the identification of a new missense mutation in the BRCA1 gene and suggests that the haplotype-871Leu-1038Gly 1183Arg-1613Gly may confer increased risk of breast cancer and / or ovarian cancer in patients diagnosed with HBOC.

Cerca de 10% dos casos de câncer de mama e/ou ovário são caracterizados como hereditários, onde a presença de mutações germinativas no gene de suscetibilidade BRCA1 aumenta o risco de desenvolver esses cânceres durante a vida da mulher. O BRCA1 é um gene supressor tumoral envolvido na resposta de danos ao DNA, controle do ciclo celular, na remodelação da cromatina, ubiquitinação e regulação da transcrição. O presente estudo tem como objetivo central caracterizar as mutações do gene BRCA1 associadas a Síndrome Hereditária do Câncer de Mama e/ou Ovário (HBOC) em pacientes atendidos no Serviço de Aconselhamento Genético do Câncer do Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto da Universidade de São Paulo (HCFMRP/USP). Os vinte e dois éxons codificantes do BRCA1 foram analisados utilizando o método de High Resolution Melting (HRM) para triagem de mutações pontuais, seguido pelo sequenciamento de DNA dos casos selecionados para validação. A técnica de MLPA (Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification) também foi usada para detectar grandes deleções e duplicações. Uma vez confirmada a mutação, membros da família considerados de alto risco, serão investigados para a mutação específica, a fim de proporcionar-lhes um aconselhamento genético apropriado para a detecção precoce do câncer. No presente estudo, foram investigados 41 pacientes que preencheram os critérios para o teste genético de acordo com NCCN Clinical Practice Guidelines in Oncology v.1.2010. Um total de 21 mutações foram identificadas, duas das quais são patogênicas: a deleção dos éxons 17-18 e a deleção dos éxon 19. Ambas estão localizadas no domínio BRCT do gene BRCA1, essencial para a ligação de fosfoproteínas críticas para a ativação do complexo de reparo do DNA. Outra mutação, a S616del, foi tratada como patogênica, mas apresenta informações controversas em diferentes estudos. O trabalho também identificou uma nova mutação, Val1117Ile. Um estudo de haplótipos das mutações identificadas nos pacientes foi realizado e revelou que um dos haplótipos, denominado de 6, contendo quatro resíduos mutados (871Leu, 1038Gly, 1183Arg e 1613Gly) estava presente em 50% das pacientes. O estudo de associação com 82 indivíduos saudáveis, mostrou diferença significativa (p=0,026) nos pacientes, sugerindo assim um risco aumentado de HBOC. Adicionalmente, foi analisada a mutação germinativa R337H no gene p53 para os casos suspeitos de Síndrome de Li-Fraumeni. Em síntese, o presente estudo contribui com a identificação de uma nova mutação não-sinônina no gene BRCA1 e sugere que o haplótipo 871Leu-1038Gly-1183Arg-1613Gly possa conferir risco aumentado do câncer de mama e/ou ovário em pacientes diagnosticados com HBOC. / About 10% of cases of breast and/or ovary cancer are characterized as hereditary, where the presence of germline mutations in susceptibility BRCA1 gene increases the risk of developing these cancers during womans lifetime. BRCA1 is a tumor suppressor gene involved in DNA damage response, cell cycle control, chromatin remodeling, ubiquitination and transcriptional regulation. The present study aims to characterize BRCA1 gene mutations associated with Hereditary Breast/Ovary Cancer Syndrome (HBOC) in patients from the Cancer Genetic Counseling Service of the General Hospital of the Medical School of Ribeirão Preto, University of São Paulo (HCFMRP-USP). The twenty two coding exons of BRCA1 were analyzed using High Resolution Melting (HRM) method for the screening of point mutations, followed by DNA sequencing of the cases selected to validation. MLPA (Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification) technique was also used to detect gross deletions and duplications. Once confirmed the mutation, family members most at risk will be analyzed for the specific mutation in order to provide them with an appropriate genetic counseling for early detection of cancer. In the present study, we investigated 41 patients that fulfilled the criteria for genetic testing according to NCCN Clinical Practice Guidelines in Oncology v.1.2010. A total of 21 mutations were identified, two of them are pathogenic: a deletion of exons 17-18 and a deletion of exon 19. Both of them are located in the BRCT domain of BRCA1 gene, impairing the binding of essential phosphoproteins critical to the activation of DNA repair complex. Another mutation, S616del, shows controversial information about its pathogenesis in different studies.The present study also describes a new mutation, Val1117Ile. A study of haplotypes of the mutations identified in patients was performed and revealed that one of the haplotypes, called 6, containing four mutated residues (871Leu, 1038Gly, and 1183Arg 1613Gly) was present in 50% of patients. The association study with 82 healthy subjects showed a significant difference (p = 0.026) in patients, thus suggesting an increased risk for HBOC. Additionally, the germline mutation R337H on p53 gene was also analyzed in the present study for suspected cases of Li-Fraumeni Syndrome. In summary, this study contributes to the identification of a new missense mutation in the BRCA1 gene and suggests that the haplotype-871Leu-1038Gly 1183Arg-1613Gly may confer increased risk of breast cancer and / or ovarian cancer in patients diagnosed with HBOC.

A doença de von Hippel-Lindau (VHL) é uma síndrome de câncer familial herdada de forma autossômica dominante que predispõe ao desenvolvimento de diversos tipos de neoplasias benignas e malignas. É causada por mutações germinativas e somáticas no gene VHL e tem uma incidência aproximada de um a cada 36.000 nascimentos. O gene VHL é um supressor tumoral e codifica a proteína VHL, a qual possui, entre outras funções, uma atividade ubiquitina-ligase, responsável pela poliubiquitinização e degradação proteassômica da subunidade alfa do fator induzido por hipóxia (HIF) na presença de oxigênio. As principais características da doença de VHL são: hemangioblastomas de sistema nervoso central (SNC), principalmente do cerebelo e medula espinhal; angiomas de retina e carcinoma renal de células claras. A probabilidade de desenvolver cada um desses tumores ao longo da vida é estimada em maior que 70%, podendo manifestar-se desde a infância até a fase adulta, principalmente entre a 2ª e 3ª décadas de vida. Classifica-se a doença de VHL conforme a ausência (tipo 1) ou presença de feocromocitoma (tipo 2). A doença do tipo 2 é causada, essencialmente, por mutações missense no gene VHL. As mutações podem ser grandes deleções (20%) ou pontuais (80%) do tipo missense, frameshift, nonsense ou em regiões de splicing. O teste genético é considerado padrão para o manejo clínico dos pacientes e dos familiares em risco, pois permite o diagnóstico e o tratamento precoce das neoplasias, melhorando assim a expectativa de vida. Técnicas de biologia molecular, como o seqüenciamento direto do DNA e o Southern blotting quantitativo, permitem a detecção de mutações germinativas em até 100% dos casos. Técnicas mais recentes, como o PCR quantitativo em tempo real e o MLPA, têm sido empregadas para uma detecção mais eficaz de grandes deleções no gene VHL. Os objetivos do presente estudo foram: (1) diagnosticar os pacientes com suspeita da doença de VHL; (2) identificar e caracterizar mutações germinativas pontuais no gene VHL nos pacientes e em seus parentes de 1º grau; (3) fornecer o aconselhamento genético pré e pós-teste. Dos 37 indivíduos com suspeita da doença de VHL, 14 pacientes de sete famílias diferentes preencheram os critérios diagnósticos. Um paciente apresentou hemangioblastoma cerebelar isolado e sete parentes de 1º grau estavam assintomáticos. Foram realizadas as técnicas de PCR, RFLP e seqüenciamento direto do DNA genômico e após clonagem. Foram identificadas quatro mutações pontuais na região codificadora do gene VHL em quatro famílias diferentes, sendo que duas delas haviam sido descritas na literatura [c.226_228delTTC (F76del), c.217C>T (Q73X)]. As outras duas mutações são descritas pela primeira vez neste estudo e afetam o sitio de splicing (IVS1-1 G>A, IVS2-1 G>C). É provável que as demais três famílias sejam portadoras de deleções germinativas no gene VHL. Em resumo, os resultados apresentados neste estudo ampliam o conhecimento da base molecular da doença de VHL e consiste na primeira pesquisa de pós-graduação produzida pelo ambulatório de aconselhamento genético do câncer do HCFMRP-USP. / Von Hippel-Lindau disease (VHL) is an autosomal dominant hereditary cancer syndrome that predisposes to the development of a variety of benign and malignant tumors. VHL is caused by germline and somatic mutations in the VHL gene and it has an incidence of approximately one in 36,000 livebirths. The VHL gene is a tumor suppressor that is translated into the VHL protein, which has many functions, mainly an ubiquitin-ligase activity, responsible for the polyubiquitylation and proteasomal degradation of the alpha subunit of the hipoxia-inducible factor (HIF) in the presence of oxygen. The main clinical features of VHL are: CNS hemangioblastomas, especially of the cerebellum and spinal cord; retinal angiomas and clear-cell renal carcinomas. The lifetime probability of developing one of these tumors is estimated at more than 70%, whichever may present since childhood until adulthood, more often during the 2nd and 3rd decades. VHL is classified into type 1 (without pheochromocytoma) and type 2 (with pheochromocytoma), the latter being mainly caused by missense mutations. VHL germline mutations may be rearrangements and large deletions (~20%) or point mutations (~80%), such as missense, frameshift, nonsense or in the splicing sites. VHL gene testing is considered standard for the clinical manegement of patients and relatives at risk, whereby it provides early diagnosis and treatment of tumors, improving their life expectancies. Molecular biology techniques such as sequencing and quantitative Southern blotting may detect virtually 100% of VHL germline mutations. More recent methods, such as quantitative real-time PCR and MLPA, have been shown to detect VHL gene gross deletions efficiently. The objectives of this study were: (1) to diagnose patients with VHL clinically; (2) to detect germline point mutations in the VHL gene in the patients and their close relatives at risk; (3) to provide pre and post-testing genetic counseling. Fourteen out of 37 patients from seven unrelated families fulfilled the VHL clinical diagnostic criteria, one patient presented a single cerebellar hemangioblastoma and seven at-risk relatives were still asymptomatic. The methods included: PCR, RFLP, genomic DNA direct sequencing and after cloning. Four germline point mutations in the coding region of the VHL gene were identified, two of whom had been described in literature [c.226_228delTTC (p.F76del), c.217C>T (p.Q73X)]. The other two mutations had not been described so far and affect the splicing sites (IVS1-1 G>A, IVS2-1 G>C). The other three families may carry gross germline deletions in the VHL gene. In conclusion, the outcome presented in this study provides with a greater knowledge of molecular basis of VHL disease and relies on the first post-graduation research carried out at the HCFMRP-USP cancer genetic counseling service.

A doença de von Hippel-Lindau (VHL) é uma síndrome de câncer familial herdada de forma autossômica dominante que predispõe ao desenvolvimento de diversos tipos de neoplasias benignas e malignas. É causada por mutações germinativas e somáticas no gene VHL e tem uma incidência aproximada de um a cada 36.000 nascimentos. O gene VHL é um supressor tumoral e codifica a proteína VHL, a qual possui, entre outras funções, uma atividade ubiquitina-ligase, responsável pela poliubiquitinização e degradação proteassômica da subunidade alfa do fator induzido por hipóxia (HIF) na presença de oxigênio. As principais características da doença de VHL são: hemangioblastomas de sistema nervoso central (SNC), principalmente do cerebelo e medula espinhal; angiomas de retina e carcinoma renal de células claras. A probabilidade de desenvolver cada um desses tumores ao longo da vida é estimada em maior que 70%, podendo manifestar-se desde a infância até a fase adulta, principalmente entre a 2ª e 3ª décadas de vida. Classifica-se a doença de VHL conforme a ausência (tipo 1) ou presença de feocromocitoma (tipo 2). A doença do tipo 2 é causada, essencialmente, por mutações missense no gene VHL. As mutações podem ser grandes deleções (20%) ou pontuais (80%) do tipo missense, frameshift, nonsense ou em regiões de splicing. O teste genético é considerado padrão para o manejo clínico dos pacientes e dos familiares em risco, pois permite o diagnóstico e o tratamento precoce das neoplasias, melhorando assim a expectativa de vida. Técnicas de biologia molecular, como o seqüenciamento direto do DNA e o Southern blotting quantitativo, permitem a detecção de mutações germinativas em até 100% dos casos. Técnicas mais recentes, como o PCR quantitativo em tempo real e o MLPA, têm sido empregadas para uma detecção mais eficaz de grandes deleções no gene VHL. Os objetivos do presente estudo foram: (1) diagnosticar os pacientes com suspeita da doença de VHL; (2) identificar e caracterizar mutações germinativas pontuais no gene VHL nos pacientes e em seus parentes de 1º grau; (3) fornecer o aconselhamento genético pré e pós-teste. Dos 37 indivíduos com suspeita da doença de VHL, 14 pacientes de sete famílias diferentes preencheram os critérios diagnósticos. Um paciente apresentou hemangioblastoma cerebelar isolado e sete parentes de 1º grau estavam assintomáticos. Foram realizadas as técnicas de PCR, RFLP e seqüenciamento direto do DNA genômico e após clonagem. Foram identificadas quatro mutações pontuais na região codificadora do gene VHL em quatro famílias diferentes, sendo que duas delas haviam sido descritas na literatura [c.226_228delTTC (F76del), c.217C>T (Q73X)]. As outras duas mutações são descritas pela primeira vez neste estudo e afetam o sitio de splicing (IVS1-1 G>A, IVS2-1 G>C). É provável que as demais três famílias sejam portadoras de deleções germinativas no gene VHL. Em resumo, os resultados apresentados neste estudo ampliam o conhecimento da base molecular da doença de VHL e consiste na primeira pesquisa de pós-graduação produzida pelo ambulatório de aconselhamento genético do câncer do HCFMRP-USP. / Von Hippel-Lindau disease (VHL) is an autosomal dominant hereditary cancer syndrome that predisposes to the development of a variety of benign and malignant tumors. VHL is caused by germline and somatic mutations in the VHL gene and it has an incidence of approximately one in 36,000 livebirths. The VHL gene is a tumor suppressor that is translated into the VHL protein, which has many functions, mainly an ubiquitin-ligase activity, responsible for the polyubiquitylation and proteasomal degradation of the alpha subunit of the hipoxia-inducible factor (HIF) in the presence of oxygen. The main clinical features of VHL are: CNS hemangioblastomas, especially of the cerebellum and spinal cord; retinal angiomas and clear-cell renal carcinomas. The lifetime probability of developing one of these tumors is estimated at more than 70%, whichever may present since childhood until adulthood, more often during the 2nd and 3rd decades. VHL is classified into type 1 (without pheochromocytoma) and type 2 (with pheochromocytoma), the latter being mainly caused by missense mutations. VHL germline mutations may be rearrangements and large deletions (~20%) or point mutations (~80%), such as missense, frameshift, nonsense or in the splicing sites. VHL gene testing is considered standard for the clinical manegement of patients and relatives at risk, whereby it provides early diagnosis and treatment of tumors, improving their life expectancies. Molecular biology techniques such as sequencing and quantitative Southern blotting may detect virtually 100% of VHL germline mutations. More recent methods, such as quantitative real-time PCR and MLPA, have been shown to detect VHL gene gross deletions efficiently. The objectives of this study were: (1) to diagnose patients with VHL clinically; (2) to detect germline point mutations in the VHL gene in the patients and their close relatives at risk; (3) to provide pre and post-testing genetic counseling. Fourteen out of 37 patients from seven unrelated families fulfilled the VHL clinical diagnostic criteria, one patient presented a single cerebellar hemangioblastoma and seven at-risk relatives were still asymptomatic. The methods included: PCR, RFLP, genomic DNA direct sequencing and after cloning. Four germline point mutations in the coding region of the VHL gene were identified, two of whom had been described in literature [c.226_228delTTC (p.F76del), c.217C>T (p.Q73X)]. The other two mutations had not been described so far and affect the splicing sites (IVS1-1 G>A, IVS2-1 G>C). The other three families may carry gross germline deletions in the VHL gene. In conclusion, the outcome presented in this study provides with a greater knowledge of molecular basis of VHL disease and relies on the first post-graduation research carried out at the HCFMRP-USP cancer genetic counseling service.

Mutations in the BRCA1 and BRCA2 genes are known risk factors and drivers of breast and ovarian cancers. So far, few studies have been focused on understanding the differences in transcriptome and functional landscapes associated with the disease (breast vs. ovarian cancers), gene (BRCA1 vs. BRCA2), and mutation type (germline vs. somatic). In this study, we were aimed at systemic evaluation of the association of BRCA1 and BRCA2 germline and somatic mutations with gene expression, disease clinical features, outcome, and treatment. We performed BRCA1/2 mutation centered RNA-seq data analysis of breast and ovarian cancers from the TCGA repository using transcriptome and phenotype 'portrayal' with multi-layer self-organizing maps and functional annotation. The results revealed considerable differences in BRCA1- and BRCA2-dependent transcriptome landscapes in the studied cancers. Furthermore, our data indicated that somatic and germline mutations for both genes are characterized by deregulation of different biological functions and differential associations with phenotype characteristics and poly(ADP-ribose) polymerase (PARP)-inhibitor gene signatures. Overall, this study demonstrates considerable variation in transcriptomic landscapes of breast and ovarian cancers associated with the affected gene (BRCA1 vs. BRCA2), as well as the mutation type (somatic vs. germline). These results warrant further investigations with larger groups of mutation carriers aimed at refining the understanding of molecular mechanisms of breast and ovarian cancers.