Einleitung: Toxoplasma (T.) gondii ist ein weltweit verbreitetes Protozoon warmblütiger Tiere und des Menschen. Einer der größten Risikofaktoren einer Infektion des Menschen mit T. gondii ist der Verzehr von rohem oder nicht ausreichend gegartem Fleisch und Fleischerzeugnissen. Geflügel wird als ein bedeutender Zwischenwirt im Lebenszyklus von T. gondii angesehen. Gegenwärtig gibt es aber nur wenige Untersuchungen zur Persistenz und Gewebeverteilung von für den humanen Konsum relevanten Organen und Geweben von T. gondii der Pute (Meleagris gallopavo) und des Haushuhns (Gallus gallus domesticus). Ziel der Untersuchung: Ziel im ersten Teil der vorliegenden Arbeit war es, die Persistenz von T. gondii in verschiedenen Geweben von Huhn und Pute unter Berücksichtigung der üblichen Mastperioden zu ermitteln. Im zweiten Teil der Arbeit wurde unter Simulation der natürlich auftretenden Infektionswege ein Infektionsmodell bei Huhn und Pute unter Nutzung von drei verschiedenen T. gondii-Stämmen etabliert. In diesem Modell wurde der Einfluss der Parameter Infektionsdosis, -stadium und -stamm auf die Verteilung von T. gondii im Gewebe von Huhn und Pute sowie die Serokonversion in den Zielspezies evaluiert. Tiere, Material und Methoden: 108 Puten und 96 Hühner wurden als Eintagsküken eingestallt. Die zur Infektion der Hühner und Puten benötigten Entwicklungsstadien von T. gondii wurden durch Passagen in der Zellkultur (Tachyzoiten), Infektion von Mäusen (Zysten) und durch Infektion von Hauskatzen (Oozysten) gewonnen. Die Evaluierung der Persistenz erfolgte nach intravenöser Gabe von 106 Tachyzoiten des Typ III-Stammes (NED) vier, acht, zwölf und 16 Wochen post infectionem (p.i.) bei Puten und fünf und zehn Wochen p.i. bei Hühnern. Die natürlichen Infektionswege wurden mit der oralen Verabreichung von Gewebezysten (ein Mausgehirn je Tier) oder Oozysten (103, 105 oder 106) eines T. gondii-Stammes der klonalen Linien der Typen II (ME49, Feldstamm CZ-Tiger) und III (NED) über eine Versuchsdauer von acht Wochen bei Puten und fünf Wochen beim Huhn simuliert (n = 6). Zum Versuchsende wurden die Tiere tierschutz-gerecht narkotisiert und durch Dekapitation getötet. Es wurden 16 verschiedene Gewebe (u.a. Gehirn, Herz, Muskulatur, Muskelmagen) entnommen und die Gewebeverteilung der Zysten von T. gondii mittels konventioneller Polymerase-Kettenreaktion (PCR) und magnetic-capture real-time PCR untersucht. Für die serologische Untersuchung von Blutproben wurden ein kinetischer enzyme linked immunosorbent assay (ELISA) und ein Immunfluoreszenzantikörpertest (IFAT) verwendet. Die Blutentnahmen erfolgten am Tag der Infektion und anschließend wöchentlich bis Versuchsende. Die Daten wurden mit dem Kruskal-Wallis-Test und Mann-Whitney-U-Test (Unterschiede Infektionsgruppen in Serokonversion und Gewebeverteilung) und dem Friedman-Test (Organverteilung) analysiert. Signifikante Unterschiede wurden bei einer Irrtumswahrscheinlichkeit von p < 0,05 angenommen. Ergebnisse: In allen 16 untersuchten Geweben von Pute und Huhn konnte nach Infektion mit Tachyzoiten, Zysten oder Oozysten T. gondii-DNA detektiert werden. Nach Tachyzoiteninfektion waren bei der Pute insgesamt 15,9 % der Gewebeproben positiv für T. gondii-DNA, wobei es sich bei 7,8 % der Proben um essbare Gewebe (Oberschenkel-, Unterschenkel-, Brustmuskulatur, Herz, Leber, Muskelmagen) handelte. Zwischen den vier Untersuchungszeitpunkten waren bei der Pute keine signifikanten Unterschiede in der Nachweisrate feststellbar. Bei Hühnern führten die Infektionen mit Tachyzoiten zu vier Nachweisen (2,1 %) von T. gondii, davon in drei Proben fünf Wochen p.i. (Pankreas, Unterschenkelmuskulatur, Retina) und in einer Probe zehn Wochen p.i. (Herz). Ein statistischer Vergleich der Untersuchungszeitpunkte war aufgrund der wenigen positiven Befunde nicht möglich. Die Infektionen mit Zysten oder Oozysten ergaben hohe Nachweisraten in Gehirn (Pute 44,4 % - 64,1 %, Huhn 18,8 % - 38,5 %) und Herz (Pute 5,6 % - 28,2 %, Huhn 31,3 % - 53,8 %). sowie Muskelmägen (Pute 16,7 % - 20,5 %, Huhn 6,3 % - 25,6 %). Bei Infektionen mit Oozysten der Typ II-Stämme stiegen mit der Infektionsdosis auch die Positivraten bei Huhn und Pute. Infektionen mit dem Typ III-NED-Stamm führten zu signifikant niedrigeren Nachweisraten bei Huhn (1,9 %) und Pute (5,7 %) als solche mit den Typ II-Stämmen ME49 (Huhn: 16,4 %, Pute: 18,8 %) und CZ-Tiger (Huhn: 27,8 %; Pute: 11,7 %). Eine Serokonversion trat bei Huhn und Pute ab einer Woche p.i. auf. Mit steigender Dosis von Typ II-Stamm Oozysten war bei beiden Spezies eine frühere Serokonversion nachweisbar. Schlussfolgerungen: Das in der vorliegenden Arbeit etablierte In vivo-Modell ist geeignet, Hühner und Puten auf verschiedenen Wegen mit T. gondii zu infizieren. Die Nachweise von T. gondii-DNA in Organen und Geweben, auch in zum menschlichen Verzehr genutzten, bei Hühnern bis zu fünf Wochen p.i. und Puten bis zu 16 Wochen p.i. zeigen eine Persistenz von T. gondii bis mindestens zur Schlachtreife an. Das Risiko einer Infektion des Verbrauchers mit T. gondii beim Verzehr von nicht ausreichend gegartem Geflügelfleisch oder Geflügelfleischerzeugnissen oder dem Umgang mit rohem Fleisch oder sonstigem Gewebe von Geflügel ist demzufolge grundsätzlich gegeben. Die Rolle von Geflügel oder anderen Vögeln in der Epidemiologie der humanen Toxoplasmose ist aber noch nicht gänzlich klar und verdient weitere Aufmerksamkeit.:1. Einleitung 2. Literatur 2.1. Toxoplasma gondii 2.1.1. Erreger 2.1.2. Entwicklungszyklus 2.1.3. Genetik und Virulenz 2.1.4. Nachweismöglichkeiten 2.1.4.1. Bioassay 2.1.4.2. Polymerase-Kettenreaktion 2.1.4.3. Serologie 2.2. Bedeutung für den Menschen 2.2.1. Humane Toxoplasmose 2.2.2. Risikofaktoren 2.3. Bedeutung der Toxoplasmose des Geflügels 2.3.1. T. gondii-Infektion des Huhnes 2.3.2. T. gondii-Infektion der Pute 3. Publikationen 3.1. Publikation 1 3.2. Publikation 2 3.3. Publikation 3 3.4. Publikation 4 4. Diskussion 4.1. Klinische Beobachtungen 4.2. Serologische Untersuchungen 4.2.1. Serokonversion und Infektionsstadium 4.2.2. Serokonversion und Infektionsdosis 4.2.3. Serokonversion und Infektionsstamm 4.3. Gewebeverteilung 4.3.1. Persistenz von T. gondii im Gewebe von Geflügel 4.3.2. Prädilektionsstellen bei Hühnern und Puten 4.3.3. Einflussfaktoren auf die Organverteilung 4.3.4. Einfluss der Methodik 4.4. Weitere Einflussfaktoren auf die Untersuchungen 4.5. Zusammenfassung der Diskussion 5. Zusammenfassung 6. Summary 7. Literaturverzeichnis Danksagung

Einleitung: Zu den konventionellen αβ T-Zellen zählen die klassischen CD4+ einfach-positiven T-Helfer (Th) bzw. regulatorischen T-Zellen (Treg) sowie CD8αβ+ einfach-positive zytotoxische T-Zellen. Säugetiere besitzen jedoch noch weitere T-Zell-Subpopulationen, die entweder den T-Zell-Rezeptor αβ (TCRαβ) oder γδ (TCRγδ) exprimieren. Bei Hunden wurde bisher nur die hoch aktivierte CD4+CD8α+ doppelt-positive (dp) T-Zellpopulation des peripheren Blutes detailliert charakterisiert. Über ihre Verteilung in lymphatischem und nicht lymphatischem Gewebe ist jedoch wenig bekannt. Darüber hinaus besitzen Hunde αβ T-Zellen, die weder CD4 noch CD8α (CD4-CD8α- doppelt-negative (dn) T-Zellen) exprimieren, sowie γδ T-Zellen, deren Phänotyp bisher noch nicht untersucht wurde. Ziele der Studie: Ziel dieser Studie war es, einen Überblick über das Vorkommen und den Phänotyp von nichtkonventionellen T-Zellen im peripheren Blut und Geweben des Hundes zu bieten. Zu diesem Zweck wurden CD4+CD8α+ dp, TCRαβ+CD4-CD8α- dn und γδ T-Zellen hinsichtlich der Expression von Oberflächenmarkern, wichtigen Transkriptionsfaktoren und Zytokinen charakterisiert. Tiere, Material und Methoden: Canine T-Zellen Zellen aus dem Blut (Stichprobenumfang: n = 10) sowie aus den Peyerschen Platten (PP; n = 10), dem Dünndarmepithel (IEL; n = 6), den mesenterialen Lymphknoten (mLN; n = 10), tracheobronchialen Lymphknoten (tLN; n = 9), der Lunge (n = 10), Milz (n = 10) und dem Thymus (n = 10) wurden mittels Durchflusszytometrie analysiert. Das Studiendesign erforderte, dass die Gewebeproben von einer anderen Gruppe gesunder Beagle-Hunde (n = 12) entnommen wurden als das periphere Blut. CD4+CD8α+ dp T-Zellen wurden auf ihre Gewebeverteilung, die Expression des T-Zell-Rezeptortyps und die Zusammensetzung des CD8-Dimers (d.h. CD8αα Homodimer vs. CD8αβ Heterodimer) sowie die Expression des Aktivierungsmarkers CD25 untersucht. Um Hinweise auf die potenzielle(n) Funktion(en) von CD4+CD8α+ dp T-Zellen in Geweben zu erhalten, wurde die Expression des Transkriptionsfaktors Forkhead Box P3 (FoxP3) und des zytotoxischen Moleküls Granzym B analysiert. Darüber hinaus wurden Gewebe und Blut auf die Verteilung von TCRαβ+CD4-CD8α- dn und γδ T-Zellen untersucht. Eine umfassende Charakterisierung von TCRαβ+CD4-CD8α- dn und γδ T-Zellen des peripheren Blutes erfolgte durch die Untersuchung der folgenden Marker: CD25 und CD5, FoxP3, GATA-3, T-Box-Transkriptionsfaktor TBX21 (T-bet) und Granzym B. Im Rahmen funktioneller Analysen wurde die Zytokinproduktion (Interferon-γ (IFN-γ) und Interleukin-17A, IL-17A) nach Stimulation der Zellen mit Phorbol-Myristat-Acetat (PMA)/Ionomycin durchgeführt. Normalverteilte Datensätze wurden mittels einfaktorieller Varianzanalyse (ANOVA) mit Bonferroni-Post-Hoc-Test (Vergleich mehrerer Gruppen) oder ungepaartem t-Test (zweiseitig; Vergleich zweier Gruppen) analysiert. Bei nichtparametrischen Daten wurde entweder der Kruskal-Wallis H-Test mit Dunn's Post-Test (Ver-gleich mehrerer Gruppen) oder der Mann-Whitney U-Test (zweiseitig; Vergleich zweier Gruppen) angewandt. Ergebnisse: Canine CD4+CD8α+ dp T-Zellen der Gewebe sind hauptsächlich TCRαβ+CD4+CD8αα+CD25+ und akkumulieren in den PP (durchschnittlich 1.6 %). Obwohl CD4+CD8α+ dp T-Zellen der LN CD4 und CD8α nicht gleich stark exprimieren und zahlenmäßig gering (durchschnittlich 0,2 %) sind, sind sie teilweise FoxP3+. Dies weist auf ein regulatorisches Potential dieser Untergruppe hin. Einige CD4+CD8α+ dp T-Zellen der IEL exprimieren TCRγδ und/oder Granzym B, was die Einzigartigkeit der intestinalen intraepithelialen Lymphozyten unterstreicht. TCRαβ+CD4-CD8α- dn T-Zellen machen einen wesentlichen Anteil aller αβ T-Zellen in Blut (Median 14,4 %) und Gewebe (Median 15 % (Lunge) - 7,5% (PP)) aus und besitzen ein bemerkenswert hohes Expressionsniveau an CD25. CD25 wird entweder mit FoxP3 (hinweisend auf einen regulatorischen Phänotyp) oder ohne FoxP3 (hinweisend auf einen Effektorphänotyp) exprimiert. Zusätzlich weisen IFN-γ, GATA-3 oder IL-17A-exprimierende Subpopulationen Eigenschaften von konventio-nellen Typ 1 T-Helferzellen (Th1), Th2 bzw. Th17 auf. Interessanterweise wurden auch FoxP3+GATA-3+-Hybridzellen gefunden. Canine γδ T-Zellen hingegen sind entweder CD8α+ einfach-positiv oder CD4 CD8α- dn. Während TCRγδ+CD8α+ einfach-positive T-Zellen ihren zytotoxischen TCRαβ+CD8αβ+ T-Zell-Pendants ähneln (T-bet+, IFN-γ+, Granzym B+), exprimieren TCRγδ+CD4 CD8α- dn T-Zellen GATA-3 und nur geringe Mengen an T-bet und Granzym B. Schlussfolgerungen: Dies ist die erste Studie, die einen umfassenden Überblick über nichtkonventionelle T-Zell-Populationen des Hundes bietet. Hinsichtlich ihrer Gewebeverteilung, ihrer Anzahl und ihres funktionellen Potentials ist es wahrscheinlich, dass diese Zellen an wichtigen Immunreaktionen sowie an der Pathogenese von Erkrankungen des Hundes beteiligt sind. Hierzu werden weitere Studien erforderlich sein. Es ist anzumerken, dass das klassische Schema der CD4+ und CD8αβ+ einfach-positiven T-Zellen als canine Haupteffektor- bzw. regulatorische T-Zellen neu überdacht werden sollte. :1 Introduction 1 1.1 The innate and adaptive immune system of mammals 1 1.2 Conventional αβ T cells 1 1.2.1 Cytotoxic CD8αβ+ T cells 2 1.2.2 CD4+ T cells 3 1.2.2.1 CD4+ T helper cells 3 1.2.2.2 CD4+ regulatory T cells 4 1.3 Non-conventional T cells 5 1.3.1 CD4+CD8α+ double-positive T cells 5 1.3.2 γδ T cells 7 1.3.3 CD4-CD8α- double-negative αβ T cells 8 1.4 Aims of this study 8 2 Results 10 2.1 1st publication 10 2.2 2nd publication 32 3 Discussion 55 3.1 Canine non-conventional CD4+CD8α+ double-positive T cells are a homogeneous population enriched at mucosal sites 55 3.2 Canine non-conventional CD4-CD8α- double-negative T cells are unique in abundance and phenotype 57 3.3 Concluding remarks 60 4 Summary 61 5 Zusammenfassung 63 6 Literature Cited 65 / Introduction: Conventional αβ T cells comprise the classical CD4+ single-positive (sp) T helper (Th) resp. T regulatory (Treg) and CD8αβ+ sp cytotoxic T cell subsets. However, further T cell subpopulations either expressing T cell receptor αβ (TCRαβ) or γδ (TCRγδ) occur in mammals. In dogs, only the highly activated CD4+CD8α+ double-positive (dp) T cell population of peripheral blood has been characterized in detail. Yet, little is known about its distribution in lymphoid and non-lymphoid tissues. Furthermore, dogs possess αβ T cells neither expressing CD4 nor CD8α (CD4-CD8α- double-negative (dn) T cells) and γδ T cells, whose phenotype was still undefined. Aims of study: The objective of this study was to provide an overview on the occurrence and phenotype of non-conventional T cells in canine peripheral blood and tissues. To this end, CD4+CD8α+ dp, TCRαβ+CD4-CD8α- dn, and γδ T cells were characterized regarding expression of surface markers, key transcription factors, and cytokines. Animals, material and methods: Canine T lymphocytes from peripheral blood (sample size: n = 10), Peyer’s patches (PP; n = 10), epithelium of the small intestine (IEL; n = 6), mesenteric lymph nodes (mLN; n = 10), tracheobronchial lymph nodes (tLN; n = 9), lung (n = 10), spleen (n = 10), and thymus (n = 10) were analyzed by flow cytometry. Due to the study design tissue samples had to be taken from a different group of healthy Beagle dogs (n = 12) than peripheral blood. CD4+CD8α+ dp T cells were studied for their tissue distribution, expression of T cell receptor type and composition of the CD8 dimer (i.e. CD8αα homodimer vs. CD8αβ heterodimer), as well as expression of the activation marker CD25. To define the potential function(s) of CD4+CD8α+ dp T cells in tissues, expression of the transcription factor forkhead box P3 (FoxP3) and the cytotoxic molecule granzyme B were analyzed. Furthermore, tissues and blood were studied for distribution of TCRαβ+CD4-CD8α- dn and γδ T cells. A comprehensive characterization of blood TCRαβ+CD4-CD8α- dn and γδ T cells was made by investigation of the following markers: CD25 and CD5, FoxP3, GATA-3, T-box transcription factor TBX21 (T-bet), and granzyme B. Functional analyses were performed by examination of cytokine production (interferon γ (IFN-γ) and interleukin 17A, IL-17A) following stimulation of cells with phorbol-myristate-acetate (PMA)/ionomycin. Normally distributed data sets were analyzed using One-way analysis of variance (ANOVA) with Bonferroni post hoc test (multiple groups) or unpaired Student’s t-test (two-tailed; two groups). For nonparametric data, either Kruskal-Wallis H test with Dunn’s post-test (multiple groups) or Mann-Whitney U test (two-tailed; two groups) was applied. Results: Canine CD4+CD8α+ dp T cells of tissues can be mainly described as TCRαβ+CD4+CD8αα+CD25+ accumulating in PP (1.6% on average). Although not homogeneous in expression levels of CD4 and CD8α and low in number (0.2% on average), CD4+CD8α+ dp T cells of LN are partly FoxP3+. This indicates regulatory potential of this subset. Some CD4+CD8α+ dp T cells of IEL express TCRγδ and/or granzyme B, underlining the uniqueness of intestinal intraepithelial lymphocytes. TCRαβ+CD4-CD8α- dn T cells make up a substantial portion of all αβ T cells in blood (median 14.4%) and tissues (median 15% (lung) – 7.5% (PP)) with a remarkably high expression level of CD25. CD25 is either co-expressed with FoxP3 (reminiscent of a regulatory phenotype), or without FoxP3 (reminiscent of an effector phenotype). In addition, subsets expressing IFN-γ, GATA-3, or IL-17A suggest properties of conventional type 1 T helper cells (Th1), Th2, and Th17, respectively. Interestingly, FoxP3+GATA-3+ hybrid cells were found, too. Canine γδ T cells, on the other hand, are either CD8α+ sp or CD4-CD8α- dn. While TCRγδ+CD8α+ sp T cells resemble their TCRαβ+CD8αβ+ cytotoxic T cell counterparts (T-bet+, IFN-γ+, granzyme B+), TCRγδ+CD4-CD8α- dn T cells express GATA-3, and only low levels of T-bet and granzyme B. Conclusions: This is the first study providing a comprehensive overview on canine non-conventional T cell subsets. Regarding tissue distribution, abundance and functions resp. functional potential of these T cells, it is conceivable that they play a major role in health and diseases of dogs. Further studies examining this topic will be needed. Of note, the classical scheme of CD4+ sp Th/Treg and CD8αβ+ cytotoxic T cells as main effector/regulatory T cells in dogs should be reconsidered.:1 Introduction 1 1.1 The innate and adaptive immune system of mammals 1 1.2 Conventional αβ T cells 1 1.2.1 Cytotoxic CD8αβ+ T cells 2 1.2.2 CD4+ T cells 3 1.2.2.1 CD4+ T helper cells 3 1.2.2.2 CD4+ regulatory T cells 4 1.3 Non-conventional T cells 5 1.3.1 CD4+CD8α+ double-positive T cells 5 1.3.2 γδ T cells 7 1.3.3 CD4-CD8α- double-negative αβ T cells 8 1.4 Aims of this study 8 2 Results 10 2.1 1st publication 10 2.2 2nd publication 32 3 Discussion 55 3.1 Canine non-conventional CD4+CD8α+ double-positive T cells are a homogeneous population enriched at mucosal sites 55 3.2 Canine non-conventional CD4-CD8α- double-negative T cells are unique in abundance and phenotype 57 3.3 Concluding remarks 60 4 Summary 61 5 Zusammenfassung 63 6 Literature Cited 65