Die vorliegende kumulative Habilitationsschrift von Dr. rer. nat. Antje Grosche umfasst neben einer Einführung in die Physiologie der dominierenden Gliazellen der Netzhaut – der Müllerschen Gliazellen - zehn Originalarbeiten zur Bedeutung von Gliotransmittern für die Volumenregulation der Müllerzellen. Eine effiziente Volumenregulation gilt als Voraussetzung dafür, dass Müllerzellen ihrer Rolle als stabilisierendes Element hinsichtlich des Ionen- und Wasserhaushaltes in der Netzhaut gerecht werden können. Aus Vorarbeiten war bekannt, dass Müllerzellen typische Eigenschaften, wie die hohe Kaliumleitfähigkeit ihrer Membranen und damit einhergehend eine ausgeprägte Fähigkeit zur Volumenregulation, in der pathologisch veränderten Netzhaut verlieren (Pannicke et al., 2004; Wurm et al., 2006b). Diese Reaktion der Müllerzellen auf Netzhautschädigungen wird als gliotische Aktivierung bezeichnet und konnte in der soeben beschriebenen Ausprägung im ersten Abschnitt der vorliegenden Arbeit an Netzhäuten von Patienten mit uvealem Melanom bestätigt werden (Grosche et al., 2012). Weiterhin wurde die Relevanz einer in früheren Arbeiten identifizierten glutamaterg-purinergen Signalkaskade für die Funktion von gliotischen Müllerzellen detailliert untersucht. Im ersten Abschnitt dieser Habilitationsschrift wird nachgewiesen, dass sowohl im Modell für eine akute Schädigung der Netzhaut (Netzhautablösung im Schwein, Wurm et al., 2011), als auch bei einer chronischen Erkrankung (Streptozotocin-induzierter Diabetes in der Ratte, Wurm et al., 2008c) durch Aktivierung besagter Kaskade trotz verminderter Kaliumströme die Volumenregulation der Zellen wieder hergestellt werden kann. Ein zweiter Schwerpunkt der Untersuchungen war die umfassende Analyse der Expressions-muster und Funktion der an der Volumenregulation beteiligten Rezeptoren (insbesondere P2Y-Rezeptoren) in juvenilen und adulten Müllerzellen. Daten über die Differenzierung von Müllerzellen der Ratte während der ersten drei Postnatalwochen unterstreichen die herausragende Bedeutung von P2Y-Rezeptoren bzw. belegen deren Beteiligung an verschiedenen Müllerzellfunktionen (Volumenregulation, kalziumabhängige Signalwege). Interessanterweise wurden die meisten Effekte von ATP über die Aktivierung von P2Y1-Rezeptoren vermittelt (Wurm et al., 2009a, 2010). Zudem konnte durch Einsatz von P2Y1-Rezeptor-, IP3 Rezeptorsubtyp 2- und A1-Rezeptor-defizienten Mäusen belegt werden, dass ein störungsfreies Wirken der glutamaterg-purinergen Signalkaskade (neben der hohen Kaliumleitfähigkeit der Membranen) auch in unbehandelten Müllerzellen essentiell für deren Volumenregulation ist (Wurm et al., 2009b, 2010; Lipp et al., 2009). Im dritten Themenkomplex wurde der Frage nachgegangen, welche Mechanismen bei der Freisetzung der in die Volumenregulation involvierten Gliotransmitter eine Rolle spielen. So konnte eine exozytotische Ausschüttung von Glutamat bestätigt werden, während die Freisetzung von ATP primär durch Hemichannels (Linnertz et al., 2011; Brückner et al., 2012; Slezak et al., 2012) und die von Adenosin durch Nukleosidtransporter sowie extrazelluläre Degradation von ATP/ADP vermittelt wird (Wurm et al., 2010). Abschließend ordnet das Kapitel „Zusammenfassung und Ausblick“ die neu gewonnenen Erkenntnisse dieser Habilitationsschrift über die Rolle von Gliotransmittern für die Funktionen von Müllerzellen (einschließlich unveröffentlichter Daten aus weiterführenden Experimenten) für zukünftige Forschungsvorhaben ein.

Die vorliegende kumulative Habilitationsschrift von Dr. rer. nat. Antje Grosche umfasst neben einer Einführung in die Physiologie der dominierenden Gliazellen der Netzhaut – der Müllerschen Gliazellen - zehn Originalarbeiten zur Bedeutung von Gliotransmittern für die Volumenregulation der Müllerzellen. Eine effiziente Volumenregulation gilt als Voraussetzung dafür, dass Müllerzellen ihrer Rolle als stabilisierendes Element hinsichtlich des Ionen- und Wasserhaushaltes in der Netzhaut gerecht werden können. Aus Vorarbeiten war bekannt, dass Müllerzellen typische Eigenschaften, wie die hohe Kaliumleitfähigkeit ihrer Membranen und damit einhergehend eine ausgeprägte Fähigkeit zur Volumenregulation, in der pathologisch veränderten Netzhaut verlieren (Pannicke et al., 2004; Wurm et al., 2006b). Diese Reaktion der Müllerzellen auf Netzhautschädigungen wird als gliotische Aktivierung bezeichnet und konnte in der soeben beschriebenen Ausprägung im ersten Abschnitt der vorliegenden Arbeit an Netzhäuten von Patienten mit uvealem Melanom bestätigt werden (Grosche et al., 2012). Weiterhin wurde die Relevanz einer in früheren Arbeiten identifizierten glutamaterg-purinergen Signalkaskade für die Funktion von gliotischen Müllerzellen detailliert untersucht. Im ersten Abschnitt dieser Habilitationsschrift wird nachgewiesen, dass sowohl im Modell für eine akute Schädigung der Netzhaut (Netzhautablösung im Schwein, Wurm et al., 2011), als auch bei einer chronischen Erkrankung (Streptozotocin-induzierter Diabetes in der Ratte, Wurm et al., 2008c) durch Aktivierung besagter Kaskade trotz verminderter Kaliumströme die Volumenregulation der Zellen wieder hergestellt werden kann. Ein zweiter Schwerpunkt der Untersuchungen war die umfassende Analyse der Expressions-muster und Funktion der an der Volumenregulation beteiligten Rezeptoren (insbesondere P2Y-Rezeptoren) in juvenilen und adulten Müllerzellen. Daten über die Differenzierung von Müllerzellen der Ratte während der ersten drei Postnatalwochen unterstreichen die herausragende Bedeutung von P2Y-Rezeptoren bzw. belegen deren Beteiligung an verschiedenen Müllerzellfunktionen (Volumenregulation, kalziumabhängige Signalwege). Interessanterweise wurden die meisten Effekte von ATP über die Aktivierung von P2Y1-Rezeptoren vermittelt (Wurm et al., 2009a, 2010). Zudem konnte durch Einsatz von P2Y1-Rezeptor-, IP3 Rezeptorsubtyp 2- und A1-Rezeptor-defizienten Mäusen belegt werden, dass ein störungsfreies Wirken der glutamaterg-purinergen Signalkaskade (neben der hohen Kaliumleitfähigkeit der Membranen) auch in unbehandelten Müllerzellen essentiell für deren Volumenregulation ist (Wurm et al., 2009b, 2010; Lipp et al., 2009). Im dritten Themenkomplex wurde der Frage nachgegangen, welche Mechanismen bei der Freisetzung der in die Volumenregulation involvierten Gliotransmitter eine Rolle spielen. So konnte eine exozytotische Ausschüttung von Glutamat bestätigt werden, während die Freisetzung von ATP primär durch Hemichannels (Linnertz et al., 2011; Brückner et al., 2012; Slezak et al., 2012) und die von Adenosin durch Nukleosidtransporter sowie extrazelluläre Degradation von ATP/ADP vermittelt wird (Wurm et al., 2010). Abschließend ordnet das Kapitel „Zusammenfassung und Ausblick“ die neu gewonnenen Erkenntnisse dieser Habilitationsschrift über die Rolle von Gliotransmittern für die Funktionen von Müllerzellen (einschließlich unveröffentlichter Daten aus weiterführenden Experimenten) für zukünftige Forschungsvorhaben ein.

Gliotransmitters dérivés de l'astrocyte glutamate et l'ATP modulent l'activité neuronale. Cependant, il reste à savoir comment les astrocytes contrôlent la libération et coordonnent les actions de ces gliotransmetteurs. Dans la première partie de ma thèse, en utilisant l'expression transgénique de la canalrhodopsine 2 (ChR2) sensible à la lumière dans les astrocytes, nous avons observé que la photostimulation augmentait de manière fiable le potentiel d'action des neurones pyramidaux de l'hippocampe. Cette excitation repose principalement sur une libération de glutamate dépendant du Ca2+ par les astrocytes qui active les NMDR neuronaux extrasynaptiques. Remarquablement, nos résultats montrent que l'augmentation de Ca2+ induite par ChR2 et la libération ultérieure de glutamate sont amplifiées par l'activation autocrine induite par l'ATP/ADP des récepteurs P2Y1 sur les astrocytes. Ainsi, l'excitation neuronale est favorisée par une action synergique de la signalisation glutamatergique et purinergique autocrine dans les astrocytes. Ce nouveau mécanisme peut être particulièrement pertinent pour les conditions pathologiques dans lesquelles la concentration extracellulaire d'ATP est augmentée et agit comme un signal de danger majeur. Dans la seconde partie de ma thèse, nous rapportons que la photostimulation sélective des astrocytes ChR2 dans le gyrus denté facilite la transmission synaptique excitatrice sur les cellules granulaires via l'activation des NMDR pré-synaptiques contenant GluN2B. De plus, nous avons découvert que l'élévation intracellulaire du Ca2+ induite par l'ATP et dérivée de l'ATP contrôlait étroitement la libération du glutamate par les astrocytes au cours de la photostimulation des astrocytes. Nos résultats fournissent des preuves d'une relation étroite entre l'ATP dérivé d'astrocyte et le glutamate. / Astrocyte-derived gliotransmitters glutamate and ATP modulate neuronal activity. It remains unclear, however, how astrocytes control the release and coordinate the actions of these gliotransmitters. In the first part of my thesis, using transgenic expression of the light-sensitive channelrhodopsin 2 (ChR2) in astrocytes, we observed that photostimulation reliably increases action potential firing of hippocampal pyramidal neurons. This excitation relies primarily on a Ca2+-dependent glutamate release by astrocytes that activates neuronal extra-synaptic NMDRs. Remarkably, our results show that ChR2-induced Ca2+ increase and subsequent glutamate release are amplified by ATP/ADP-mediated autocrine activation of P2Y1 receptors on astrocytes. Thus, neuronal excitation is promoted by a synergistic action of glutamatergic and autocrine purinergic signaling in astrocytes. This new mechanism may be particularly relevant for pathological conditions in which ATP extracellular concentration is increased and acts as a major danger signal. In the second part of my thesis, we report that selective photostimulation ChR2 positive astrocytes in dentate gyrus facilitates excitatory synaptic transmission onto granule cells via the activation of pre-synaptic GluN2B-containing NMDRs. Moreover, we discovered that astrocyte-derived ATP-mediated intracellular Ca2+ elevation tightly controls glutamate release from astrocytes during astrocyte photostimulation. Our results provide evidence for a close relationship between astrocytic-derived ATP and glutamate.

Peripheral nerve injuries occur with high incidence and often result in profound and permanent impact on the life of patients and on healthcare expenditure. Schwann cells (SC) play a promoting role in peripheral nerve regeneration providing physical and neurotrophic support that aids axon re-growth. However, these beneficial properties are not exploitable in nerve tissue engineering due to the difficulties in SC harvesting and expansion in culture. Adult stem cells derived from bone marrow (BM-MSC) and from adipose tissue (ASC) can be differentiated in SC-like cells and be used as SC substitutes in bioengineered nerve conduits for the improvement of peripheral nerve regeneration. Pharmacological intervention approaches for the treatment of nerve injury are still not clinically available. Nevertheless, γ-Aminobutyric acid (GABA) receptors have been recently suggested as a putative target for such purpose. GABA is the main inhibitory neurotransmitter of the adult brain and interacts with two different receptor types. However, both GABA-A and GABA-B receptor types are functionally expressed also in SC, where they are involved in the regulation of SC physiology and in the development of the peripheral nervous system (PNS).The aim of this thesis was to characterise the GABAergic system of BM-MSC and ASC differentiated into a SC-like phenotype and to evaluate changes in the expression levels following differentiation. Moreover, the effect of specific GABA receptor ligands on cell proliferation and neurotrophic potential of differentiated stem cells were assessed. Using reverse transcriptase polymerase chain reaction, western blot analysis and immunohistochemistry we demonstrated that adult stem cells express several subunits of both GABA-A and GABA-B receptor systems such as GABA-B1a, GABA-B1b and GABA-B2, as well as GABA-A α2 and GABA-A β3. Expression levels and cellular localisation were comparable with adult and neonatal SC cultures used as positive controls, and protein expression levels for some of the subunits changed following glial differentiation. Interestingly, stimulation of GABA receptors with specific agonists influenced stem cell proliferation in two opposite ways. Baclofen, a GABA-B receptor agonist decreased proliferation of SC and differentiated ASC (dASC), but not of SC-like BM-MSC (dBM-MSC). By contrast, muscimol, a GABA-A receptor agonist, increased proliferation in SC and in both dASC and dBM-MSC. This suggests that GABAergic signalling could be a potential player in the mechanisms regulating stem cell differentiation and proliferation as reported in SC. Finally, baclofen treatments on SC and dASC modulated the expression levels and the release of the neurotrophins BDNF and NGF, which are key actors in the processes involved with peripheral nerve regeneration. Although further studies will be needed to clarify the role of GABA receptors in the PNS, the presence of functional GABA receptors on SC-like adult stem cells could represent an exploitable pharmacological target to modulate stem cell physiology and improve their neurotrophic potential for peripheral nerve regeneration.