O sistema de produção convencional adotado para macieira depende de recursos não-renováveis, como fertilizantes, além de uma quantidade excessiva de inseticidas. Felizmente esse sistema convencional está sendo substituído, por um número crescente de produtores de maçã na região serrana catarinense, por um sistema de produção orgânico. Bactérias promotoras de crescimento de plantas (PGPB-Plant Growth-Promoting Bacteria) são bactérias encontradas no solo e na rizosfera de plantas hospedeiras. Estas bactérias também desempenham um papel importante no controle biológico, uma vez que podem induzir resistência sistêmica contra vários agentes patogênicos. Esse estudo teve dois objetivos principais: 1) avaliar a diversidade de bactérias cultiváveis isoladas da rizosfera e raízes de macieiras cultivadas sob diferentes sistemas de plantio na região sul do estado de Santa Catarina; e 2) realizar a prospecção de clones metagenômicos capazes de induzir resistência sistêmica em macieiras contra o fungo Colletotrichum gloeosporioides, agente causal da doença da mancha foliar. Para o primeiro objetivo, amostras de solo rizosférico e raízes de macieiras foram coletadas de pomar orgânico e convencional, juntamente com amostras de uma área nunca utilizada para agricultura (campo nativo). As bactérias foram identificadas em nível de gênero por PCR-RFLP e sequenciamento parcial do gene do 16S rRNA e foram avaliadas em relação a diversas características de promoção de crescimento vegetal. Entre as 300 linhagens isoladas, 214 foram capazes de produzir sideróforos, 36 foram capazes de solubilizar fosfatos e 21 produziram uma grande quantidade de compostos indólicos. Sessenta e nove isolados também apresentaram alguma atividade antagonista contra o fungo fitopatogênico Colletotrichum gloeosporioides. Entre os gêneros bacterianos mais abundantes destacaram-se linhagens pertencentes a Rahnella sp., Enterobacter sp., Pseudomonas sp., Stenotrophomonas sp., Rhizobium sp., Pantoea sp. e Raoultella sp. Um experimento in vivo foi conduzido com cinco isolados e o fungo C. gloeosporioides tendo sido observado que o isolado 89, identificado como Burkholderia sp., foi capaz de reduzir os efeitos patogênicos nas plantas inoculadas. Os resultados obtidos permitiram inferir como a atividade humana está afetando as comunidades bacterianas do solo associadas aos sistemas de cultivo de macieiras, bem como obter isolados capazes de inibir o crescimento de um patógeno importante para esta cultura. Em relação ao segundo objetivo, amostras de solo rizosférico de macieiras cultivadas em pomares orgânicos e convencionais no município de São Joaquim/SC foram coletadas e o DNA metagenômico foi extraído. Para a confecção das bibliotecas metagenômicas foi utilizado o kit CopyControlTM HTP Fosmid Library Production (EPICENTRE). Até o momento, 160 clones foram testados quanto à atividade antagônica contra o fungo C. gloeosporioides em ensaios in vitro. Entretanto, nenhum destes 160 clones foi capaz de inibir o crescimento do micélio fúngico. Com o advento da metagenômica, micro-organismos não cultiváveis do solo poderão ter seu DNA e/ou parte dele desvendado, e, assim, obter uma gama imensurável de biomoléculas para serem utilizadas com fins biotecnológicos na cultura da maçã. Dessa forma, as informações adquiridas com a metagenômica, associada com as informações já existentes de PGPBs, poderão trazer mais resultados positivos de associações bacterianas que visam à promoção do crescimento vegetal, bem como o efeito bacteriano antagonista no controle de agentes fitopatogênicos. / The conventional production system adopted for apple crop depends on non-renewable resources, such as fertilizers, in addition to the excessive amount of insecticides. Fortunately, this system is being replaced by an organic system. Plant growth promoting bacteria (PGPB) are bacteria found in soil and roots of host plants. These bacteria also play an important role in biological control, as they can induce systemic resistance against various pathogens. This study had two aims: 1) to evaluate the diversity of cultivable PGPB isolated from rhizospheric soil and roots of apple trees cultivated under different crop systems in the south of Santa Catarina state; and 2) the bioprospection of metagenomic clones able to induce apple systemic resistance against Colletotrichum gloeosporioides, the causal agent of leaf spot disease. For the first objective, samples of roots and rhizospheric soil of apple trees cultivated in organic and conventional orchards were collected, together with soil samples from an area never used for agriculture. Bacteria were identified at the genus level by PCR-RFLP 16S rRNA gene analysis and partial sequencing methodologies and were evaluated for several plant growth abilities. Among the 300 strains isolated, 214 were able to produce siderophores, 34 were able to solubilize phosphates and 21 isolates produced a large amount of indolic compounds. Seventy-nine isolates presented some antagonist activity against C. gloeosporioides. Among the most abundant genera identified were, respectively, Rahnella sp., Enterobacter sp., Pseudomonas sp., Stenotrophomonas sp., Rhizobium sp., Pantoea sp., and Raoultella sp. An in vivo experiment was conducted with five isolates and C. gloesporoides fungus, it was observed that the isolate 89, identified as Burkholderia sp., was able to reduce the phytopathogenic damage in the inoculated plants. Our results allowed us to infer how anthropogenic activity is affecting the bacterial communities in soil associated with apple tree crop systems, and to obtain an isolate that was able to delay the emergence of an important disease for this culture. In relation to the second objective, samples of rhizospheric soil from apple trees cropped in organic and conventional orchards in São Joaquim locality (SC) were collected and metagenomic DNA was extracted. To construct metagenomic libraries, the CopyControlTM HTP Fosmid Library Production (EPICENTRE) kit was used. Up to know 160 clones were tested in relation their antagonistic ability against C. gloeosporioides fungus in in vitro assays. However, none of them was able to inhibit the fungal growth. With the advent of metagenomics, non-cultivable micro-organisms in the soil may have their DNA and / or part unraveled, and thus obtain an immeasurable range of biomolecules for use in biotechnological purposes in apple orchards. Thus, the information acquired with metagenomics, associated with existing information PGPBs may bring more positive results of bacterial associations seeking to promote plant growth and bacterial antagonist effect in controlling pathogenic agents.

O sistema de produção convencional adotado para macieira depende de recursos não-renováveis, como fertilizantes, além de uma quantidade excessiva de inseticidas. Felizmente esse sistema convencional está sendo substituído, por um número crescente de produtores de maçã na região serrana catarinense, por um sistema de produção orgânico. Bactérias promotoras de crescimento de plantas (PGPB-Plant Growth-Promoting Bacteria) são bactérias encontradas no solo e na rizosfera de plantas hospedeiras. Estas bactérias também desempenham um papel importante no controle biológico, uma vez que podem induzir resistência sistêmica contra vários agentes patogênicos. Esse estudo teve dois objetivos principais: 1) avaliar a diversidade de bactérias cultiváveis isoladas da rizosfera e raízes de macieiras cultivadas sob diferentes sistemas de plantio na região sul do estado de Santa Catarina; e 2) realizar a prospecção de clones metagenômicos capazes de induzir resistência sistêmica em macieiras contra o fungo Colletotrichum gloeosporioides, agente causal da doença da mancha foliar. Para o primeiro objetivo, amostras de solo rizosférico e raízes de macieiras foram coletadas de pomar orgânico e convencional, juntamente com amostras de uma área nunca utilizada para agricultura (campo nativo). As bactérias foram identificadas em nível de gênero por PCR-RFLP e sequenciamento parcial do gene do 16S rRNA e foram avaliadas em relação a diversas características de promoção de crescimento vegetal. Entre as 300 linhagens isoladas, 214 foram capazes de produzir sideróforos, 36 foram capazes de solubilizar fosfatos e 21 produziram uma grande quantidade de compostos indólicos. Sessenta e nove isolados também apresentaram alguma atividade antagonista contra o fungo fitopatogênico Colletotrichum gloeosporioides. Entre os gêneros bacterianos mais abundantes destacaram-se linhagens pertencentes a Rahnella sp., Enterobacter sp., Pseudomonas sp., Stenotrophomonas sp., Rhizobium sp., Pantoea sp. e Raoultella sp. Um experimento in vivo foi conduzido com cinco isolados e o fungo C. gloeosporioides tendo sido observado que o isolado 89, identificado como Burkholderia sp., foi capaz de reduzir os efeitos patogênicos nas plantas inoculadas. Os resultados obtidos permitiram inferir como a atividade humana está afetando as comunidades bacterianas do solo associadas aos sistemas de cultivo de macieiras, bem como obter isolados capazes de inibir o crescimento de um patógeno importante para esta cultura. Em relação ao segundo objetivo, amostras de solo rizosférico de macieiras cultivadas em pomares orgânicos e convencionais no município de São Joaquim/SC foram coletadas e o DNA metagenômico foi extraído. Para a confecção das bibliotecas metagenômicas foi utilizado o kit CopyControlTM HTP Fosmid Library Production (EPICENTRE). Até o momento, 160 clones foram testados quanto à atividade antagônica contra o fungo C. gloeosporioides em ensaios in vitro. Entretanto, nenhum destes 160 clones foi capaz de inibir o crescimento do micélio fúngico. Com o advento da metagenômica, micro-organismos não cultiváveis do solo poderão ter seu DNA e/ou parte dele desvendado, e, assim, obter uma gama imensurável de biomoléculas para serem utilizadas com fins biotecnológicos na cultura da maçã. Dessa forma, as informações adquiridas com a metagenômica, associada com as informações já existentes de PGPBs, poderão trazer mais resultados positivos de associações bacterianas que visam à promoção do crescimento vegetal, bem como o efeito bacteriano antagonista no controle de agentes fitopatogênicos. / The conventional production system adopted for apple crop depends on non-renewable resources, such as fertilizers, in addition to the excessive amount of insecticides. Fortunately, this system is being replaced by an organic system. Plant growth promoting bacteria (PGPB) are bacteria found in soil and roots of host plants. These bacteria also play an important role in biological control, as they can induce systemic resistance against various pathogens. This study had two aims: 1) to evaluate the diversity of cultivable PGPB isolated from rhizospheric soil and roots of apple trees cultivated under different crop systems in the south of Santa Catarina state; and 2) the bioprospection of metagenomic clones able to induce apple systemic resistance against Colletotrichum gloeosporioides, the causal agent of leaf spot disease. For the first objective, samples of roots and rhizospheric soil of apple trees cultivated in organic and conventional orchards were collected, together with soil samples from an area never used for agriculture. Bacteria were identified at the genus level by PCR-RFLP 16S rRNA gene analysis and partial sequencing methodologies and were evaluated for several plant growth abilities. Among the 300 strains isolated, 214 were able to produce siderophores, 34 were able to solubilize phosphates and 21 isolates produced a large amount of indolic compounds. Seventy-nine isolates presented some antagonist activity against C. gloeosporioides. Among the most abundant genera identified were, respectively, Rahnella sp., Enterobacter sp., Pseudomonas sp., Stenotrophomonas sp., Rhizobium sp., Pantoea sp., and Raoultella sp. An in vivo experiment was conducted with five isolates and C. gloesporoides fungus, it was observed that the isolate 89, identified as Burkholderia sp., was able to reduce the phytopathogenic damage in the inoculated plants. Our results allowed us to infer how anthropogenic activity is affecting the bacterial communities in soil associated with apple tree crop systems, and to obtain an isolate that was able to delay the emergence of an important disease for this culture. In relation to the second objective, samples of rhizospheric soil from apple trees cropped in organic and conventional orchards in São Joaquim locality (SC) were collected and metagenomic DNA was extracted. To construct metagenomic libraries, the CopyControlTM HTP Fosmid Library Production (EPICENTRE) kit was used. Up to know 160 clones were tested in relation their antagonistic ability against C. gloeosporioides fungus in in vitro assays. However, none of them was able to inhibit the fungal growth. With the advent of metagenomics, non-cultivable micro-organisms in the soil may have their DNA and / or part unraveled, and thus obtain an immeasurable range of biomolecules for use in biotechnological purposes in apple orchards. Thus, the information acquired with metagenomics, associated with existing information PGPBs may bring more positive results of bacterial associations seeking to promote plant growth and bacterial antagonist effect in controlling pathogenic agents.

O sistema de produção convencional adotado para macieira depende de recursos não-renováveis, como fertilizantes, além de uma quantidade excessiva de inseticidas. Felizmente esse sistema convencional está sendo substituído, por um número crescente de produtores de maçã na região serrana catarinense, por um sistema de produção orgânico. Bactérias promotoras de crescimento de plantas (PGPB-Plant Growth-Promoting Bacteria) são bactérias encontradas no solo e na rizosfera de plantas hospedeiras. Estas bactérias também desempenham um papel importante no controle biológico, uma vez que podem induzir resistência sistêmica contra vários agentes patogênicos. Esse estudo teve dois objetivos principais: 1) avaliar a diversidade de bactérias cultiváveis isoladas da rizosfera e raízes de macieiras cultivadas sob diferentes sistemas de plantio na região sul do estado de Santa Catarina; e 2) realizar a prospecção de clones metagenômicos capazes de induzir resistência sistêmica em macieiras contra o fungo Colletotrichum gloeosporioides, agente causal da doença da mancha foliar. Para o primeiro objetivo, amostras de solo rizosférico e raízes de macieiras foram coletadas de pomar orgânico e convencional, juntamente com amostras de uma área nunca utilizada para agricultura (campo nativo). As bactérias foram identificadas em nível de gênero por PCR-RFLP e sequenciamento parcial do gene do 16S rRNA e foram avaliadas em relação a diversas características de promoção de crescimento vegetal. Entre as 300 linhagens isoladas, 214 foram capazes de produzir sideróforos, 36 foram capazes de solubilizar fosfatos e 21 produziram uma grande quantidade de compostos indólicos. Sessenta e nove isolados também apresentaram alguma atividade antagonista contra o fungo fitopatogênico Colletotrichum gloeosporioides. Entre os gêneros bacterianos mais abundantes destacaram-se linhagens pertencentes a Rahnella sp., Enterobacter sp., Pseudomonas sp., Stenotrophomonas sp., Rhizobium sp., Pantoea sp. e Raoultella sp. Um experimento in vivo foi conduzido com cinco isolados e o fungo C. gloeosporioides tendo sido observado que o isolado 89, identificado como Burkholderia sp., foi capaz de reduzir os efeitos patogênicos nas plantas inoculadas. Os resultados obtidos permitiram inferir como a atividade humana está afetando as comunidades bacterianas do solo associadas aos sistemas de cultivo de macieiras, bem como obter isolados capazes de inibir o crescimento de um patógeno importante para esta cultura. Em relação ao segundo objetivo, amostras de solo rizosférico de macieiras cultivadas em pomares orgânicos e convencionais no município de São Joaquim/SC foram coletadas e o DNA metagenômico foi extraído. Para a confecção das bibliotecas metagenômicas foi utilizado o kit CopyControlTM HTP Fosmid Library Production (EPICENTRE). Até o momento, 160 clones foram testados quanto à atividade antagônica contra o fungo C. gloeosporioides em ensaios in vitro. Entretanto, nenhum destes 160 clones foi capaz de inibir o crescimento do micélio fúngico. Com o advento da metagenômica, micro-organismos não cultiváveis do solo poderão ter seu DNA e/ou parte dele desvendado, e, assim, obter uma gama imensurável de biomoléculas para serem utilizadas com fins biotecnológicos na cultura da maçã. Dessa forma, as informações adquiridas com a metagenômica, associada com as informações já existentes de PGPBs, poderão trazer mais resultados positivos de associações bacterianas que visam à promoção do crescimento vegetal, bem como o efeito bacteriano antagonista no controle de agentes fitopatogênicos. / The conventional production system adopted for apple crop depends on non-renewable resources, such as fertilizers, in addition to the excessive amount of insecticides. Fortunately, this system is being replaced by an organic system. Plant growth promoting bacteria (PGPB) are bacteria found in soil and roots of host plants. These bacteria also play an important role in biological control, as they can induce systemic resistance against various pathogens. This study had two aims: 1) to evaluate the diversity of cultivable PGPB isolated from rhizospheric soil and roots of apple trees cultivated under different crop systems in the south of Santa Catarina state; and 2) the bioprospection of metagenomic clones able to induce apple systemic resistance against Colletotrichum gloeosporioides, the causal agent of leaf spot disease. For the first objective, samples of roots and rhizospheric soil of apple trees cultivated in organic and conventional orchards were collected, together with soil samples from an area never used for agriculture. Bacteria were identified at the genus level by PCR-RFLP 16S rRNA gene analysis and partial sequencing methodologies and were evaluated for several plant growth abilities. Among the 300 strains isolated, 214 were able to produce siderophores, 34 were able to solubilize phosphates and 21 isolates produced a large amount of indolic compounds. Seventy-nine isolates presented some antagonist activity against C. gloeosporioides. Among the most abundant genera identified were, respectively, Rahnella sp., Enterobacter sp., Pseudomonas sp., Stenotrophomonas sp., Rhizobium sp., Pantoea sp., and Raoultella sp. An in vivo experiment was conducted with five isolates and C. gloesporoides fungus, it was observed that the isolate 89, identified as Burkholderia sp., was able to reduce the phytopathogenic damage in the inoculated plants. Our results allowed us to infer how anthropogenic activity is affecting the bacterial communities in soil associated with apple tree crop systems, and to obtain an isolate that was able to delay the emergence of an important disease for this culture. In relation to the second objective, samples of rhizospheric soil from apple trees cropped in organic and conventional orchards in São Joaquim locality (SC) were collected and metagenomic DNA was extracted. To construct metagenomic libraries, the CopyControlTM HTP Fosmid Library Production (EPICENTRE) kit was used. Up to know 160 clones were tested in relation their antagonistic ability against C. gloeosporioides fungus in in vitro assays. However, none of them was able to inhibit the fungal growth. With the advent of metagenomics, non-cultivable micro-organisms in the soil may have their DNA and / or part unraveled, and thus obtain an immeasurable range of biomolecules for use in biotechnological purposes in apple orchards. Thus, the information acquired with metagenomics, associated with existing information PGPBs may bring more positive results of bacterial associations seeking to promote plant growth and bacterial antagonist effect in controlling pathogenic agents.

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No. of bitstreams: 1 TeseRMDA.pdf: 4251540 bytes, checksum: 7f125ff1cf0456ee6c35cc31853e3ee2 (MD5) Previous issue date: 2016-07-01 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / Several aromatic polyketide derivatives from Ginger (Zingiber officinale), like zingerone, 6-gingerol and 6-shogaol were obtained by biocatalytic reactions and semi-synthesis and both their antifungal and cysteine-proteinase inhibitory properties were investigated. The derivatives obtained by semi-synthesis were evaluated in the form of a first screening for inhibition property of growth of phytopathogenic fungi Colletotrichum gloesporioides and Fusararium oxysparum. The biotransformation of four compounds: zingerone purchased from Sigma Aldrich, 6-gingerol isolated from ginger and its derivatives 4-methyl-6-gingerol and 6-shogaol was investigated using whole cells of C. gloesporioides and showed recognition of the fungal pool of enzymes capable of using such compounds as substrates. All experiments were conducted in sterile liquid medium BD (Potato and Dextrose) under agitation (120 rpm) and constant temperature (30° C ), obtaining the methanol extract of mycelial mass (MM), the aqueous extract (Aq) and the ethyl acetate extract (Ac) of culture fluid. The ethyl acetate extract was analyzed by GC-MS and ESI-MS/MS using LC-MS techniques. The fungus C. gloesporioides proved able to promote a reaction of aromatic oxidative coupling of zingerone, forming a dimer of this molecule. This product was isolated, identified by NMR spectroscopy and high resolution mass spectrometry. The biotransformation experiment was also made with isotopically labeled zingerone with deuterium. Analysis of the ethyl acetate extract (Ac) by (-) ESI-MS / MS using LC-IT-MS showed that dimer formation since the first day once the isotopically labeled fragments were detected. The aromatic oxidative coupling reaction also occurs in the biotransformation to phenolic compound 6-gingerol by C. gloesporioides. It is probable that side chain of 6-gingerol was used as carbon source forming an alcohol with molecular mass 168 Da. The dimer of the alcohol appears as biotransformation product. Among the proposed semi-synthesis reactions, the insertion of an oxime ether subunit from zingerone as starting material was obtained. Despite the molecular modeling indicates good complementarity with the catalytic site model cysteinyl preoteases, the product obtained does not show inhibitory activity against the enzymes L and V to 25 uM. The oximine derivative of 8-gingerol, presented halo of inhibition against the proliferation of fungus C.gloesporioides in disk diffusion test on PDA (Potato Dextrose Agar) in a Petri dish. The ethyl acetate extract (Ac) from the tenth day showed a good result of inhibition of cathepsin V (80%). There are studies that investigate the relationship between the antifungal activity of compounds of the property of inhibiting cysteine-preoteases as papain and cathepsin B and L. / A obtenção de novos derivados de policetídeos aromáticos encontrados no gengibre (Zingiber officinale), como a zingerona, o 6-gingerol e o 6-shogaol, empregando-se reações de biocatálise e semi-síntese foram alcançados, bem como a avaliação frente à cisteíno-proteases. Os derivados obtidos por semi-síntese foram avaliados na forma de um primeiro screening quanto à capacidade de inibição do crescimento dos fungos fitopatogênicos como Colletotrichum gloesporioides e Fusararium oxysparum. A biotransformação de quatro compostos: a zingerona, obtida comercialmente, a biotransformação do 6-gingerol, isolado do gengibre e de seus derivados 4-metil-6- gingerol e 6-shogaol por células totais de C. gloesporioides foi investigada tendo-se o reconhecimento do pool enzimático do fungo capaz de utilizar tais compostos como substrato. Todos os experimentos foram conduzidos em meio líquido estéril BD (Batata e Dextrose) sob a agitação de 120 rpm e temperatura de 30°C, obtendo-se o extrato metanólico da massa micelial (MM), o extrato aquoso (Aq), sendo o sobrenadante após obtenção do extrato em acetato de etila (Ac) do fluido da cultura. Os extratos Ac foram analisados por GC-MS e ESI-MS/MS usando técnicas de LC-MS. O fungo C. gloesporioides mostrou ser capaz em promover uma reação de acoplamento oxidativo aromático da zingerona, formando um dímero desta molécula, tal produto foi isolado e a estrutura química proposta com as análises dos espectros de RMN obtidos bem como por espectrometria de massas de alta resolução; o experimento de biotransformação também foi realizado com a zingerona marcada com deutério. A análise do extrato Ac por (-) ESI-MS/MS usando LC-IT-MS mostrou que desde o primeiro dia há formação do dímero o que foi confirmado pela formação de fragmentos isotopicamente marcados. A reação de acoplamento oxidativo aromático também ocorre na biotransformação para o composto fenólico 6-gingerol pelo C. gloesporioides, sendo que, provavelmente há consumo da cadeia lateral pelo fungo como fonte de carbono formando um álcool com a massa molecular de 168 Da, sendo o dímero desse álcool que aparece como produto de biotransformação. Dentre a proposta de reação de semi-síntese, o produto da reação de inserção da subunidade éter de oxima, tendo zingerona como material de partida foi obtido e apesar da modelagem molecular indicar boa complementariedade com o modelo de sítio catalítico de cisteinil-preoteases, o produto obtido não apresentou atividade de inibição contra as enzimas L e V a 25 μM. O derivado oximínico do 8-gingerol, apresentou halo de inibição contra a proliferação do fungo C.gloesporioides em teste de difusão em disco em meio BDA (Batata-Dextrose-Ágar) em placa de Petri, sendo que existem trabalhos que investigam a relação entre a atividade antifúngica de compostos com a propriedade de inibição de cisteínopreoteases como papaína e catepsina B e L. O extrato acetato de etila (Ac) do décimo dia mostrou um bom resultado de inibição da catepsina V (80%).