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Ensaios de Duplo-Híbrido e Pull-down no estudo de interações moleculares da Beta-1,3-glicanosiltransferse 3 de Paracoccidioides brasiliensis / Testing of Double-Hybrid and Pull-down in the study of molecular interactions of beta-1 ,3-glicanosiltransferse three Paracoccidioides brasiliensisSILVA, Mirelle Garcia 29 January 2010 (has links)
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Previous issue date: 2010-01-29 / Paracoccidioides brasiliensis is a thermodimorphic fungus that causes
paracoccidioidomycosis (PCM), a systemic mycosis prevalent in South America. In
humans, infection starts by inhalation of fungal propagules that reach the pulmonary
epithelium. The cell wall presents an essential role in the pathobiology of P.
brasiliensis, since it is involved in the morphogenetic changes associated with the life
cycle of this pathogen. The biosynthesis and remodeling of the cell wall polysaccharide
network is required for fungal growth and glycosylphosphatidylinositol (GPI)-anchored
proteins are involved in these processes. The enzymes of the glucan-elongating (GEL)
family are GPI-anchored proteins which have beta-1,3-glucanosyltransferase activity
and play important role in the cross-linking of cell wall components in fungi. The P.
brasiliensis genome possess 3 genes that encode for beta-1,3-glucanosyltransferases
(Gel1p, Gel2p e Gel3p). With the aim of searching for other possible functions for
beta-1,3-glucanosyltransferase 3 (PbGel3p) in P. brasiliensis, the interactions between
this protein and others proteins of the fungus were investigated through the
Saccharomyces cerevisiae two-hybrid system and pull-down assay. The two-hybrid
system enables the study of interactions in vivo and, through this approach, 8 proteins
which interact with PbGel3p were identified. The interaction with phosphatidylinositol-
4-phosphate 5-kinase its3 and protein kinase Dsk1p suggest the participation of
PbGel3p in the cell division cycle. The RNA helicase Dbp5p, whose interaction with
PbGel3p was in vitro confirmed by coimunoprecipitation, and the 5'-3' exoribonuclease
are involved in the mRNA metabolism suggesting a function for PbGel3p in this
process. The interaction between PbGel3p and the lipase/serine esterase, which
participates on the biosynthesis of the GPI-anchor, was also confirmed by
coimunoprecipitation. PbGel3p also interacts with the transcription factor Ctf1Bp and
the 3-oxoacyl reductase enzyme, which suggests its involvement in the lipid
metabolism. The interaction with the leptomycin B resistance protein Pmd1p suggests a
role for PbGel3p in the response to antifungal drugs. The in vitro pull-down assay
resulted in the identification of P. brasiliensis 70 kDa heat shock protein. The
interaction with this protein suggests that PbGel3p may act in the response to stress
conditions, as in the temperature increase. On basis of these data, functional studies may
be carried out in order to confirm the Gel3p multifunctionality in P. brasiliensis. / Paracoccidioides brasiliensis é um fungo termodimórfico, causador da
paracoccidioidomicose, uma micose sistêmica prevalente na América do Sul. A
infecção em humanos inicia-se com a inalação de propágulos fúngicos que atingem o
epitélio pulmonar. A parede celular desempenha um papel importante na patobiologia
do P. brasiliensis, pois está envolvida nas mudanças morfogenéticas associadas com o
ciclo de vida deste patógeno. A biossíntese e o remodelamento dos polissacarídeos da
parede celular são essenciais para o crescimento do fungo e proteínas
glicosilfosfatidilinositol (GPI)-ancoradas estão envolvidas nesses processos. As enzimas
da família glicanosiltransferase alongando glicana (GEL) são proteínas GPI-ancoradas
que possuem atividade de beta-1,3-glicanosiltransferase e desempenham um importante
papel nas ligações cruzadas dos componentes da parede celular em fungos. O genoma
de P. brasiliensis possui 3 genes codificantes para beta-1,3-glicanosiltransferases
(Gel1p, Gel2p e Gel3p). Com o objetivo de se buscar outras possíveis funções da beta-
1,3-glicanosiltransferase 3 (PbGel3p) em P. brasiliensis, as interações entre essa
proteína e outras proteínas do fungo foram investigadas através do sistema de duplohíbrido
em Saccharomyces cerevisiae e do ensaio de pull-down. O sistema duplohíbrido
permite o estudo das interações in vivo e, através dele, foram identificadas 8
proteínas que interagem com PbGel3p. A interação com a fosfatidilinositol-4-fosfato 5-
quinase its3 e com a Dsk1 proteína quinase sugere a participação de PbGel3p no ciclo
de divisão celular. A RNA helicase Dbp5p, cuja interação com PbGel3p foi confirmada
in vitro através do ensaio de coimunoprecipitação, e a 5'-3' exoribonuclease estão
envolvidas no metabolismo de RNAm, sugerindo uma função para PbGel3p nesse
processo. A interação entre PbGel3p e a enzima serina esterase/lipase, que participa da
via de biossíntese da âncora GPI, também foi confirmada por coimunoprecipitação.
PbGel3p interage com o fator de transcrição Ctf1Bp e enzima 3-oxoacil redutase, fato
que sugere seu envolvimento no metabolismo de lipídeos de P. brasiliensis. A interação
com a proteína de resistência à leptomicina B Pmd1p sugere um papel para PbGel3p na
resposta à agentes antifúngicos. O ensaio de pull-down in vitro resultou na identificação
da proteína de choque térmico de 70 kDa de P. brasiliensis. A interação com essa
proteína sugere que PbGel3p pode atuar na resposta à condições de estresse, como o
aumento de temperatura. Com base nesses dados, estudos funcionais devem ser
realizados para confirmar a multifuncionalidade de Gel3p em P. brasiliensis.
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Caracterização e Análise Funcional da Beta -1,3-glicanosiltransferase 2 de Paracoccidioides brasiliensis / Characterization and Functional Analysis of Beta-glucanosyltransferases -1.3 2 of Paracoccidioides brasiliensisLIMA, Patrícia de Sousa 29 January 2010 (has links)
Made available in DSpace on 2014-07-29T15:16:35Z (GMT). No. of bitstreams: 1
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Previous issue date: 2010-01-29 / Paracoccidioides brasiliensis is the causative agent of paracoccidioidomycosis (PCM),
a systemic disorder geographically restricted to Central and South America, and one of the
most important endemic mycoses in these regions, especially among the male rural populations.
The disease is most likely caused by the inhalation of asexual spores (conidia) produced by the
mycelia form of the fungus, propagules that once in the lungs undergo differentiation towards
the parasitic yeast form. The cell wall of P. brasiliensis is a dynamic structure, essentially
composed of branched glucan (β-1,3 and β-1,6 glucans), chitin, lipids and mannoproteins.
Many enzymes are responsible for cell wall remodeling. One of them is the Beta-1,3-
glucanosyltransferase 2 (PbGel2p) presented here. The amino acid deduced sequence of
PbGel2p presented similarity to others proteins involved in fungal cell wall biosynthesis and
morphogenesis and it was characterized as a member of GH72 family, GH72_ subfamily. The
recombinant rPbGel2p was overexpressed in Escherichia coli and the polyclonal antibody was
obtained. The PbGel2p mRNA, as well as the protein, were detected at the highest level in the
mycelium phase. The potencial role of PbGel2p in cell wall biosynthesis and morphogenesis
was analyzed by assessing its ability to rescue the phenotype of the Saccharomyces cerevisiae
GAS1Δ. The results indicated that PbGel2p is a cell wall-associated protein that probably works
as a β-1,3-glucan elongase capable of mediating fungal cell wall integrity. In addition,
predicted protein-protein interactions between PbGel2p and others proteins of the fungus P.
brasiliensis were assessed by using a S. cerevisiae two hybrid system and pull-down assay. The
proteins that were found to interact with PbGel2p are: anthranilate synthase component 2
(involved in the tryptophan pathway), MYND domain protein SamB (related to fungal
morphogenesis), mitotic spindle checkpoint protein Mad2B (required of the organization of the
cytoskeleton and control of cell cycle), G protein complex beta subunit CpcB (organize the
cytoskeleton of actin), WD repeat protein (involved in the control of cell cycle),
phosphatidylinositol-4-phosphate-5-kinase its3 (required of the organization of the actin
cytoskeleton), Hsp60 (related of stress conditions like temperature) and ATPase (localized in
the plasma membrane / involved in the glucose metabolism). This suggested the relation of
PbGel2p in other process to maintenance of cell wall integrity. / Paracoccidioides brasiliensis é o agente causador da paracoccidioidomicose (PCM),
prevalente em países da América Central e do Sul sendo considerada uma das mais importantes
micoses endêmicas, especialmente entre a população rural masculina. A doença é causada pela
inalação dos esporos assexuais (conídios) produzidos pela forma miceliana do fungo. Nos
pulmões, os propágulos tendem à diferenciação para a forma leveduriforme parasitária. A
parede celular de P. brasiliensis é uma estrutura dinâmica, composta essencialmente por
glicanas ramificadas (ligações β-1,3 e β-1,6), quitina, lipídeos e manoproteínas. Muitas enzimas
estão envolvidas no seu remodelamento. Uma delas é a Beta-1,3-glicanosiltransferase 2
(PbGel2p), apresentada aqui. A sequência deduzida de aminoácidos de PbGel2p mostrou
similaridade com outras proteínas envolvidas na morfogênese e biossíntese da parede celular
fúngica e foi caracterizada como parte da família GH72, subfamília GH72_ . A proteína
recombinante rPbGel2p foi superexpressa em Escherichia coli e o anticorpo policlonal obtido.
Os níveis de transcritos que codificam para PbGel2p, assim como os de proteína, foram
detectados em maior teor na fase miceliana do fungo. O papel de PbGel2p na morfogênese e
biossíntese da parede celular foi analisado pela habilidade da proteína em resgatar o fenótipo
mutante para GAS1Δ de Saccharomyces cerevisiae. Os resultados indicaram que PbGel2p é
uma proteína associada à parede celular que provavelmente atua no alongamento da β-1,3-
glicana mediando a integridade da parede celular. Ainda, as interações proteína-proteína
preditas entre PbGel2p e outras proteínas de P. brasiliensis usando o sistema de duplo híbrido e
pull-down foram: componente 2 da antranilato sintase (envolvida na via do triptofano), proteína
SamB com domínio MYND (relacionada com a morfogênese fúngica), proteína Mad2B
(requerida na organização do citoesqueleto e controle do ciclo celular), subunidade beta da
CpcB (organiza o citoesqueleto de actina), proteína com repetição WD (envolvida no controle
do ciclo celular), fosfatidilinositol-4-fosfato-5-quinase (requerida para organização do
citoesqueleto de actina), Hsp60 (relacionada à condições de estresse como temperatura) e
ATPase (localizada na membrana plasmática/ involvida no metabolismo de glicose). Essas
interações sugerem a relação de PbGel2p em outros processos celulares para manutenção da
integridade da parede celular.
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