β-glucosidases catalyze the hydrolysis of aryl and alkyl β-D-glucosides as well as glucosides with a carbohydrate moiety. The maize β-glucosidase isozymes Glu1and Glu2 hydrolyze a broad spectrum of substrates in addition to its natural substrate DIMBOAGlc, while the sorghum β-glucosidase Dhr1 (dhurrinase-1) hydrolyzes exclusively its natural substrate dhurrin. For the expression of mature β-glucosidase isozymes Glu1 and Glu2 of maize and Dhr1 of sorghum, complementary DNAs were amplified by PCR and cloned into the expression vector pET-21a. Recombinant Glu1, Glu2 and Dhr1 enzymes were found to display activity towards the physiological substrates DIMBOAGlc and dhurrin, respectively, at levels similar to their native counterparts. It has been a subject of the subsequent studies by our lab and others to investigate what determines the aglycone specificity in β-glucosidases, and how β-glucosidases catalyze the hydrolysis of β-glycosidic bond between sugar and aglycone moieties. Molecular modeling techniques allowed to predict the substrate binding sites in Glu1 and Dhr1. Based on structural analysis of Glu1 and Dhr1, chimeric β-glucosidases (Glu1/Dhr1) were constructed by shuffling the C-terminal amino acids of Glu1 with the homologous region of Dhr1 to study the mechanism of substrate specificity. The resulting chimeric enzymes were characterized with respect to substrate specificity as well as kinetic, immunological, and electrophoretic properties. Shuffling a small portion of the C-terminal region altered the substrate specificity and improved by 2-4 fold the catalytic efficiency on other substrates in the chimeric β-glucosidases. These experiments showed that one or more of the 10 amino acid substitutions in the 30 amino acid long Dhr1 subdomain, 462SSGYTERFGIVYVDRENGCERTMKRSARWL491, plays a key role in dhurrin recognition and hydrolysis. To further investigate dhurrin recognition within this peptide region, two chimeric enzymes containing ⁴⁶²SSGYTERF⁴⁶⁹ and ⁴⁶⁶FAGFTERY⁴⁷³ Dhr1 peptides, respectively, were generated. The kinetic parameters indicated that Dhr1 peptide, ⁴⁶²SSGYTERF⁴⁶⁹, alone is sufficient to convert Glu1 to Dhr1 substrate specificity when it replaces the homologous peptide, ⁴⁶⁶FAGFTERY⁴⁷³, of Glu1. Maize β-glucosidases share high sequence similarities with Family 1 O-glucosidases. Therefore, these proteins are classified as retaining glycosyl hydrolases whose active site contains two glutamic acids (E) as the key catalytic residues, one as a general acid/base catalyst (E191) and the other as a nucleophile (E406). To confirm the identity and function of the acid/base catalyst E191, we have changed this residue to isosteric glutamine (Q) and aspartic acid (D) in both Glu1 and Glu2 isozymes by site-directed mutagenesis. The resulting mutant proteins were purified and their kinetic parameters (K_m, k_cat and k_i) were determined. The replacement of the acid/base catalyst E191 in the active site of maize β-glucosidase by Q and D resulted in inactivation of the enzyme. The kinetic analysis of the E191Q mutants showed that catalytic activity was reduced 200- and 110-fold towards ortho- and para-nitrophenyl- β-D-glucosides, respectively, when compared with the wild type enzyme. The E191D mutants showed no detectable activity towards any of the substrates tested. The back mutation of the E191Q mutants of the Glu1 and Glu2 isozymes to wild type restored full catalytic activity in both cases. These data indicate that E191 in maize β-glucosidases functions as an acid/base catalyst, and its function in catalysis cannot be performed by an isosteric residue such as glutamine or by a carboxyl group on a shorter side chain such as in aspartic acid. / Ph. D.

La présence des sucres dans le milieu biologique est indéniable. Ils font partie intégrante des mécanismes vitaux du corps humains mais aussi des autres êtres vivants comme les arbres, les plantes et les bactéries. Les produits naturels comportant une ou même plusieurs unités glycosidiques sont connus depuis longtemps. Cependant, le rôle biologique que jouent ces segments n'est pas toujours clair et mérite une attention particulière. Un exemple du rôle remarquable des sucres dans les rouages de la vie est celui des galectines-l et -3 qui influencent entre autre l'apoptose des cellules. Plus précisément, les glycosides phénoliques dont font partie les familles des flavonoïdes et des flavonoles présentent une pléiade de composés actifs affichant de fortes capacités antioxydantes ainsi que d'innombrables propriétés biologiques intéressantes. De leur côté, les 5,6-dihydropyran-2-ones, un hétérocycle de la catégorie des lactones, est un motif que l'on retrouve aussi dans une panoplie d'agents thérapeutiques. La (-)-psilotine est un produit naturel dont la structure est composée d'un glycoside phénolique et où l'aglycone est muni d'un cycle 5,6-dihydropyran-2-one. Jusqu'à maintenant, son effet connu est le ralentissement de la croissance des insectes et des plantes. Seule une synthèse racémique de ce composé avait été accomplie avant le début de ce projet. Des stratégies de synthèse ont donc été planifiées afin d'obtenir la (-)-psilotine de façon énantiosélective et de produire des dérivés analogues afin d'étudier le comportement biologique complet de cette famille de composés. La première voie, qui avait comme étapes clés une allylation stéréosélective de Keck, l'utilisation de groupements protecteurs de type chloroacétyle et une glycosidation avec assistance anchimérique, n'a pas porté fruit mais elle a tout de même permis de synthétiser efficacement le segment aglycone de façon énantiosélective. La deuxième voie se vouait à la glycosylation de ce même segment aglycone mais avec un époxyde de glucal formé notamment grâce à une élimination réductrice au zinc et une époxydation par l’OXONE. La synthèse s'est arrêtée à la formation d'un glucal silylé qui pourra toujours être utilisé pour d'autres travaux. La troisième stratégie employée représente la première synthèse achevée de la (-)-psilotine en ayant comme étapes clés plusieurs réactions déjà employées dans la première tentative mais aussi la glycosylation par catalyse de transfert de phase et l'utilisation d'éthers silylés comme groupements protecteurs. La quatrième voie s'avère être la deuxième synthèse de la (-)-psilotine. Cette fois, le segment aglycone est glycosylé efficacement et une réaction cruciale de clivage sélectif aux groupements acétyles situés sur une unité glycosidique est employée avec succès pour une seconde synthèse très avantageuse de la (-)-psilotine. En employant cette approche, la production d'analogues s'est enchaînée avec des modifications au niveau saccharidique et au niveau du segment aglycone afin de générer une gamme de molécules pour une batterie de tests biologiques. ______________________________________________________________________________ MOTS-CLÉS DE L’AUTEUR : produit naturel, glycoside phénolique, 5.6-dihydropyran-2-one, (-)-psilotine, synthèse énantiosélective, allylation de Keck, glycosylation avec assistance anchimérique, glycosylation par transfert de phase, clivage sélectif aux sucres des groupements acétyles.

Les pathogènes se lient souvent à la cellule ou au tissu hôte via des interactions glycoconjugé-protéine faibles, mais acquérant une haute sélectivité par leur caractère multivalent. Les lectines bactériennes, comme la FimH de Escherichia coli, se lient de façon sélective au saccharide correspondant et jouent un rôle clé dans l'adhésion des pathogènes. Afin d'étudier les interactions entre les glycoconjugés et une protéine possédant un ou plusieurs domaines de reconnaissance du saccharide (CRDs), une variété de mannosides dimériques ont été synthétisés avec comme objectif de disposer de ligands pouvant surpasser l'affinité de la protéine avec son ligand naturel par multivalence. Les glycosides bivalents rigides permettent de réticuler les protéines solubles possédant plusieurs CRDs et de former des réseaux insolubles. Une grande variété de réactions a été utilisée dans la littérature pour synthétiser de telles molécules comme les couplages organométalliques de Sonogashira et de Glaser. Ces précédents couplages permettent d'obtenir des glycosides dimériques symétriques ou asymétriques à partir d'espaceurs alcynes et aryles. Cependant, ces réactions ne permettent pas d'accéder à un espaceur de type biaryle. La présence d'une aglycone aromatique permet d'accéder à des interactions secondaires favorables dans le site actif. C'est pourquoi une nouvelle méthodologie de couplage aryle-aryle de type Ullmann catalysé au palladium a été développée. Cette méthode peut générer avec efficacité une variété de glycosides dimériques originaux (10 exemples avec des rendements jusqu'à 96%). La capacité réticulante de trois mannosides bivalents envers la concanavalin A a été évaluée par turbidimétrie et par diffusion dynamique de la lumière. Dans un deuxième volet, ont été synthétisés des lactosides bivalents assemblés par couplage de Sonogashira et possédant des espaceurs de type éthylène glycol de longueur variable. ______________________________________________________________________________ MOTS-CLÉS DE L’AUTEUR : Multivalence, Lectines, Ligands bivalents, Réticulation, Calatyle au palladium, Ullmann, Sonogashira.

Les souches uropathogéniques de Escherichia coli (UPEC) sont la cause de 80% des infections du tractus urinaire qui touchent une femme sur deux au moins une fois dans leur vie. Malgré l'utilisation d'antibiotiques, la récurrence du pathogène demeure un problème qui conduit à la cystite urinaire et la pyélonéphrite. La colonisation est favorisée par l'adhésion bactérienne à l'uroépithélium du tractus urinaire. Cette adhésion se fait par la reconnaissance moléculaire entre la partie glycosylée de l'uroplakine Ia et le domaine de reconnaissance aux carbohydrates (CRD) des pili bactériens (fimbriae de type 1). Récemment, la portion adhésine de 158 a.a. de la sous-unité FimH du pili de type 1 a été clonée (UPEC-JI6) et cristallisée en présence d'un ligand de haute affinité: le butyl a-D-mannopyranoside. La structure du complexe protéine-carbohydrate montre la proximité de quatre résidus d'acides aminés formant une couronne hydrophobe autour de j'aglycone (IIel3, Tyr48, Ile52, Tyrl37) dont deux résidus aromatiques électrodonneurs qui permettraient potentiellement d'optimiser l'interaction entre la lectine et des mannosides synthétiques en tirant profit des interactions hydrophobes et du recouvrement n-aromatique. Les dérivés O-aryl mannosides montrent des affinités de l'ordre du micromolaire pour la FimH. Nous avons donc réalisé la synthèse de dérivés a-D-mannosidiques possédant une extrémité aglyconique hydrophobe (espaceur aliphatique) munie de noyaux hétéro-aromatiques (triazole), en plus de quelques O-aryl mannosides. La synthèse de trois mini-clusters à terminaisons mannosidiques a aussi été effectuée par Click-Chemisty pour apprécier l'effet de multivalence en synergie avec les propriétés liantes de ces nouveaux analogues triazoliques. Les tests biologiques (voir en annexe) en résonance plasrnonique de surface (SPR) ont révélé des Kd allant de 651 à 27.7 nM pour ces nouveaux analogue monomérique, tandis que l'affinité par mannoside est augmentée jusqu'à 5.9 à 7.4 fois par l'effet de multivalence pour les clusters synthétisés (Kd de 14 et 8 nM). Finalement, une méthodologie de synthèse asymétrique de nouveaux synthons C-mannosidiques d'importance en chimie des sucres a été réalisée par allylboration diastéréosélective. Le développement de cette méthodologie, combinée à la métathèse de fermeture de cycle constitue un premier pas vers la synthèse de pseudodisaccharides C-liés d'un genre nouveau. ______________________________________________________________________________ MOTS-CLÉS DE L’AUTEUR : Chimie thérapeutique, UTI, E. coli, lectine, FimH, D-mannosides, affinités, Click-Chemistry, triazole, multivalence, cluster, C-glycosides, allylboration asymétrique, disaccharides C-liés, métathèse de fermeture de cycle, Grubbs, azidotranfert, modélisation moléculaire.

Les composés glycosidiques sont une classe de molécules organiques sous-estimée en chimie médicinale. En effet, la variété de protéines se liant à ce type de molécules est très grande et plusieurs de ces récepteurs sont impliqués dans des processus physiologiques importants tels que l'adhésion cellulaire, la régulation de la croissance, l'apoptose cellulaire et la xénotransplantation. Plusieurs maladies comme le cancer, la fibrose kystique, les infections virales et bactériennes utilisent les interactions glycoside-protéine dans le but d'envahir notre organisme. Le développement de molécules actives basé sur des glycomimétiques aurait l'avantage d'offrir une sélectivité accrue pour un récepteur en particulier selon la nature du glycoside greffé sur l'élément actif. La synthèse de ce type de molécules utilise des réactions de chimie organique moderne telles que des réactions catalysées par transfert de phase, des couplages au palladium (0) de type Sonogashira et Heck ainsi que des réactions spécifiques à la chimie des sucres comme la réaction de propargylation régiosélective impliquant un acétal d'étain. Deux classes d'inhibiteurs ont été synthétisées soient des S-galactosides et lactosides ainsi que des 2-désoxy-C-galactosides. De plus, le développement d'une méthodologie de synthèse de trisaccharides basée sur une réaction d'allylation stéréosélective impliquant un complexe titane-binol a été étudié. Les diverses études réalisées démontrent bien l'efficacité des molécules synthétisées face à divers récepteurs biologiques dont les galectines et la lectine PA-IL de Pseudomonas aeruginosa. ______________________________________________________________________________ MOTS-CLÉS DE L’AUTEUR : lectines, fibrose kystique, glycosides, glycomimétigues.

Thesis (Ph. D.)--Institute of Paper Chemistry, 1957. / Includes bibliographical references (leaves 37-38).

Bacteria are ubiquitous in all ecosystems and are often challenged by multiple stresses such as extreme temperatures, high salt concentrations, nutrient limitation, pH variations, radiation, predation and the presence of antibiotics/toxins. The most challenging among them is predation pressure which is one of the major causes of their mortality in different niches. Bacteria have evolved different adaptive measures to counter predation. Some of them include change in shape, size, motility, and unpalatable aggregate formation. Aromatic β-glucosides such as salicin, produced by plants as secondary metabolites, play a significant role in protecting them from herbivores. Members of the family Enterobaceriaceae primarily present in soil, e.g. Erwinia chrysanthemi (a phytopathogen) and Klebsiella aerogenes, can utilize the aromatic β-glucosides salicin and arbutin (likely to be present in soil derived from decomposing plant materials) as a carbon source unlike their fellow members such as Escherichia coli, Shigella sonnei, and Salmonella present in the gut environment. Bacteria can obtain energy by metabolizing β-glucosides in the form of glucose. Whether they can also use these molecules as defense tools in a manner similar to plants is an intriguing possibility. In such an event, Bgl+ bacteria could derive a dual advantage in terms of energy generation and protection from predation. The current study was initiated to investigate a possible link between β-glucoside metabolism and self-defense in Enterobacteriaceae. Different members of Enterobacteriaceae comprising of both laboratory strains and natural isolates were considered as prey. Predators included were laboratory strains and soil isolates of bacteriovorous nematodes of the Rhabditidae family, the amoeba Dictyostelium discoidium and a bacteriovorous Streptomyces sp. The predator-prey interaction was analyzed by performing viability and behavioral assays in the context of β-glucoside metabolism Results presented in Chapter 2 show that active catabolism of aromatic β¬glucosides like salicin, arbutin and esculin by Bgl+ bacteria decreases the viability of their predators. The aglycone products released during β-glucosides metabolism, e.g. saligenin in the case of salicin, are the causative agents of the mortality of the predators. The lethality is reversible up to a specific threshold of exposure. Saligenin acts as a chemo-attractant that lures and kills Caenorhabditis elegans N2. In the case of nematodes that succumb, bacteria can derive nutrition from the dead predators indicating a conversion of prey to predator. Experiments with mutant strains of Caenorhabditis elegans suggest that the dopaminergic receptor dop-1 is involved in mediating saligenin toxicity. Studies mentioned in Chapter 3 revolve around the relevance of the predator-prey interaction discussed in Chapter 2 in the natural environment. Members of Enterobacteriaceae and their predator amoebae (cellular slime molds) and nematodes were isolated from soil. They show coexistence in most of the soil samples analyzed. All the predators isolated from soil and other natural isolates of Caenorhabditis succumb to saligenin as their laboratory counterparts with higher sensitivity in some of the strains. Soil nematodes belonging to genera Oscheius and Mesorhabditis avoid saligenin unlike the members of Caenorhabditis genus which are attracted towards saligenin. This indicates that the soil nematodes are often exposed to saligenin or saligenin-like compounds, resulting in the evolution of a genetic machinery to avoid these toxic compounds. Studies with quasi-natural environments like soil and fruit indicate that β-glucoside metabolism have similar effects on predator prey interaction in these environments, reinforcing the relevance of these observations to the natural ecology of the organisms. The studies reported in Chapter 2 and 3 shed light on a novel defense strategy of otherwise non-pathogenic members of Enterobacteriaceae which comes with a dual advantage. These results have also brought into focus issues such as the benefit derived by bacterial populations that are genetically heterogeneous, consisting of both Bgl+ and Bgl-strains. The broad implications and future directions of the work are discussed in Chapter 4. Work presented in Appendix deals with the investigation of the pattern of cellobiose utilization in Shigella sonnei. As mentioned in Chapter 1, it is known that members of Enterobacteriaceae exhibit diversity in their pattern of β-glucoside utilization. Wild type strains of both E. coli and Shigella sonnei are unable to utilize Arbutin, Salicin and Cellobiose. While E. coli can acquire cellobiose utilizing ability directly from the wild type state (Arb-Sal-Cel-), Shigella sonnei strains, though closely related to E. coli, have to undergo a series of mutations in a specific sequence to become capable of utilizing these sugars. Characterization of a few Shigella sonnei Cel+ mutants showed a different mode of activation of the chb operon (known to be involved in cellobiose utilization in E. coli). Considering the ecological significance of the ability to hydrolyze aromatic β-glucosides, a detailed understanding of the metabolic capability of different strains and the molecular mechanism involved becomes significant.

Quercetin-3-O-glucoside (Q3G), a glycosylated derivative of quercetin, is a polyphenolic compound known to possess diverse biological activities. Its moderately hydrophilic nature is a critical factor governing the accessibility to the active sites of oxidative damages in vivo. It was hypothesized that biological activities of Q3G can be further enhanced by regioselective acylation with fatty acids which gives more lipophilicity. Q3G was acylated with six selected long chain fatty acids: stearic acid, oleic acid, linoleic acid, ?-linolenic acid, eicosapentaenoic acid (EPA), and docosahexaenoic acid (DHA), using Candida antactica lipase. The derivatives were evaluated for their potential in inhibiting lipid oxidation in food systems and human low density lipoprotein (LDL), and cytoprotection and anti-inflammatory effect in cell culture model systems. The fatty acid derivatives of Q3G possessed greater effectiveness in inhibiting lipid oxidation in oil-in-water emulsions, and better cytoprotective effect against H2O2- and cigarette smoke toxicant-induced cytotoxicity when compared to Q3G.

This Master‘s thesis is focused on the preparation of hydrogels based on a hydrophobic derivative of hyaluronic acid palmitoyl hyaluronan in presence of biosurfactant decyl glucoside’s micelles and micelles of surfactant triton X-100. For followed characterization were chosen rheological tests and infrared spectrometry. There was observed influence of preparation method, type and concentration of surfactant and presence of micelles on final features of the hydrogel. Moreover, an experimental test of swelling was performed with interesting results for future research.

Adenine derivatives called cytokinins (CK) are a group of plant hormones, which in cooperation with other plant hormones orchestrates almost every aspect of plant growth and development. Despite the rapid progress in plant hormone research, there are still many aspects we may shed light on due to the metabolic and signalling pathways redundancy and the network complexity with crosstalk hubs. CK N-glucosides (in this case trans-zeatin-7-glucoside, tZ7G, and trans-zeatin-9-glucoside, tZ9G) have been traditionally viewed as irreversibly deactivated products of CK active form metabolism (in this regard trans-zeatin, tZ). Nevertheless, the tZ9G antisenescent activity was shown in oat leaf senescence bioassays (Avena sativa cv. Abel) and the possibility of metabolic conversion to O-glucosides was hypothesized. The aim of this work was to test the hypothesis on the close model of oat (Avena sativa cv. Patrik) and to examine also the metabolic conversion of related substances - N 6 -(Δ2 -isopentenyl)adenine (iP) and its N7- and N9- glucosides (iP7G and iP9G). While the senescence retardation caused by exogenous tZ9G application was confirmed in the Avena sativa cv. Patrik, metabolic conversions to O-glucosides remain to be verified. Besides the effects of above-mentioned substances on the oat leaf...