Universiẗat, Diss., 2002--Bonn.

This thesis is focused on polymorphism of MDR1 gene c.-6-180T>G, which causes phenobarbital resistance. Phenobarbital is one of the most commonly used drug against epilepsy, which is one of the most common neurological disease in dogs with frequency between 0,5-5 % according to breed. This mutation has so far been detected only in the border collie breed, which manifests up to 30 percent resistance to the treatment of epilepsy. In the text is subscribed border collie breed, dog epilepsy and gene MDR1. Methodical part is focused on detection of the polymorphism in model population of 82 dogs. The results agree with previous studies and confirm frequency of mutant alleles 32 % within the population.

University, Diss., 2006--Frankfurt (Main). / Zsfassung in engl. und dt. Sprache.

Tierärztl. Hochsch., Diss., 2004--Hannover.

This thesis is focused on polymorphism of MDR1 gene and related drug resistance. Resistance is caused by deletion of four nucleotids, that resulting in a frame shift and synthesis of nonfunctional transport of P-glycoprotein. The text describes a polymorphism of MDR1 (ABCB1) gene, which results in reduced resistance to drugs belonging to the group of macrocyclic lactones. It also describes inheritance of this phenomenon and it deals with the detection of mutation using PCR (polymerase chain reaction) and by fragmentation analyses. A review of literature study is a form of research solely from scientific publications. 128 dogs were included into the own analysis. The results confirmed that Collies had the highest presence of deletions (29,73 %) with a high number of carriers in the study population of dogs (54,05 %). The percentage of affected individuals in the breed of Australian Shepherd and Sheltie was significantly lower (7,32 % and 6 %), but the percentage of carriers were also high in both Australian Shepherds (34,14 %) and the breed Sheltie (48 %).

The goal of this study was to map the glycosylation pattern and antigenic properties of the salivary proteins of two closely related sand fly species, Phlebotomus perniciosus and P. orientalis. Affinity blotting with commercially available lectins revealed that many salivary proteins of these species are N-glycosylated, while the presence of O-glycosylation could not be confirmed. The level of N-glycosylation of most of these proteins is quite low, a larger number of potential N-glycosylation sites were found only in the amino acid sequences of P. orientalis hyaluronidase and endonucleases of both species tested. Four antigens from P. perniciosus salivary glands were selected for expression in a bacterial expression system; two of these proteins (PpeSP01 and PpeSP01B) were not glycosylated and the glycosylation level of the remaining two (PpeSP03B and PpeSP07) was low. The antigenic properties of the four chosen recombinant proteins were subsequently tested using immunoblot and ELISA. During the initial experiments with the sera of dogs experimentally bitten by P. perniciosus, two proteins (rSP07 and rSP01B) were proven unsuitable and they were excluded from further experiments. Recombinant proteins rSP03B and rSP01 were recognized by the same IgG antibodies as the native forms of these proteins...

Trichobilharzia spp. are avian schistosomes related to medically important human parasites of the genus Schistosoma. Penetrating cercariae are well known as causative agent of cercarial dermatitis in humans. Cercariae actively penetrate the skin of definitive hosts and transform into schistosomula. This process is preceded by cercarial tail detachment and includes emptying of penetration glands and extensive surface changes. One of these changes is the loss of highly immunogenic glycocalyx which represents a protective coat in the aquatic environment. The glycocalyx has specific composition of saccharide molecules which are bound to lipids or proteins on the membrane of cercarial tegument. There is only limited information about the mechanism of shedding. Hypotheses based on indirect evidences suggest that peptidases or (phospho)lipases from penetration glands could be involved. This work describes the changes in surface glycosylation during transformation of cercariae into schistosomula by fluorescently labelled lectins and monoclonal antibodies against Lewis X antigen. Lectins UEA-I, LTA and PNA have been chosen as markers of transformation of T. regenti. Further, our experiments have been focused on shedding of cercarial glycocalyx. During in vitro induction of penetration gland emptying and...

Die neuartige Infektionskrankheit Covid-19 breitet sich seit Dezember 2019 von Wuhan, China, in zahlreiche Länder aller Kontinente aus. Durch die rasche Verbreitung der Viruserkrankung und die schnell steigende Zahl an infizierten Personen, rief die WHO im Januar 2020 die „Gesundheitliche Notlage internationaler Tragweite“ aus. Im März desselben Jahres wurde die Situation als Pandemie deklariert. Die Infektionskrankheit wird durch das SARS-CoV-2 hervorgerufen, ein Vertreter aus der Gattung der Betacoronaviren, dessen Genom durch einzelsträngige RNA positiver Polarität (ssRNA) gekennzeichnet ist. Ein zoonotischer Ursprung des Virus aus Fledermäusen wird derzeit aufgrund hoher genetischer Übereinstimmungen als wahrscheinlichste initiale Quelle betrachtet. Die Transmission des SARS-CoV-2 erfolgt über die respiratorische Aufnahme von virushaltigem Aerosol und ruft Symptome wie Husten, Fieber, Geschmacks- und Geruchsstörungen sowie bei schwerem Verlauf auch Pneumonien mit beatmungspflichtigem ARDS (Acute Respiratory Distress Syndrome) hervor. Eine spezifische Therapie für Covid-19 ist bisher nicht etabliert, jedoch sind supportive Maßnahmen sinnvoll, der Einsatz von Remdesivir von der Europäischen Arzneimittel-Agentur zugelassen und die Verwendung von systemischen Kortikosteroiden von der WHO empfohlen. Um die Basisreproduktionszahl für das SARS-CoV-2 gering zu halten, sind infektionspräventive Maßnahmen wie Mund-Nase-Bedeckung, Mindestabstand, regelmäßiger Luftaustausch und das strenge Einhalten von Hygieneregeln wirksam. Die ersten Impfstoffe für die Viruserkrankung Covid-19 stehen seit Dezember 2020 bereit. Da die Vakzine bislang begrenzt zur Verfügung stehen, ist eine frühzeitige Diagnostik und die Nachverfolgung des Infektionsgeschehens weiterhin von großer Bedeutung. Der direkte Erregernachweis des SARS-CoV-2 erfolgt durch einen Nasen-Rachen-Abstrich, der mittels RT-PCR auf replizierendes Virusgenom untersucht wird. Für die Erfassung der asymptomatisch bzw. subklinisch infizierten Personen sind neben dem Antigen-Schnelltest auch serologische Nachweisverfahren notwendig, um die reale Ausbreitung des SARS-CoV-2 nachvollziehen zu können. Ziel dieser Arbeit war es, durch zahlreiche Optimierungen ein valides Protokoll für einen SARS-CoV-2-N IgG Antikörper ELISA zu etablieren. Der Test sollte einen qualitativen Nachweis zur Detektion der SARS-CoV-2-Immunantwort gegen das Nukleokapsidprotein des Virus möglich machen. Die in das Protokoll aufgenommenen Optimierungen umfassen u. a. die Konzentration des verwendeten Antigens N-MBP, die Zusammensetzung der Beschichtungs- und Blocklösung, die Probenvolumina, die Verdünnung des Sekundärantikörpers und die Zeit der Substratinkubation für die Farbentwicklung. Für das Protokoll des SARS-CoV-2-N IgG Antikörper ELISA wurde ein Kalibrator entwickelt, um einen normierten Grenzwert für Seropositivität festlegen zu können und ein Antikörper-Konzentrationsstandard etabliert, um die Ergebnisse des Immunassays auch quantitativ interpretieren zu können. Zur Validierung des SARS-CoV-2-N IgG Antikörper ELISA wurden 73 Covid-19-Seren von Probanden mit zuvor positivem RT-PCR Testergebnis und 180 Negativkontrollseren bzw. -plasmen verwendet. Die Covid-19-Patienten zeigten eine milde bis moderate Erkrankung oder einen asymptomatischen Infektionsverlauf. Die Covid-19-Seren wurden 2 - 3 Wochen (n = 25) oder über 4 Wochen (n = 48) nach Symptombeginn bzw. positivem RNA-Test gewonnen. Die Spezifität des SARS-CoV-2-N IgG Antikörpertests betrug 99,44 % und die Sensitivität wurde mit 80,82 % ermittelt. Nach 2 - 3 Wochen entnommene Covid-19-Seren wurden dabei mit einer Sensitivität von 80,0 % und mehr als 4 Wochen nach Diagnosestellung gewonnene Seren mit einer Positivrate von 81,3 % erkannt. Weiterhin wurde die Empfindlichkeit des In-house ELISA in einer prospektiven diagnostischen Studie mit der Sensitivität von sieben kommerziellen Nukleokapsid- oder S-Glykoprotein-basierten Antikörpertests verglichen, um den Nutzen der Tests für den klinischen Einsatz bewerten zu können. Die Sensitivitäten der Antikörperassays lagen bei 64,4 - 93,2 %. Die empfindlichsten Tests erkannten 95,8 - 100 % der über 4 Wochen nach Symptombeginn gewonnenen Covid-19-Seren als positiv. Seren, die 2 - 3 Wochen nach positivem RNA-Test entnommen wurden, wurden mit einer geringeren Sensitivität erkannt, was darauf hindeutet, dass der optimale Zeitpunkt für serologische Testungen später als 3 Wochen nach Ausbruch der Infektionskrankheit liegen sollte. Antikörpertests, die das Nukleokapsid- bzw. das S-Glykoprotein als Antigen verwendeten, zeigten vergleichbare Sensitivitätswerte auf. Dies bedeutet, dass sowohl N- als auch S-basierte Antiköpertests für die serologische Diagnostik geeignet sind. Nukleokapsidprotein und S-Glykoprotein-basierte Antikörperassays zeigten außerdem Unterschiede in der Detektion einer positiven oder negativen Immunreaktion bei den untersuchten Covid-19-Seren. Eine kombinierte Auswertung von seriellen Tests unter separater Verwendung beider Antigene könnte somit die Positivrate bei der Untersuchung von Covid-19-Seren steigern.:INHALTSVERZEICHNIS ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS III 1 EINFÜHRUNG 1 1.1 SARS-CoV-2: Virale Struktur und Replikation 1 1.2 Covid-19: Pathogenese und Krankheitsbild 3 1.3 Epidemiologie und Herkunft 6 1.4 Diagnostik 8 1.5 Therapie 11 1.6 Prävention 12 1.7 Impfung 12 2 AUFGABENSTELLUNG 15 3 MATERIALIEN UND METHODEN 16 3.1 Materialien 16 3.1.1 Geräte 16 3.1.2 Chemikalien 16 3.1.3 Proteine 17 3.1.4 Seren 17 3.1.5 Immunoreagenzien 18 3.1.6 Sonstige Materialien 18 3.2 Methoden 18 3.2.1 Allgemein verwendete Lösungen 18 3.2.2 Ethikantrag 19 3.2.3 Probanden 19 3.2.4 Probenentnahme 20 3.2.5 Probenaufarbeitung 20 3.2.6 Nukleokapsidprotein (N) und Maltose-bindendes Protein (MBP) 20 3.2.7 Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA) 22 3.2.8 Kommerzielle Antikörpertests 23 3.2.9 Auswertung und Statistik 24 4 ERGEBNISSE 28 4.1 Optimierung des SARS-CoV-2-N IgG Antikörper ELISA 28 4.1.1 Beschichtung mit Nukleokapsid-Fusionsprotein 28 4.1.2 Einfluss der Antigenkonzentration in der Beschichtungslösung 29 4.1.3 Einfluss der Auftauhäufigkeit des N-MBP-Antigens 31 4.1.4 Variation der Beschichtungslösung 33 4.1.5 Beschichtungs- und Probenvolumina 34 4.1.6 Blocklösung 35 4.1.7 Substratinkubationszeit 36 4.1.8 Sekundärantikörperverdünnung 38 4.1.9 Stabilisierung des Protokolls mit CANDOR®-Reagenzien 40 4.2 Validierung des SARS-CoV-2-N IgG Antikörper ELISA 42 4.2.1 Herstellung eines Kalibrators 42 4.2.2 Bestimmung der Sensitivität 44 4.2.3 Bestimmung der Spezifität 46 4.2.4 Herstellung eines Antikörper-Konzentrationsstandards 47 4.2.5 Intra-Assay und Inter-Assay-Variabilität 49 4.3 Protokoll des SARS-CoV-2-N IgG Antikörper ELISA 50 4.4 Vergleich der diagnostischen Sensitivität von SARS-CoV-2-Nukleoprotein- und Glykoprotein-basierten Antikörpertests 53 5 DISKUSSION 58 5.1 Ergebnisse der diagnostischen Validierungsstudie 58 5.2 Eignung und Verwendung des Nukleokapsidproteins als Antigen für den SARS-CoV-2 IgG Antikörper ELISA 61 5.3 Validität und Limitationen 62 5.4 Ausblick und Bedeutung des SARS-CoV-2-N IgG Antikörpertests 64 6 ZUSAMMENFASSUNG 67 LITERATURVERZEICHNIS 70 ANLAGEN 89 ERKLÄRUNG ÜBER DIE EIGENSTÄNDIGE ABFASSUNG DER ARBEIT 92 LEBENSLAUF 93 PUBLIKATIONSVERZEICHNIS 95 DANKSAGUNG 96

5 Anglický abstrakt Experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) is widely accepted as a murine model of human multiple sclerosis autoimmune disease. Murine EAE is usually actively induced by immunization with a suitable myelin antigen. Following immunization, CD4+ T helper lymphocytes Th1 and Th17 accumulate in the nervous tissue and via the production of cytokines, they mediate an inflammatory reaction and the subsequent destruction of myelin. The main goal of this study was the induction of EAE with clinically observable symptoms and the observation of changes in the counts and phenotypes of cells, mainly NK and T cells. NK cells express a wide range of inhibitory and activation receptors from the C-lectin-like receptor superfamily. The specific ligand of the activating NKR-P1C isoform is still unknown and thus this receptor's involvement in EAE was also observed. Another goal was the use of medication with regard to the disease progress improvement. For the purposes of this study, two inbred murine strains with distinct NKR-P1 surface expression were used - the SJL/J strain (expressing inhibitory NKR-P1B) and C57BL/6 (expression activating NKR-P1C). SJL mice elicited a relapse-remitting of EAE, while C57BL/6 had chronic EAE. Both mouse strains exerted changes in the counts of NK...

NG2 is a transmembrane glycoprotein mainly expressed in developing tissue, and often re-expressed in tumor cells. NG2 glycoprotein is an important regulator of cell migration and adhesion. Increased expression of NG2 enhances the metastatic potential of cancer cells. However, the molecular mechanisms of these processes are still not fully understood. An increasing number of evidences, in recent years, have shown that NG2 can be responsible for Rho/ROCK activation, which is essential for effective amoeboid invasiveness. In this thesis, we analysed the role of NG2 glycoprotein, especially the role of its PDZ- binding motif on amoeboid phenotype induction, and activation of Rho/ROCK signaling. Our results demonstrate the importance of the NG2 PDZ-binding motif on mesenchymal- amoeboid transition of cells in a 3D environment. Surprisingly, they show that the expression of both the NG2 cytoplasmatic domain and the truncated version, lacking the PDZ-binding motif, do not change the amount of Rho-GTP or the activation of the Rho/ROCK signaling pathway in 2D.