Ziel dieser Arbeit war es, unter Etablierung und Evaluierung der hier verwendeten RNA-Extraktionsmethoden sowie der oben beschriebenen PCR-Verfahren zum Nachweise der genannten Mutationen, eine Verbesserung der molekularen hämatologisch-onkologischen Diagnostik der Universitätsklinik Würzburg zu erreichen, gemessen am Patientenaufkommen der Klinik. Beim Vergleich der verschiedenen RNA-Extraktionsmethoden fällt eine Festlegung auf eine der Methoden schwer. Bisher wurde das hier mitgetestete Kit von Quiagen verwendet. Aufgrund der relativ kurzen Arbeitszeit, die bei der Verwendung dieses Kits benötigt wird, und dem hohen Probenaufkommen in einem Labor dieser Größe ist das Quiagen-Kit sicher eine gute Wahl. Unter dem finanziellen Aspekt gesehen, könnte man aber deutliche Einsparungen erreichen, wenn man zum günstigeren Konkurrenten Macherey-Nagel wechselt. Um hierbei eindeutige Ergebnisse zu erzielen, ist aber eine große Versuchsreihe notwendig, in der Materialkosten gegen Arbeitskosten aufgestellt werden sollten. Die Trizol-Methode ist zwar bei weitem die günstigste Variante in Bezug auf die Materialkosten, aber der Arbeitsaufwand sowie die wenig zufriedenstellenden Reinheitsergebnisse wirken sich doch sehr nachteilig aus. Zum Empfehlen wäre daher für die Uniklinik eine Versuchsreihe mit den kommerziellen Kits, mit großen Probenzahlen und in Verbindung mit nachgeschalteten Mutationsnachweisen für epidemiologisch häufig vorkommenden Mutationen, für die bereits Nachweisverfahren beschrieben sind. Mit den weiteren hier beschriebenen Assays wurden Versuchsreihen durch-geführt, für die es in der Klinik ein geringeres Patientenaufkommen gibt. Es handelte sich hierbei um bestimmte Unterformen der akuten myeloischen sowie der chronisch lymphatischen Leukämie, die insgesamt sehr selten auftreten. Untersucht wurden im Rahmen dieser Arbeit ein Polymorphismus im CD38-Gen, die NPM1-Mutation im Nucleophosmin-Gen sowie die Mutation FLT3-TKD an Position D835 der FLT3-Tyrosinkinase. Der Nachweis des Polymorphismus im CD38-Gen konnte mittels der Restriktionsendonuklease Pvu II und Agarosegelelektrophorese problemlos und reproduzierbar dargestellt werden. Insgesamt ist der CD38-Polymorphismus aber auch in der gesunden Bevölkerung sehr häufig und konnte auch im Rahmen der vorliegenden Arbeit bei vielen gesunden Probanden nachgewiesen werden. In Zusammenhang mit den Ergebnissen der Literaturrecherche gesehen, ist diese Art des CD38-Nachweises zwar einfach und schnell durchführbar, aber leider ohne Aussagekraft für die Prognose der CLL. Die Nucleophosmin-Mutation Subtyp A mit der Insertion TCTG an Position 956 konnte mittels RT-PCR und anschließender Schmelzkurvenanalyse nach-gewiesen werden. Im untersuchten Patientengut befand sich kein positiver Patient, sodass der Nachweis nur aus einer NPM1-positiven Zellkultur erbracht werden konnte. Da der Nachweis der Mutation bei Patienten mit unverändertem Karyotyp prognostisch günstig ist und insgesamt etwa 35% der AML-Patienten betroffen sind, ist eine Aufnahme dieses Assays in die klinische Routinediagnostik durchaus sinnvoll, um eine individuelle Therapie zu ermöglichen. Der Nachweis sollte in der diagnostischen Kette am besten in die Untersuchung des ersten Knochenmarkspunktates geschaltet werden, sobald ein normaler Karyotyp festgestellt wurde. Ein weiteres Argument für die Einführung in die klinische Routine ist die Nutzung des Versuchs zur Kontrolle der MRD, da ein erneuter NPM1-Nachweis sofort zur Therapieeinleitung führen kann. Anders gestaltet sich der Nachweis der Mutation FLT3-TKD an Position D835 der FLT3-Tyrosinkinase, da sie nur etwa 6-7% aller FLT3-Mutationen darstellt. Das erklärt, warum keiner der hier getesteten AML-Patienten positiv für diese Mutation war. Zudem ist die Mutation nur im Knochenmark aufgrund der höheren Blastenzahlen vor Therapiebeginn eindeutig nachweisbar. Die Aufnahme dieser diagnostischen Möglichkeit in die Routinediagnostik ist also nur dann sinnvoll, wenn sie im Rahmen der AML-Erstdiagnostik bei der ersten Knochenmarkspunktion durchgeführt wird. Wichtiger wäre aber, einen Nachweis für die deutlich häufiger vorkommende FLT3-ITD-Mutation zu etablieren. / In the following paper we compared different methods of extraction for human RNA out of leucozytes. We established and evaluated essays to detect the polymorphism in the CD 38 gene by a and described ist role in the transformation of CLL to Richter Syndrome which is an important prognostic factor. Furthdermore we establishes rt-pcr essays to detect mutations in the NPM1 gene and the FLT3 gene and described their importance in the prognosis and specialised therapie of AML.

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Derzeit ist es gängige Praxis, die Chemotherapie entsprechend der Körperoberfläche des Patienten zu dosieren. Diese Praxis ist jedoch nicht ideal, da es Patienten gibt, die starke Nebenwirkungen haben und andere, die kaum Nebenwirkungen aufweisen. Damit intelligentere Dosierungsschemata entwickelt werden können und prophylaktische Maßnahmen zum Verhindern von Therapienebenwirkungen besser geplant werden können, ist die Kenntnis der Faktoren erforderlich, welche die Nebenwirkungen verursachen. Die hämatologischen Nebenwirkungen der Chemotherapie sind dabei am stärksten ausgeprägt und führen oft zu Dosiserosionen, Zeitverschiebungen zwischen den Chemotherapiezyklen oder sogar zu einem Abbruch der Therapie. Das hat wiederum negative Auswirkungen auf den Therapieerfolg. In dieser Arbeit wurden daher Prognosemodelle für chemotherapieinduzierte hämatologische Nebenwirkungen aufgebaut. Die Daten von 1399 Patienten mit aggressivem Non-Hodgkin-Lymphom und einem breiten Altersspektrum von 18-75 Jahren aus der NHL-B1/B2-Studie (Pfreundschuh et al. 2004a und b) gingen in die Analyse ein. Es wurden für die jüngeren (<= 60 Jahre) und die älteren Patienten (> 60 Jahre) multivariate Proportionale Odds Regressionsmodelle für die drei hämatopoetischen Linien der Leukozytopenie, Thrombozytopenie und Anämie gerechnet und an zwei unabhängigen Datensätzen, auch unter Rituximab-haltigen Chemotherapieschemata, validiert. Die hier entwickelten Modelle konnten ein breites Heterogenitätsspektrum für die hämatologischen Nebenwirkungen erklären. Bemerkenswert ist, dass einige der Faktoren für hämatologische Nebenwirkungen gleichzeitig auch Faktoren des Internationalen Prognostischen Index für das Therapieergebnis sind. Die im ersten Chemotherapiezyklus beobachtete Nebenwirkung war der stärkste prognostische Faktor. Mit einigen der Modelle konnte die kumulative Nebenwirkung über die Chemotherapiezyklen hinweg gezeigt werden. Die Demonstration des Zusammenhangs zwischen den für Leukozytopenie ermittelten Risikogruppen und den klinisch relevanten Größen Infektion, Antibiotikagabe, Hospitalisierungstage und therapieassoziierte Todesfälle ist ein sehr wichtiges Ergebnis der Arbeit. Es wurde eine Internetseite (www.toxcalculator.com) entwickelt, welche den Ärzten die Möglichkeit bietet, die bei dem Patienten vorliegenden Prognosefaktoren einzugeben und dann die Modellvorhersagen für die zu erwartenden hämatologischen Nebenwirkungen zu erhalten. Die Ergebnisse der Arbeit wurden in der hochrangigen Zeitschrift ‚Annals of Oncology‘ publiziert (Ziepert et al. 2008).

Derzeit ist es gängige Praxis, die Chemotherapie entsprechend der Körperoberfläche des Patienten zu dosieren. Diese Praxis ist jedoch nicht ideal, da es Patienten gibt, die starke Nebenwirkungen haben und andere, die kaum Nebenwirkungen aufweisen. Damit intelligentere Dosierungsschemata entwickelt werden können und prophylaktische Maßnahmen zum Verhindern von Therapienebenwirkungen besser geplant werden können, ist die Kenntnis der Faktoren erforderlich, welche die Nebenwirkungen verursachen. Die hämatologischen Nebenwirkungen der Chemotherapie sind dabei am stärksten ausgeprägt und führen oft zu Dosiserosionen, Zeitverschiebungen zwischen den Chemotherapiezyklen oder sogar zu einem Abbruch der Therapie. Das hat wiederum negative Auswirkungen auf den Therapieerfolg. In dieser Arbeit wurden daher Prognosemodelle für chemotherapieinduzierte hämatologische Nebenwirkungen aufgebaut. Die Daten von 1399 Patienten mit aggressivem Non-Hodgkin-Lymphom und einem breiten Altersspektrum von 18-75 Jahren aus der NHL-B1/B2-Studie (Pfreundschuh et al. 2004a und b) gingen in die Analyse ein. Es wurden für die jüngeren (<= 60 Jahre) und die älteren Patienten (> 60 Jahre) multivariate Proportionale Odds Regressionsmodelle für die drei hämatopoetischen Linien der Leukozytopenie, Thrombozytopenie und Anämie gerechnet und an zwei unabhängigen Datensätzen, auch unter Rituximab-haltigen Chemotherapieschemata, validiert. Die hier entwickelten Modelle konnten ein breites Heterogenitätsspektrum für die hämatologischen Nebenwirkungen erklären. Bemerkenswert ist, dass einige der Faktoren für hämatologische Nebenwirkungen gleichzeitig auch Faktoren des Internationalen Prognostischen Index für das Therapieergebnis sind. Die im ersten Chemotherapiezyklus beobachtete Nebenwirkung war der stärkste prognostische Faktor. Mit einigen der Modelle konnte die kumulative Nebenwirkung über die Chemotherapiezyklen hinweg gezeigt werden. Die Demonstration des Zusammenhangs zwischen den für Leukozytopenie ermittelten Risikogruppen und den klinisch relevanten Größen Infektion, Antibiotikagabe, Hospitalisierungstage und therapieassoziierte Todesfälle ist ein sehr wichtiges Ergebnis der Arbeit. Es wurde eine Internetseite (www.toxcalculator.com) entwickelt, welche den Ärzten die Möglichkeit bietet, die bei dem Patienten vorliegenden Prognosefaktoren einzugeben und dann die Modellvorhersagen für die zu erwartenden hämatologischen Nebenwirkungen zu erhalten. Die Ergebnisse der Arbeit wurden in der hochrangigen Zeitschrift ‚Annals of Oncology‘ publiziert (Ziepert et al. 2008).

Diagnostische und therapeutische Entscheidungen hängen bei der Behandlung von VLBW Frühgeborenen ( / In very low birth weight (VLBW) infants, diagnostic and therapeutic decisions depend on hematologic values. As few data are available, we studied the course during the first 6 weeks of life. Four prospective longitudinal cohort studies were retrospectively combined assessing hematologic profiles of 562 VLBW infants. We showed by metaanalysis that the values between the different four studies are not significantly different. For characterization of red blood cells and ferritin, infants receiving erythropoietin were excluded. For characterization of white blood cells and platelets, infants receiving antibiotics were excluded. Red cell parameters of VLBW infants were significantly lower than those of mature newborns. 29% of VLBW infants have thromboctopenia at the age of 3 days. Neutrophils decreased steadily, and were

Graft-versus-host disease (GvHD) remains one of the major complications following allogeneic haematopoietic stem cell transplantation (allo-HSCT). GvHD can occur in almost every tissue, with the skin, liver, and intestines being the mainly affected organs. T cells are implicated in initiating GvHD. T cells identify a broad range of antigens and mediate the immune response through receptors on their surfaces (T cell receptors, TCRs). The composition of TCRs within a T cell population defines the TCR repertoire of an individual, and this repertoire represents exposure to self and non-self proteins. Monitoring the changes in the TCR repertoire using TCR sequencing can provide an indication of the dynamics of a T cell population. Monitoring the frequency and specificities of specific TCR clonotypes longitudinally in different conditions and specimens (peripheral blood, GvHD-affected tissue samples) can provide insights into factors modulating immune reactions following allogeneic transplantation and will help to understand the underlying mechanisms mediating GvHD. This review provides insights into current studies of the TCR repertoire in GvHD and potential future clinical implications of TCR sequencing.

Da topische Glucocorticoide im Vergleich zur parenteralen Anwendung weniger systemische (Neben)Wirkungen haben können, werden sie bevorzugt in der Human- und Veterinärmedizin eingesetzt. Jedoch konnte bei vielen Untersuchungen gezeigt werden, dass topische Glucocorticoide je nach Applikationsdauer, -ort, Wirkstoffpotenz, -dosis und Behandlungsfläche ausgeprägte messbare Reaktionen wie Suppression der HHNA und der Immunzellen hervorrufen können. Beim Pferd wurden jedoch dahingehend bisher keine Untersuchungen durchgeführt. Da Glucocorticoide im Pferdesport auch dopingrelevant sind wurde der Frage nachgegangen, ob nach der dermalen Applikation eines niederpotenten Glucocorticoidpräparates auf die Haut gesunder Pferde systemische Effekte auftreten können und ob ein, nach perkutaner Resorption auftretender, Wirkstoffspiegel im Blut gemessen werden kann. Im Rahmen dieser Dissertation standen 10 erwachsene, klinisch gesunde Versuchspferde zur Verfügung. Die Versuchsdurchführung erfolgte in 3 Phasen. Vor Behandlungsbeginn (Tag 0) wurden von jedem Pferd die Kontrolldaten erfasst. Die Applikation der Dexamethasonformulierung erfolgte über einen Zeitraum von 10 Tagen. 2 mal täglich wurden 50 g einer 0,017 %igen Dexamethasonemulsion auf eine definierte Hautfläche (30 x 50 cm) aufgetragen. Die Blutentnahmen zur Gewinnung der Proben erfolgten am 2., 6., 8., und 10. Tag der Behandlung. Die Nachbehandlungsphase erstreckte sich über einen Zeitraum von 20 Tagen ohne die Dexamethasonanwendung. Hier erfolgte die Probengewinnung an den Tagen 3, 7, 11, 14 und 20 nach Absetzen der Behandlung. Aus den gewonnenen Plasmaproben wurden die Konzentrationen von Cortisol, Insulin, T3 und T4 mittels Radioimmunoassay bestimmt, sowie die ACTH-Konzentrationen mittels Chemilumineszenz-Enzymimmunometrischem Assay. Darüber hinaus wurden die hämatologischen und blutchemischen Parameter gemessen. Die Funktion des negativen Feetback-Mechanismus der Hypothalamus-Hypophysen-Nebennierenrinden-Achse wurde mittels eines ACTH-Stimulationstests überprüft. Während der Behandlung konnte eine ausgeprägte Suppression der Nebennierenrindenfunktion, gekennzeichnet durch die signifkante Abnahme der basalen Cortisolkonzentration, auf weniger als 10 % der Ausgangswerte vor der Behandlung gemessen werden. Auch der ACTH-Stimulationstest am 8. Behandlungstag zeigte einen signifikant geringeren Anstieg des Kortisolspiegels (< 50 %) als vor der Behandlung. Weiterhin kam es während der dermalen Verabreichung von Dexamethason zu einer progressiven, signifikanten Zunahme des Serumglucosespiegels bis um das 1,5 fache des Kontrollwertes. Parallel dazu stieg der Plasmainsulinspiegel um das 3-fache des Ausgangswertes vor Behandlungsbeginn. Die Plasmakonzentration von T3 zeigte einen leichten behandlungsbedingten Abfall, wohingegen der Plasma-T4-Spiegel einen deutlichen Rückgang auf 50 % des Ausgangswertes zeigte. Die endokrinologischen Veränderungen waren nach Absetzen der Behandlung alle reversibel. Weiterhin kam es zu einer signifikanten Reduktion der eosinophilen Granulozyten und der Lymphozyten, während die Zahl der Neutrophilen zunahm. Plasmakonzentrationen von Dexamethason konnten mit einem Maximalwert am 8. Tag der Behandlung (1542,10 ± 567 pg/ml) gemessen werden. Diese Ergebnisse belegen, dass bei der dermalen Applikation von Dexamethason eine perkutane Wirkstoffresorption in einem Umfang stattfindet, dass die typischen systemischen Glucocorticoidwirkungen auftreten. Es kann somit auch davon ausgegangen werden, dass die topische Verabreichung schwach wirksamer Glucocorticoidformulierungen eine gewisse Dopingrelevanz besitzt.

Da topische Glucocorticoide im Vergleich zur parenteralen Anwendung weniger systemische (Neben)Wirkungen haben können, werden sie bevorzugt in der Human- und Veterinärmedizin eingesetzt. Jedoch konnte bei vielen Untersuchungen gezeigt werden, dass topische Glucocorticoide je nach Applikationsdauer, -ort, Wirkstoffpotenz, -dosis und Behandlungsfläche ausgeprägte messbare Reaktionen wie Suppression der HHNA und der Immunzellen hervorrufen können. Beim Pferd wurden jedoch dahingehend bisher keine Untersuchungen durchgeführt. Da Glucocorticoide im Pferdesport auch dopingrelevant sind wurde der Frage nachgegangen, ob nach der dermalen Applikation eines niederpotenten Glucocorticoidpräparates auf die Haut gesunder Pferde systemische Effekte auftreten können und ob ein, nach perkutaner Resorption auftretender, Wirkstoffspiegel im Blut gemessen werden kann. Im Rahmen dieser Dissertation standen 10 erwachsene, klinisch gesunde Versuchspferde zur Verfügung. Die Versuchsdurchführung erfolgte in 3 Phasen. Vor Behandlungsbeginn (Tag 0) wurden von jedem Pferd die Kontrolldaten erfasst. Die Applikation der Dexamethasonformulierung erfolgte über einen Zeitraum von 10 Tagen. 2 mal täglich wurden 50 g einer 0,017 %igen Dexamethasonemulsion auf eine definierte Hautfläche (30 x 50 cm) aufgetragen. Die Blutentnahmen zur Gewinnung der Proben erfolgten am 2., 6., 8., und 10. Tag der Behandlung. Die Nachbehandlungsphase erstreckte sich über einen Zeitraum von 20 Tagen ohne die Dexamethasonanwendung. Hier erfolgte die Probengewinnung an den Tagen 3, 7, 11, 14 und 20 nach Absetzen der Behandlung. Aus den gewonnenen Plasmaproben wurden die Konzentrationen von Cortisol, Insulin, T3 und T4 mittels Radioimmunoassay bestimmt, sowie die ACTH-Konzentrationen mittels Chemilumineszenz-Enzymimmunometrischem Assay. Darüber hinaus wurden die hämatologischen und blutchemischen Parameter gemessen. Die Funktion des negativen Feetback-Mechanismus der Hypothalamus-Hypophysen-Nebennierenrinden-Achse wurde mittels eines ACTH-Stimulationstests überprüft. Während der Behandlung konnte eine ausgeprägte Suppression der Nebennierenrindenfunktion, gekennzeichnet durch die signifkante Abnahme der basalen Cortisolkonzentration, auf weniger als 10 % der Ausgangswerte vor der Behandlung gemessen werden. Auch der ACTH-Stimulationstest am 8. Behandlungstag zeigte einen signifikant geringeren Anstieg des Kortisolspiegels (< 50 %) als vor der Behandlung. Weiterhin kam es während der dermalen Verabreichung von Dexamethason zu einer progressiven, signifikanten Zunahme des Serumglucosespiegels bis um das 1,5 fache des Kontrollwertes. Parallel dazu stieg der Plasmainsulinspiegel um das 3-fache des Ausgangswertes vor Behandlungsbeginn. Die Plasmakonzentration von T3 zeigte einen leichten behandlungsbedingten Abfall, wohingegen der Plasma-T4-Spiegel einen deutlichen Rückgang auf 50 % des Ausgangswertes zeigte. Die endokrinologischen Veränderungen waren nach Absetzen der Behandlung alle reversibel. Weiterhin kam es zu einer signifikanten Reduktion der eosinophilen Granulozyten und der Lymphozyten, während die Zahl der Neutrophilen zunahm. Plasmakonzentrationen von Dexamethason konnten mit einem Maximalwert am 8. Tag der Behandlung (1542,10 ± 567 pg/ml) gemessen werden. Diese Ergebnisse belegen, dass bei der dermalen Applikation von Dexamethason eine perkutane Wirkstoffresorption in einem Umfang stattfindet, dass die typischen systemischen Glucocorticoidwirkungen auftreten. Es kann somit auch davon ausgegangen werden, dass die topische Verabreichung schwach wirksamer Glucocorticoidformulierungen eine gewisse Dopingrelevanz besitzt.