Le cancer du sein est le cancer le plus répandu chez les Canadiennes. Grâce aux avancées technologiques et scientifiques, l'incidence de ce cancer est stable depuis une quinzaine d'année et le taux de mortalité diminue. Le plus important dans le traitement du cancer est un diagnostic précoce et un suivi de la thérapie bien adapté au type de cancer. La tomographie d'émission par positrons (TEP) permet de visualiser la distribution spatiale et temporelle de molécules radiomarquées. Le principal traceur utilisé en oncologie, le 2-deoxy-2-[18]Fluoro-D-deoxyglucose ( 18 [F]FDG), est un analogue du glucose. Il permet de visualiser les tumeurs et d'évaluer le métabolisme du glucose dans les cellules. Par contre, il a une lacune importante : il n'est pas spécifique aux cellules cancéreuses car il marque les cellules qui ont un métabolisme du glucose élevé. Malgré cela, le FDG reste un traceur très utilisé. Cependant, le développement de nouveaux composés spécifiques à certains récepteurs surexprimés dans différents types de cancer reste une idée à exploiter afin d'améliorer l'imagerie TEP. Le neuropeptide Y (NPY) est un peptide de 36 acides aminés qui est un neurotransmetteur très abondant dans le système nerveux central et périphérique. Il a plusieurs rôles physiologiques importants. Il est un stimulateur puissant de la prise de nourriture, un anxiolytique et un puissant vasoconstricteur. Quatre types de récepteurs humains ont été clonés, soient : Y1R, Y2R, Y4R et Y5R. Le récepteur Y1 est présent dans 85% des carcinomes mammaires primaires chez l'humain. Dans les tissus sains, le récepteur Y2 est exprimé de façon prédominante tandis que sur les cellules cancéreuses, c'est l'expression du récepteur YI qui prédomine. Le ratio de l'expression Y1/Y2 pourrait donc être exploité afin de détecter de façon plus précoce le cancer du sein. La bombésine (BBN), un peptide de 14 acides amines, a été découvert chez la grenouille Bombina Bombina . L'équivalent humain du BBN, le GRP possède 27 acides amines. La bombésine se lie à 3 types de récepteurs humains dont le récepteur à relâche de gastrine (GRPR). Il est surexprimé dans 65% des cas de carcinomes canalaires in situ . Le GRPR peut également être utilisé comme marqueur du caractère malin dans les cas de cancer. Un hétérodimère est l'union de deux molécules différentes pour n'en former qu'une seule. Dû au fait que les récepteurs Y1 et GRP ne sont pas surexprimés dans 100% des cas de cancer du sein l'utilisation d'une seule molécule qui ciblerait à la fois les deux récepteurs serait avantageuse pour l'imagerie du cancer du sein. Les avantages à l'utilisation d'un hétérodimère plutôt qu'un mélange de deux composés radioactifs sont : une dose de radioactivité administrée moins grande pour le même résultat et les interactions possibles entre les composés sont évitées. Puisque deux récepteurs surexprimés dans les cas de cancer du sein sont visés du même coup par le peptide, une plus grande captation tumorale est attendue. Le premier objectif de l'étude est de développer un peptide capable de lier spécifiquement le récepteur Y1 du NPY dans les cas de cancer du sein. Le second objectif est de développer un peptide hétérodimère ciblant préférentiellement les récepteurs Y1 et GRP dans les cas de cancer du sein. Les peptides seront combinés à un radio-isotope, le 64 Cu, afin de permettre l'imagerie TEP. Plusieurs techniques seront utilisées pour caractériser les différents peptides incluant des études de compétition in vitro , de stabilité plasmatique ainsi que de biodistribution. Afin d'évaluer tout le potentiel du traceur hétérodimère, une étude comparative entre ce dernier et les deux traceurs monomères sera présentée."--Résumé abrégé par UMI

Dans ce manuscrit, nous démontrons par le biais de dimères forcés que toutes les propriétés oncogéniques de la protéine TWIST1, telles qu'évaluées par le biais de nombreux tests in vitro (tests de complémentation, inhibition de la sénescence oncogénique, induction de l'EMT et tests de coopération oncogénique…), sont spécifiquement attribués au complexe TWIST1-E12. L'insertion de mutations ponctuelles, définies d'après l'analyse de modèles de simulation in silico développés au sein du laboratoire (Bouard et al., 2013) et perturbant la dimérisation du complexe ou encore son interaction avec l'ADN conduit à une perte complète de l'activité, validant l'importance des deux partenaires dans l'activité oncogénique de la protéine de fusion. La détection du complexe TWIST1-E12 dans des carcinomes mammaires canalaires in situ humains, récapitulant les phases précoces de l'initiation tumorale, par la technique de Proximity Ligation Assay (PLA) ainsi que la sensibilité accrue de souris transgéniques à développer des carcinomes mammaires lorsque le complexe hétérodimérique est exprimé dans les cellules épithéliales luminales mammaires, renforce la conclusion que le complexe TWIST1-E12 est la (ou l'une des) forme(s) active(s) de la protéine TWIST1 dans le cadre de la carcinogenèse mammaire / Among embryonic transcription factors, TWIST proteins (TWIST1 and TWIST2) display the particularity to behave as master regulators of both RB and p53-oncosuppressive pathways. These embryonic transcription factors annihilate the induction of numerous cyclin-kinase inhibitors, including p16INK4A, p15INK4B and p21CIP1, abrogating thereby cell commitment to a senescence program or their death through apoptosis in response to an oncogenic activation. By doing so, TWIST proteins cooperate with mitogenic oncoproteins such as Ras in promoting cell transformation in vitro and breast and lung carcinogenesis in vivo (Ansieau S. et al. Cancer Cell ; Morel A-P. et al., PLoS ONE ; Tran P.T. et al., PLoS Genetics). Strikingly, TWIST depletion in numerous cancer cell types associates with a reactivation of failsafe programs, suggesting that some tumor cells remain addictive to TWIST for survival and proliferation (Ansieau et al., 2008). In support of this hypothesis, silencing TWIST expression in a TWIST + RAS-driven lung carcinogenesis mouse model displays a cytostatic effect (Tran P.T. et al., PLoS Genetics). Based on these observations, we aim at identifying TWIST specific inhibitors and evaluate the efficiency of such molecules in eradicating tumor cells in vitro as well as in vivo. TWIST proteins either behave as homodimeric (TT) or heterodimeric (TE) complexes (in association with E2A proteins), both complexes displaying distinct and sometimes even antagonistic functions during the embryonic development (Firulli B.A. et al., Nature Genetics ; Connerney F. et al., Dev. Dynamics). Ongoing experiments, comparing activities of tethered TWIST dimers, strongly support the assumption that an oncogenic potential is specifically allotted to the heterodimer. To screen for specific chemical inhibitors, we first established the in silico structure of the bHLH domain of TWIST complexes bound to their cis-responsive elements, by analogy with the NeuroD/E47 crystallographic structure. Relevance of these models has been confirmed through analysis of Twist1 variants associated with a loss of function in Saethre-Chotzen patients (Bouard et al., J. Biomolecular Structure & Dynamics). Strikingly, structural analysis highlights the importance of lateral loops in stabilizing the protein-DNA complex and in specifying the DNA sequence targeted

Grâce à un grand nombre d’études biochimiques, génétiques et structurales effectuées dans les dernières années, des avancements considérables ont été réalisés et une nouvelle vision du processus par lequel la machinerie transcriptionnelle de l’ARN polymérase II (Pol II) décode l’information génétique a émergé. De nouveaux indices ont été apportés sur la diversité des mécanismes de régulation de la transcription, ainsi que sur le rôle des facteurs généraux de transcription (GTFs) dans cette diversification. Les travaux présentés dans cette thèse amènent de nouvelles connaissances sur le rôle des GTFs humains dans la régulation des différentes étapes de la transcription. Dans la première partie de la thèse, nous avons analysé la fonction de la Pol II et des GTFs humains, en examinant de façon systématique leur localisation génomique. Les patrons obtenus par immunoprécipitation de la chromatine (ChIP) des versions de GTFs portant une étiquette TAP (Tandem-Affinity Purification) indiquent de nouvelles fonctions in vivo pour certains composants de cette machinerie et pour des éléments structuraux de la Pol II. Nos résultats suggèrent que TFIIF et l’hétérodimère Rpb4–Rpb7 ont une fonction spécifique pendant l’étape d’élongation transcriptionnelle in vivo. De plus, notre étude amène une première image globale de la fonction des GTFs pendant la réaction transcriptionnelle dans des cellules mammifères vivantes. Deuxièmement, nous avons identifié une nouvelle fonction de TFIIS dans la régulation de CDK9, la sous-unité kinase du facteur P-TEFb (Positive Transcription Elongation Factor b). Nous avons identifié deux nouveaux partenaires d’interaction pour TFIIS, soit CDK9 et la E3 ubiquitine ligase UBR5. Nous montrons que UBR5 catalyse l’ubiquitination de CDK9 in vitro. De plus, la polyubiquitination de CDK9 dans des cellules humaines est dépendante de UBR5 et TFIIS. Nous montrons aussi que UBR5, CDK9 and TFIIS co-localisent le long du gène  fibrinogen (FBG) et que la surexpression de TFIIS augmente les niveaux d’occupation par CDK9 de régions spécifiques de ce gène, de façon dépendante de UBR5. Nous proposons que TFIIS a une nouvelle fonction dans la transition entre les étapes d’initiation et d’élongation transcriptionnelle, en régulant la stabilité des complexes CDK9-Pol II pendant les étapes précoces de la transcription. / Biochemical, genetic and structural studies made over the last years bring a new view on the RNA polymerase II (Pol II) machinery and the process by which it decodes the genetic information. They provided new insights into the diversity of the transcriptional regulation mechanisms, and on the role played by the general transcription factors (GTFs). The studies presented in this thesis provide new evidence on the role of human GTFs in the regulation of different stages of transcription. In the first part of the thesis, we investigated the function of the human Pol II and GTFs in living cells, by systematically analyzing their genomic location. The location profiles obtained by chromatin immunoprecipitation (ChIP) of TAP (tandem-affinity purification) tagged versions of these factors indicate new in vivo functions for several components of this machinery, and for structural elements of the Pol II. These results suggest that TFIIF and the heterodimer Rpb4–Rpb7 have a specific function during the elongation stage in vivo. Additionally, our study offers for the first time a general picture of GTFs function during the Pol II transcription reaction in live mammalian cells, and provides a framework to uncover new regulatory hubs. Secondly, we report on the identification of a new function of the factor TFIIS in the regulation of CDK9, the kinase subunit of the Positive Transcription Elongation Factor b (P-TEFb). We identify two interaction partners for TFIIS, namely CDK9 and the E3 ubiquitin ligase UBR5. We show that UBR5 catalyzes the ubiquitination of CDK9 in vitro. Moreover, the polyubiquitination of CDK9 in human cells is dependent upon both UBR5 and TFIIS, and does not signal its degradation. We also show that UBR5, CDK9 and TFIIS co-localize along specific regions of the  fibrinogen (FBG) gene, and that the overexpression of TFIIS increases the occupancy of CDK9 along this gene in a UBR5 dependant manner. We propose a new function of TFIIS in the transition between initiation and elongation stages, by regulating the stability of the early CDK9-Pol II transcribing complexes. Key words: chromatin immunoprecipitation, general transcription factors, tandem-affinity purification, RNA polymerase II, Rpb4–Rpb7 heterodimer, transcription factor IIF (TFIIF), transcription factor IIS (TFIIS), UBR5 ubiquitin ligase, Positive Transcription Elongation Factor b (P-TEFb), CDK9 ubiquitination.

Grâce à un grand nombre d’études biochimiques, génétiques et structurales effectuées dans les dernières années, des avancements considérables ont été réalisés et une nouvelle vision du processus par lequel la machinerie transcriptionnelle de l’ARN polymérase II (Pol II) décode l’information génétique a émergé. De nouveaux indices ont été apportés sur la diversité des mécanismes de régulation de la transcription, ainsi que sur le rôle des facteurs généraux de transcription (GTFs) dans cette diversification. Les travaux présentés dans cette thèse amènent de nouvelles connaissances sur le rôle des GTFs humains dans la régulation des différentes étapes de la transcription. Dans la première partie de la thèse, nous avons analysé la fonction de la Pol II et des GTFs humains, en examinant de façon systématique leur localisation génomique. Les patrons obtenus par immunoprécipitation de la chromatine (ChIP) des versions de GTFs portant une étiquette TAP (Tandem-Affinity Purification) indiquent de nouvelles fonctions in vivo pour certains composants de cette machinerie et pour des éléments structuraux de la Pol II. Nos résultats suggèrent que TFIIF et l’hétérodimère Rpb4–Rpb7 ont une fonction spécifique pendant l’étape d’élongation transcriptionnelle in vivo. De plus, notre étude amène une première image globale de la fonction des GTFs pendant la réaction transcriptionnelle dans des cellules mammifères vivantes. Deuxièmement, nous avons identifié une nouvelle fonction de TFIIS dans la régulation de CDK9, la sous-unité kinase du facteur P-TEFb (Positive Transcription Elongation Factor b). Nous avons identifié deux nouveaux partenaires d’interaction pour TFIIS, soit CDK9 et la E3 ubiquitine ligase UBR5. Nous montrons que UBR5 catalyse l’ubiquitination de CDK9 in vitro. De plus, la polyubiquitination de CDK9 dans des cellules humaines est dépendante de UBR5 et TFIIS. Nous montrons aussi que UBR5, CDK9 and TFIIS co-localisent le long du gène  fibrinogen (FBG) et que la surexpression de TFIIS augmente les niveaux d’occupation par CDK9 de régions spécifiques de ce gène, de façon dépendante de UBR5. Nous proposons que TFIIS a une nouvelle fonction dans la transition entre les étapes d’initiation et d’élongation transcriptionnelle, en régulant la stabilité des complexes CDK9-Pol II pendant les étapes précoces de la transcription. / Biochemical, genetic and structural studies made over the last years bring a new view on the RNA polymerase II (Pol II) machinery and the process by which it decodes the genetic information. They provided new insights into the diversity of the transcriptional regulation mechanisms, and on the role played by the general transcription factors (GTFs). The studies presented in this thesis provide new evidence on the role of human GTFs in the regulation of different stages of transcription. In the first part of the thesis, we investigated the function of the human Pol II and GTFs in living cells, by systematically analyzing their genomic location. The location profiles obtained by chromatin immunoprecipitation (ChIP) of TAP (tandem-affinity purification) tagged versions of these factors indicate new in vivo functions for several components of this machinery, and for structural elements of the Pol II. These results suggest that TFIIF and the heterodimer Rpb4–Rpb7 have a specific function during the elongation stage in vivo. Additionally, our study offers for the first time a general picture of GTFs function during the Pol II transcription reaction in live mammalian cells, and provides a framework to uncover new regulatory hubs. Secondly, we report on the identification of a new function of the factor TFIIS in the regulation of CDK9, the kinase subunit of the Positive Transcription Elongation Factor b (P-TEFb). We identify two interaction partners for TFIIS, namely CDK9 and the E3 ubiquitin ligase UBR5. We show that UBR5 catalyzes the ubiquitination of CDK9 in vitro. Moreover, the polyubiquitination of CDK9 in human cells is dependent upon both UBR5 and TFIIS, and does not signal its degradation. We also show that UBR5, CDK9 and TFIIS co-localize along specific regions of the  fibrinogen (FBG) gene, and that the overexpression of TFIIS increases the occupancy of CDK9 along this gene in a UBR5 dependant manner. We propose a new function of TFIIS in the transition between initiation and elongation stages, by regulating the stability of the early CDK9-Pol II transcribing complexes. Key words: chromatin immunoprecipitation, general transcription factors, tandem-affinity purification, RNA polymerase II, Rpb4–Rpb7 heterodimer, transcription factor IIF (TFIIF), transcription factor IIS (TFIIS), UBR5 ubiquitin ligase, Positive Transcription Elongation Factor b (P-TEFb), CDK9 ubiquitination.