Η γονιδιακή θεραπεία θεωρείται μια πολλά υποσχόμενη προσέγγιση για την αντιμετώπιση διαφόρων ασθενειών, καθώς για αρκετές από αυτές δεν υπάρχει ουσιαστική θεραπεία παρά μόνο αντιμετώπιση των συμπτωμάτων. Οι αιμοσφαιρινοπάθειες ως μονογονιδιακές ασθένειες έχουν θεωρηθεί εδώ και πολλά χρόνια εξαιρετικά μοντέλα ασθενειών για τη γονιδιακή θεραπεία. Επιπλέον, ο μοριακός μηχανισμός της νόσου είναι από τους καλύτερα μελετημένους. Οι στρατηγικές που χρησιμοποιούνται στις προσπάθειες γονιδιακής θεραπείας των αιμοσφαιρινοπαθειών περιλαμβάνουν: Μεταφορά του φυσιολογικού γονιδίου β, κυρίως σε αρχέγονα αιμοποιητικά κύτταρα, και Προσπάθεια ενεργοποίησης των γ γονιδίων, καθώς ασθενείς με β- θαλασσαιμία και κληρονομική παραμονή της εμβρυϊκής αιμοσφαιρίνης παρουσιάζουν σχεδόν φυσιολογικό φαινότυπο. Όσον αφορά τη γονιδιακή μεταφορά, αυτή γίνεται κατά κύριο λόγο με ιϊκά συστήματα. Ωστόσο, οι φορείς αυτοί παρουσιάζουν ορισμένα μειονεκτήματα με κυριότερα την πρόκληση ανοσολογικών αντιδράσεων και την in vitro μεταλλαξιγένεση λόγω ενσωμάτωσης. Για το λόγο αυτό, τα τελευταία χρόνια οι έρευνες έχουν στραφεί στην κατασκευή επισωματικών φορέων που θεωρούνται γενικά πιο ασφαλείς καθώς δεν ενσωματώνονται στο γενετικό υλικό των κυττάρων. Σημαντικό βήμα στην ανάπτυξη επισωματικών φορέων για την γονιδιακή θερπαπεία των αιμοσφαιρινοπαθειών, επιτεύχθηκε με την κατασκευή του φορέα pEPI-eGFP ο οποίος έχει την ικανότητα να διατηρείται σε επισωματική κατάσταση χάρη στην αλληλουχία S/MAR που περιέχει και η οποία προέρχεται από το 5΄ άκρο του ανθρώπινου γονιδίου της ιντερφερόνης β. Επιπλέον, έρευνες στο παρελθόν έχουν δείξει ότι το mini LCR της β-σφαιρίνης είναι απαραίτητο για την υψηλή και ιστο-ειδική έκφραση του γενετικού τόπου της β-σφαιρίνης. Σκοπός της παρούσας εργασίας είναι η κατασκευή ενός επισωματικού φορέα που θα βασίζεται στον φορέα pEPI-eGFP και ο οποίος αποτελεί ενδιάμεσο στάδιο για την κατασκευή ενός κοσμιδιακού φορέα που θα περιλαμβάνει το mini locus της β-σφαιρίνης. / Gene therapy is considered many promising approach for the confrontation of enough various illnesses, while for from them does not exist essential treatment only that confrontation of symptoms. Haemoglobinopathies as monogenic disorders have been considered for many years exceptional models for gene therapy. Moreover, the molecular mechanism of haemoglobinopathies is very well studied. The strategies that are used in the efforts of gene therapy haemoglobinopathies include: Transport of physiologic gene b, mainly in original stem cells, and Effort of activation of γ-globin genes, since patients with b thalassaemia and hereditary presence of embrionic haemoglobin show almost physiologic phrenotype. With regard to the pertaining to genes transport, this becomes in the first place with virus systems. However, this vectors present certain disadvantages with mainly the challenge of immunological reactions and in vitro metallaxigenesi because incorporation. For this reason, in the past few year the researches have been turned in the manufacture of episomal vectors that is considered in general sure while is not incorporated in the genetic material of cells. Important step in the growth of episomal vectors for gene therapy of haemoglobinopathies, was achieved with the manufacture of pEPI-eGFP which has the faculty to be maintained in episomal situation thanks to the concatenation S/MAR that it contains and which is emanated from the 5΄ of the human gene of interferon β. Moreover, researches in the past have shown that mini LCR of b-globin is essential for high and specific expression of genetic place of b-globin. Aim of present work is the manufacture of episomal vector that will be based on the institution pEPI-eGFP and which constitutes intermediary stage for the manufacture of cosmidial vector that will include the mini locus b-globin.

Οι αυτοαναπαραγόμενοι επισωματικοί φορείς γονιδιακής μεταφοράς αποτελούν πολλά υποσχόμενους φορείς γονιδιακής θεραπείας. Στην παρούσα εργασία δημιουργήθηκε ο φορέας Zif-VP64-EP2 στα πλαίσια των μελετών γονιδιακής θεραπείας για τις αιμοσφαιρινοπάθειες. Πρόκειται για ένα κυκλικό πλασμίδιο, που φέρει το γονίδιο ενός τεχνητού μεταγραφικού παράγοντα της γ-σφαιρίνης του Zif-VP64 υπό την επενέργεια του ισχυρού υποκινητή pSFFV καθώς και τo γονίδιο της eGFP με το S/MAR στοιχείο από την περιοχή 5’ του γονιδίου της ανθρώπινης ιντερφερόνης β υπό την επενέργεια του υποκινητή pCMV. Διαπιστώθηκε ότι το Zif-VP64-EP2 μεσολαβεί γονιδιακή μεταφορά σε διαμολυσμένα κύτταρα της ανθρώπινης κυτταρικής σειράς Κ562. Η μακράς διάρκειας διαμολυσμένη καλλιέργεια (3 μήνες) καταδεικνύει ότι το όχημα είναι λειτουργικό και διατηρείται ως επισωματικό σε Κ562 κύτταρα διαμολυσμένα κύτταρα με το Zif-VP64- ΕΡ2. / Self-replicating episomal vectors for gene transfer are a new and very promising experimental approach to gene therapy. In this study, it was created the vector Zif-VP64-EP2, within the context of developing self-replicating episomal vectors for the gene therapy of hemoglobinopathies. Zif-VP64-EP2 is a circular plasmid which includes the gene of an artificial transcription factor for gamma globin: Zif-VP64 under the control of pSFFV promoter and the gene of eGFP with the S/MAR element from the region 5’ of the human interferon β gene under the control of pCMV promoter. It was established that Zif-VP64-EP2 was retained within the transfected Κ562 hematopoietic progenitor cell. Its episomal situation for a long time (3 months) and its normal expression in K562 human cells constitutes a proof of the utility of Zif-VP64- ΕΡ2 system in gene therapy applications.