Η γονιδιακή θεραπεία θεωρείται μια πολλά υποσχόμενη προσέγγιση για την αντιμετώπιση διαφόρων ασθενειών, καθώς για αρκετές από αυτές δεν υπάρχει ουσιαστική θεραπεία παρά μόνο αντιμετώπιση των συμπτωμάτων. Οι αιμοσφαιρινοπάθειες ως μονογονιδιακές ασθένειες έχουν θεωρηθεί εδώ και πολλά χρόνια εξαιρετικά μοντέλα ασθενειών για τη γονιδιακή θεραπεία. Επιπλέον, ο μοριακός μηχανισμός της νόσου είναι από τους καλύτερα μελετημένους. Οι στρατηγικές που χρησιμοποιούνται στις προσπάθειες γονιδιακής θεραπείας των αιμοσφαιρινοπαθειών περιλαμβάνουν: Μεταφορά του φυσιολογικού γονιδίου β, κυρίως σε αρχέγονα αιμοποιητικά κύτταρα, και Προσπάθεια ενεργοποίησης των γ γονιδίων, καθώς ασθενείς με β- θαλασσαιμία και κληρονομική παραμονή της εμβρυϊκής αιμοσφαιρίνης παρουσιάζουν σχεδόν φυσιολογικό φαινότυπο. Όσον αφορά τη γονιδιακή μεταφορά, αυτή γίνεται κατά κύριο λόγο με ιϊκά συστήματα. Ωστόσο, οι φορείς αυτοί παρουσιάζουν ορισμένα μειονεκτήματα με κυριότερα την πρόκληση ανοσολογικών αντιδράσεων και την in vitro μεταλλαξιγένεση λόγω ενσωμάτωσης. Για το λόγο αυτό, τα τελευταία χρόνια οι έρευνες έχουν στραφεί στην κατασκευή επισωματικών φορέων που θεωρούνται γενικά πιο ασφαλείς καθώς δεν ενσωματώνονται στο γενετικό υλικό των κυττάρων. Σημαντικό βήμα στην ανάπτυξη επισωματικών φορέων για την γονιδιακή θερπαπεία των αιμοσφαιρινοπαθειών, επιτεύχθηκε με την κατασκευή του φορέα pEPI-eGFP ο οποίος έχει την ικανότητα να διατηρείται σε επισωματική κατάσταση χάρη στην αλληλουχία S/MAR που περιέχει και η οποία προέρχεται από το 5΄ άκρο του ανθρώπινου γονιδίου της ιντερφερόνης β. Επιπλέον, έρευνες στο παρελθόν έχουν δείξει ότι το mini LCR της β-σφαιρίνης είναι απαραίτητο για την υψηλή και ιστο-ειδική έκφραση του γενετικού τόπου της β-σφαιρίνης. Σκοπός της παρούσας εργασίας είναι η κατασκευή ενός επισωματικού φορέα που θα βασίζεται στον φορέα pEPI-eGFP και ο οποίος αποτελεί ενδιάμεσο στάδιο για την κατασκευή ενός κοσμιδιακού φορέα που θα περιλαμβάνει το mini locus της β-σφαιρίνης. / Gene therapy is considered many promising approach for the confrontation of enough various illnesses, while for from them does not exist essential treatment only that confrontation of symptoms. Haemoglobinopathies as monogenic disorders have been considered for many years exceptional models for gene therapy. Moreover, the molecular mechanism of haemoglobinopathies is very well studied. The strategies that are used in the efforts of gene therapy haemoglobinopathies include: Transport of physiologic gene b, mainly in original stem cells, and Effort of activation of γ-globin genes, since patients with b thalassaemia and hereditary presence of embrionic haemoglobin show almost physiologic phrenotype. With regard to the pertaining to genes transport, this becomes in the first place with virus systems. However, this vectors present certain disadvantages with mainly the challenge of immunological reactions and in vitro metallaxigenesi because incorporation. For this reason, in the past few year the researches have been turned in the manufacture of episomal vectors that is considered in general sure while is not incorporated in the genetic material of cells. Important step in the growth of episomal vectors for gene therapy of haemoglobinopathies, was achieved with the manufacture of pEPI-eGFP which has the faculty to be maintained in episomal situation thanks to the concatenation S/MAR that it contains and which is emanated from the 5΄ of the human gene of interferon β. Moreover, researches in the past have shown that mini LCR of b-globin is essential for high and specific expression of genetic place of b-globin. Aim of present work is the manufacture of episomal vector that will be based on the institution pEPI-eGFP and which constitutes intermediary stage for the manufacture of cosmidial vector that will include the mini locus b-globin.

Η αύξηση της έκφρασης του γονιδίου της γ-σφαιρίνης και κατ’ επέκταση και της εμβρυικής αιμοσφαιρίνης (HbF), μέσω ενεργοποίησης με φαρμακολογικούς παράγοντες ή μεταφοράς του γονιδίου της γ-σφαιρίνης, αποτελούν σημαντικές στρατηγικές για την θεραπεία της δρεπανοκυτταρικής και μεσογειακής αναιμίας. Καινοτομία αποτελεί η δημιουργία ενός ειδικού συνθετικού ενεργοποιητή της γ-σφαιρίνης, του Zif-VP64, με δομή δακτύλων ψευδαργύρου, ειδικά σχεδιασμένη για πρόσδεση σε αλληλουχία 18bp, περί την θέση -117HPFH του υποκινητή της γ-σφαιρίνης. Επιδίωξη της εργασίας αυτής ήταν η ανάπτυξη ενός μη ιϊκού, επισωματικού φορέα, που φέρει τον συνθετικό ενεργοποιητή του γονιδίου της γ-σφαιρίνης, ικανού να λειτουργεί με επάρκεια σε κύτταρα του αιμοποιητικού ιστού. Η φορέας αυτός, Zif-VP64-Ep1, περιλαμβάνει τον ενεργοποιητή της γ-σφαιρίνης και την μεταγραφική κασέτα CMV-eGFP-S/MAR, για την εξασφάλιση της επισωματικής του κατάστασης μέσω του στοιχείου S/MAR. Τα αποτελέσματά μας δείχνουν ότι ο φορέας Zif-VP64-Ep1: i. διαμολύνει επιτυχώς, K562 κύτταρα σε ποσοστό 45% παραμένοντας σε επισωματική κατάσταση και υποστηρίζοντας έκφραση του διαγονιδίου για τουλάχιστον 200 γενεές, προγονικά κύτταρα μυελού τον οστών ποντικού β-YAC BMCs σε ποσοστό 23% και CD34+ κύτταρα περιφερικού αίματος κινητοποιημένου υγιούς δότη σε ποσοστό 22,5%. ii. ο φορέας Zif-VP64-Ep1 υποστηρίζει σημαντική αύξηση των επιπέδων της γ-σφαιρίνης κατά 3.3±0.2 φορές σε Κ562 και 3.0±1 φορές σε CD34+ κύτταρα, και ενεργοποίηση του ανενεργού γονιδίου γ-σφαιρίνης σε κύτταρα β-YAC BMCs. Επιτυγχάνεται έτσι, για πρώτη φορά, επισωματική γονιδιακή μεταφορά του ενεργοποιητή Zif-VP64 και trans-ενεργοποίηση του γ-γονιδίου σε επίπεδο θεραπευτικής σημασίας. / The increase of HbF through activation of gamma-globin gene is a valid strategy for the treatment of hemoglobinopathies. Zif-VP64 is a selective, synthetic gamma-globin activator, containing a zinc-finger DNA protein that binds the gamma-globin promoter -117HPFH area and a transcription inducer that induces gamma globin gene in K562 cells, after viral transfer. We report the study of an episomal vector of this activator, which is based on a Scaffold/Matrix attachment region (S/MAR) that supports retention of episomes in the nucleus of the host cell. We constructed an episomal vector, Zif-VP64-Ep1, containing the activator Zif-VP64, the reporter gene cassette CMV-eGFP and the S/MAR element. Gene transfer into cells was done by electroporation or nucleofection. Expression of eGFP was documented by Florescent Microscopy and Flow Cytometry, while the fate of vector molecules in the cells was studied by Southern Blot and plasmid rescue experiments. Real time PCR, Western blotting and Intracellular Flow Cytometry were used to investigate gamma-globin mRNA, gamma-globin protein and HbF protein levels respectively. Binding specificity of the activator was determined by Chromatin Immunoprecipitation (ChIP). Gene transfer was done in K562 cells producing long term stable cell lines; murine beta-YAC cells, where the YAC contains the complete human, beta-globin gene locus; and human progenitor hemopoietic CD34+ cells from healthy, mobilized individuals, with transfection efficiencies of 65%, 25% and 23% respectively. In K562 cells, gamma-globin mRNA levels showed an increase of 250%, gamma-globin protein of 350% and HbF protein of 165%, as compared to the corresponding levels in the untransfected K562 cells, at least 200 generations post-transfection. Interestingly, vector Zif-VP64-Ep1 was able to mediate the activation of expression of the silent, human gamma-globin gene of the murine beta-YAC cells, at a level matching the (active) human beta-globin gene of the YAC, as well as the murine beta-globin gene, showing that it can efficiently activate the gamma-globin gene from within a heterochromatic region. Finally and most significantly, vector Zif-VP64-Ep1 was able to transfect the human, hemopoietic progenitor CD34+ cells and to mediate a 3.0±1 fold increase of gamma globin mRNA, compared to untrasnfected CD34+ cells, as estimated in cultures of 7-8 days after transfection. In conclusion, activation of human gamma-globin by episomal gene transfer of a synthetic activator, in three different hemopoietic cells, is documented, including the CD43+ cells, that are the target cells for gene therapy of the Hemoglobinopathies. This is the first time that an S/MAR based episomal vector is used for gene transactivation in a cell line and progenitor cells, aiming at specific gene therapy.

Οι επισωματικοί φορείς αποτελούν την εναλλακτική επιλογή για την μεταφορά γονιδίων σε εφαρμογές γονιδιακής θεραπείας. Διπλασιάζονται αυτόνομα χωρίς να ενσωματώνονται στα χρωμοσώματα του κυττάρου και έτσι στερούνται της σοβαρής παρενέργειας του φαινομένου της μεταλλαξιγένεσης μέσω ενσωμάτωσης. Το ενδιαφέρον ως προς την ανάπτυξη επισωματικών φορέων για την γονιδιακή μεταφορά αυξήθηκε κατακόρυφα τα τελευταία χρόνια μετά την ανάπτυξη του φορέα pEPI-1, ο οποίος περιείχε το στοιχείο S/MAR του γονιδίου της ανθρώπινης βήτα- ιντερφερόνης. Ο φορέας αυτός είχε την ιδιότητα να διατηρείται επισωματικά χωρίς την ανάγκη μεταγραφής κάποιου ιϊκού γονιδίου. Τα στοιχεία S/MAR αποτελούν ετερογενείς περιοχές DNA οι οποίες συνδέονται στην θεμέλια ουσία του πυρήνα, συμμετέχοντας στην οργάνωση του ευκαρυωτικού γονιδιώματος, στην αντιγραφή του DNA και στην ρύθμιση της μεταγραφής. Αποφασίσαμε στην μελετήσουμε την δράση του S/MAR στοιχείου σε ένα διαφορετικό περιβάλλον DNA. Ξεκινώντας από τον φορέα pCEP4 που βασίζεται στα στοιχεία OriP και EBNA-1 του ιού η EBV κατασκευάσαμε τα εξής πλασμίδια: 1) pEBS/eGFP με το S/MAR να είναι κλωνοποιημένο μετά το γονίδιο της eGFP όπως στο pEPI-1. 2) pESdER / eGFP προερχόμενο από το pEBS/eGFP με διαγραφή του γονιδίου EBNA-1 και.3) pCEP4 / eGFP (πλασμίδιο μάρτυρας). Σε αντίθεση με τις προσδοκίες μας μόνο το πλασμιδίου pCEP4 / eGFP ήταν ικανό να εγκαταστήσει σταθερές κυτταρικές σειρές Jurkat. Ο υπολογισμός της αποσταθεροποίησης υπό τάση των παραπάνω πλασμιδίων απέδειξε μια υψηλή ουδό για την αποσταθεροποίηση της περιοχής του OriP, σε αντίθεση με το μητρικό φορέα pCEP4, γεγονός που οφείλεται στον ενεργειακό ανταγωνισμό μεταξύ του OriP και της υψηλά αποσταθεροποιημένης περιοχής του S/MAR. Η αντικατάσταση του OriP στο πλασμίδιο pESdER / eGFP από την περιοχή έναρξης της αντιγραφής το γονίδιο της β-σφαιρίνης (IR) (pESdER-IR/eGFP) έχει ως αποτέλεσμα την αποκατάσταση της επισωματική της κατάστασης, προσδίδοντας επιπλέον και υψηλή μιτωτική σταθερότητα χωρίς την ανάγκη ύπαρξης πίεσης επιλογής σε καλλιέργειες για χρονικό διάστημα τριών μηνών. Συμπεράνουμε ότι το δυναμικό πολλαπλασιασμού ενός επισωματικού συστήματος που περιέχει ένα στοιχείο S/MAR εξαρτάται από την ύπαρξη μιας δεύτερης υψηλά αποσταθεροποιημένης έννοιες περιοχής ικανής να ξεπεράσει την σταθεροποιητική δράση της αλληλουχίας S/MAR. Το γεγονός αυτό προσδίδει μια νέα διάσταση στη σχεδίαση αυτόνομων επισωματικών φορέων, που περιέχει τον υπολογισμό της αποσταθεροποίησης της διπλής έλικας DNA υπό τάση. Η ευρεία χρήση των ρετρο-ιϊκών φορέων ως συστήματα γονιδιακής μεταφοράς σε κλινικές δοκιμές γονιδιακής θεραπείας έφερε στην επιφάνεια την ανάγκη για μια ακριβή εκτίμηση της ασφάλειας των δοκιμών αυτών όσον αφορά το φαινόμενο της μεταλλαξιγένεσης μέσω ενσωμάτωσης. Στην εργασία αυτή αναφέρεται μια νέα μέθοδος για την ανίχνευση των θέσεων ενσωμάτωσης των ρετρο-ιϊκών φορέων που έχει κλινικό προσανατολισμό και ονομάζεται DSCP-PCR( partially Double stranded, Sterically Hindered Primer – PCR). Η μέθοδος αυτή έχει αυξημένη ευαισθησία και ειδικότητα, δεδομένου ότι δεν εξαρτάται από στάδια κατάτμησης με ένζυμα περιορισμού και αντιδράσεις λιγάσης που αποτελούν μέρος των υπαρχόντων μεθόδων (όπως η LAMPCR). Η μείζονα διαφορά ανάμεσα στην DSCP-PCR και στις προηγούμενες PCR μεθόδους συνιστάται στο στάδιο της σύνδεσης της συμπληρωματικής αλυσίδας του DNA όπου χρησιμοποιείται ένας εκκινητής που το ένα άκρο του είναι εκφυλισμένο ενώ το άλλο αποτελείται από διπλή έλικα DNA. Η σχεδίαση αυτή τον καθιστά ικανό να προσδένεται μόνο στο άκρο οποιασδήποτε μονής αλυσίδας. Η μέθοδος αυτή παράγει ένα υψηλά πληροφοριακό σύνολο δεδομένων για τον χαρακτηρισμό των θέσεων ενσωμάτωσης των φορέων. Επίσης μπορεί να χρησιμοποιηθεί για τη σύνθεση του προφίλ των κλώνων που συμμετέχουν στην αιμοποίηση σε κάποια χρονική περίοδο. Η παρακολούθηση το προφίλ αυτού μέσα στον χρόνο δίνει ενδείξεις για την κινητική της αιμοποίησης και κατά συνέπεια της εμφάνιση νέων κλώνων. / Episomal vectors have been considered valid alternatives to viral vectors for gene therapy applications, as they are replicating extrachromosomally and are devoid of the adverse effect of insertional mutagenesis. Interest in the episomal systems was boosted by the development of the pEPI-1 vector, containing the scaffold matrix attachment region (S/MAR) element of the human beta-interferon gene, which confers to it stable episomal status, without the need for transcription of any viral element. S/MARs are heterogeneous DNA regions that attach to the nuclear matrix, participating in the organization of the eukaryotic genome, initiation of DNA replication and regulation of transcription. We decided to study the performance of the S/MAR element in a completely different vector DNA context. Starting from vector pCEP4 (Invitrogen) based on OriP EBV and EBNA-1 latent retention system, we constructed plasmids: (1) pEBS/eGFP with SMAR element cloned after eGFP gene as in pEPI-1. (2) pESdER/eGFP derived from pEBS/eGFP by deletion of EBNA-1 gene and (3) pCEP4/eGFP as reporter plasmid. Contrary to expectations, only plasmid (3) was able to establish stable Jurkat cell line cultures. Calculation of stress-induced duplex destabilization of the above plasmids demonstrated a high threshold for the destabilization of the OriP region, unlike the parental vector pCEP4, caused by the energy competition of OriP with the highly destabilized S/MAR region. Substitution of OriP in plasmid (2) with the β-globin initiation region (IR) (pESdER-IR/eGFP) results in the restoration of episomal status, providing high mitotic stability without selection pressure for up to 3 months of culture. We deduce that the replication potential of an episomal system carrying an S/MAR element depends on the existence of highly destabilized vector sequences, sufficient to counteract the S/MAR effect of stabilization on vector’s DNA backbone molecule and maintain the plasmid’s accessibility to the cellular replication machinery. Thus emerges the concept of including the calculation of stress-induced duplex destabilization in the design of self-replicative extrachromosomal units. The widespread use of retroviral-based vectors as gene transfer systems in the context of gene therapy clinical trials has emerged the need for accurately assessing their safety profile in order to identify the potential risks of insertional mutagenesis. Here we report a new PCR - based method, DSHP-PCR ( partially Double stranded, Sterically Hindered Primer – PCR), a clinically orientated method for analysing the integration sites with high sensitivity and reliability, devoid of the restriction digestion and cloning bias present in the existing methods. The difference between DSHP-PCR and previous PCR-based methods (such as LAM-PCR) consists in the step of second strand synthesis where the use of a partially double stranded –degenerated primer that binds at the end of the DNA single strands bypasses the need for the restriction digestion step that inserts a bias in integration site detection and for the cassette ligation step that renders the whole procedure inefficient. This method generates a highly informative integration site library used for the sequencing of the human genomic – retroviral junctions, by creating a PCR product pool that contains a high percentage of specific fragments of similar length that can be subcloned with the same efficiency in a sequencing vector. It can also be used for the creation of the clonal composition profile of patient’s each cell lineage in time allowing the monitoring of clonal kinetics of the haematopoietic or immune system by detecting the emergence of new clones that contribute to haematopoiesis.

Τα επισωματικά οχήματα γονιδιακής μεταφοράς αποτελούν ελκυστική εναλλακτική πειραματική προσέγγιση της γονιδιακής θεραπείας σε σχέση με τα ιϊκά οχήματα. Στην παρούσα εργασία και στο πλαίσιο της ανάπτυξης επισωματικών οχημάτων για την γονιδιακή θεραπεία των αιμοσφαιρινοπαθειών, μελετάται το όχημα hβ-SMAR(Α), ένα κυκλικό πλασμίδιο, που φέρει το γονίδιο της ανθρώπινης β-σφαιρίνης και το μLCR και βασίζεται σε ανθρώπινα χρωμοσωμικά στοιχεία, το S/MAR στοιχείο από την περιοχή 5’ του γονιδίου της ανθρώπινης ιντερφερόνης β. Διαπιστώθηκε ότι το hβ-SMAR(Α) συγκρατήθηκε εντός της διαμολυσμένης κυτταρικής σειράς MEL για περισσότερες από 300 γενιές με διαπιστωμένη την επισωματική του κατάσταση για τουλάχιστο 180 γενιές. Επιπλέον, διατήρησε υψηλά επίπεδα έκφρασης του διαγονιδίου, τα οποία θα αντιστοιχούσαν σε θεραπευτικά επίπεδα, αν αναπαράγονταν in vivo. / Episomal vehicles for gene transfer are an attractive alternative experimental approach to gene therapy in the place of viral vectors. The vehicle hβ-SMAR(Α) studied here, within the context of developing efficient episomal vectors for the gene therapy of hemoglobinopathies, is a circular plasmid bearing the human β globin gene and the μLCR and is based on human chromosomal elements, the S/MAR element from the region 5’ of the human interferon β gene. It was established that hβ-SMAR(Α) was retained within the transfected MEL cell line for more than 300 generations, with its episomal state ascertained for at least 180 generations. Furthermore, it retained high level expression of the transgene, which would be therapeutic, if reproduced in vivo.

Η ποσοτική ή ποιοτική ανεπάρκεια του λυσοσωματικού ενζύμου γλυκοκερεβροσιδάση οδηγεί στην παθολογία της νόσου Gaucher με κεντρικό το ρόλο της συσσώρευσης του υποστρώματός της, του γλυκοκερεβροσιδίου, στα μακροφάγα. Για περισσότερες από δύο δεκαετίες χρησιμοποιούνται γ-ρετροϊικά οχήματα στην ερευνητική προσέγγιση της διόρθωσης του ελλείμματος μέσω γονιδιακής μεταφοράς του γονιδίου της γλυκοκερεβροσιδάσης. Όπως έχει αναδειχθεί και σε κλινικό επίπεδο, είναι επιτακτική η ανάγκη για το σχεδιασμό γ ρετροϊικών οχημάτων, τα οποία θα είναι όχι μόνο αποτελεσματικά αλλά και ασφαλή, με κύριο στόχο τον περιορισμό της πιθανότητας εξαλλαγής του κυττάρου από τις συνέπειες της ενσωμάτωσης («μεταλλαξιγένεση κατά την ενσωμάτωση»). Η παρούσα μελέτη έχει ως στόχο τον έλεγχο της αποτελεσματικότητας νέων και θεωρητικά ασφαλέστερων σε σχέση με προηγουμένως χρησιμοποιηθέντα σε προκλινικό και κλινικό επίπεδο γ-ρετροϊικών οχημάτων για τη γονιδιακή μεταφορά του γονιδίου της γλυκοκερεβροσιδάσης σε προγονικά αιμοποιητικά κύτταρα του ανθρώπου. Στο πρώτο μέρος παρουσιάζεται η μελέτη έξι νέων και θεωρητικά ασφαλέστερων γ ρετροϊικών οχημάτων με το γονίδιο της γλυκοκερεβροσιδάσης, τα οποία είναι Self Inactivating (SIN) οχήματα και φέρουν αλληλουχίες για τη βελτίωση της ολοκλήρωσης της μεταγραφής, είτε από τον ιό WHV (WPRE, Woodchuck hepatitis virus Post-transcriptional Regulatory Element) είτε από τον ιό SV40 (2xSV40 USE, Simian Virus 40 Upstream Sequence Element σε δύο διαδοχικά αντίγραφα). Καταδεικνύεται ότι αυτά τα νέα SIN γ ρετροϊικά οχήματα είναι ικανά να μεταφέρουν ένα ενεργό φυσιολογικό γονίδιο γλυκοκερεβροσιδάσης σε CD34+ ανθρώπινο πρωτογενή προγονικό αιμοποιητικό κυτταρικό πληθυσμό. Τα οχήματα αυτά εμφάνισαν διαφορές στην αύξηση της ενζυμικής δραστικότητας, που προέκυψε από τη διαγονιδιακή έκφραση, οι οποίες οφείλονταν εν μέρει σε διαφορές στην αποδοτικότητα της διαμόλυνσης. Το δεύτερο μέρος της μελέτης περιλαμβάνει τέσσερα νέα SIN γ-ρετροϊικά οχήματα με το γονίδιο της γλυκοκερεβροσιδάσης με αντίστοιχο αριθμό οχημάτων-μαρτύρων, τα οποία είναι σχεδιασμένα με στόχο την κυτταροειδική έκφραση στα μονοκύτταρα / μακροφάγα, ώστε να περιοριστούν οι κυτταρικοί πληθυσμοί που εκτίθενται στην πιθανότητα ενεργοποίησης πρωτογκογονιδίων από τη δραστικότητα ενός εσωτερικού υποκινητή. Τα οχήματα φέρουν τους υποκινητές των ανθρώπινων γονιδίων CD11b και CD68 σε αλληλουχίες που είχαν επιδείξει στο παρελθόν μυελοειδοειδική έκφραση σε πειράματα γονιδιακής μεταφοράς. Τα νέα αυτά οχήματα ελέγχθηκαν ως προς την ικανότητά τους να παρουσιάζουν ισχυρότερη έκφραση του διαγονιδίου μετά από μονοκυτταρική / μακροφαγική διαφοροποίηση διαμολυσμένου CD34+ ανθρώπινου πρωτογενή προγονικού αιμοποιητικού κυτταρικού πληθυσμού σε σχέση με την έκφραση σε ένα λιγότερο διαφοροποιημένο διαμολυσμένο κυτταρικό πληθυσμό. Τα αποτελέσματα του δεύτερου μέρος της μελέτης σε συνδυασμό με τα ήδη υπάρχοντα βιβλιογραφικά δεδομένα ενθαρρύνουν την περαιτέρω διερεύνηση του υποκινητή του CD68 στο πλαίσιο των προσπαθειών για μυελοειδοειδική γονιδιακή μεταφορά του γονιδίου της γλυκοκερεβροσιδάσης, χωρίς να ενθαρρύνουν την περαιτέρω διερεύνηση του υποκινητή του CD11b. / Quantitative or qualitative deficiency of the lysosomal enzyme glucocerebrosidase results in the accumulation of its substrate, glucocerebroside, in macrophages, leading to the pathology of Gaucher disease. For more than two decades of research, gammaretroviral vectors have been used for gene transfer of the glucocerebrosidase gene for the correction of the enzyme’s deficit. It has been shown, even on clinical level, that the design of efficient as well as safe gammaretroviral vectors, aiming mainly at eliminating “insertional mutagenesis”, is an imperative need. The present study aims at the determination of the efficiency of new and theoretically safer, gammaretroviral vectors, compared to previously used ones on preclinical and clinical level, for the gene transfer of the glucocerebrosidase gene into human hematopoietic progenitor cells. In the first part of the study, six new and theoretically safer gammaretroviral vectors of the glucocerebrosidase gene have been evaluated. All six vectors are Self-Inactivating (SIN) and bear sequences for the improvement of transcriptional termination. These are either the WPRE (“Woodchuck hepatitis virus Post-transcriptional Regulatory Element”) from the virus WHV or the 2xSV40 USE (two copies of “Simian Virus 40 Upstream Sequence Element” in tandem repeat) from the virus SV40. It is shown that these new gammaretroviral vectors are efficient in transferring an active wild type glucocerebrosidase gene copy into a CD34+ human primary hematopoietic progenitor cell population. All six vectors showed increased enzyme activity, as compared to the untransduced cells, albeit with differences amongst them, partly due to differences in the transduction efficiency. The second part of the study focuses on the analysis of four new SIN gammaretroviral vectors of the glucocerebrosidase gene and the corresponding number of control vectors, designed for cell-specific expression in monocytes / macrophages. The aim is to thus limit the range of cell populations to be exposed to possible proto-oncogene activation from the internal promoter activity. In these vectors the expression of a glucocerebrosidase gene is driven by one of the promoters of the human genes for CD11b and CD68, which have exhibited myeloid specific expression in gene transfer experiments in the past. These new vectors were studied for their effectiveness in leading to stronger transgene expression after monocytic / macrophagic differentiation of a transduced CD34+ human primary hematopoietic progenitor cell population, compared to a less differentiated transduced cell population. The results of this study, taken together with the current bibliographical data, are encouraging for further study mainly of the CD68 promoter in the context of the research approach to myeloid specific gene transfer of the glucocerebrosidase gene.

Tο πρώτο μέρος της εργασίας αφορούσε την παρακολούθηση της ερυθρολευχαιμική σειρά ποντικού (MEL) διαμολυσμένη με το επισωματικό αυτό-αναπαραγώμενο όχημα pEPI-EGFP, τα κύτταρα της οποίας δεν παρουσίαζαν φθορισμό ενώ παρέμεναν ανθεκτικά στο αντιβιοτικό (G418). Αποδείχθηκε η επισωματική κατακράτηση του οχήματος για δύο μήνες μετά τη δημιουργία της διαμολυσμένης σειράς. Η διαπίστωση επίσης ότι το μεταφερόμενο γονίδιο μπορεί να μην εκφράζεται αλλά το όχημα να παραμένει για τουλάχιστον 60 ημέρες επισωματικό και χωρίς ενσωμάτωση μας ώθησε σε νέες προοπτικές αναζήτησης. Το δεύτερο μέρος της εργασίας έγινε παρασκευή δύο οχημάτων τα οποία διαφέρουν ως προς τον υποκινητή του γονιδίου αναφοράς ΕGFP τόσο μεταξύ τους όσο και από το όχημα pEPI-EGFP, το βασικό όχημα μελέτης έως τώρα. Η παρασκευή αυτή βασίστηκε στην αντικατάσταση του υποκινητή pCMV από: 1 τον υποκινητή pSFFV για την παρασκευή του οχήματος pEPI-pSFFV και 2 τον υποκινητή της β-σφαιρίνης (pβ-globin) για την παρασκευή του αντίστοιχου οχήματος pEPI-pβ-globin. Η παρασκευή των δύο αυτόν οχημάτων, του pEPI-pSFFV και pEPI-pβ-globin αποτελεί ένα σημαντικό βήμα στη ανάπτυξη νέων οχημάτων που αποτελέσουν οχήματα μεταφοράς γονιδίων σε αρχέγονα αιμοποιητικά κύτταρα. / The first part of this work concerned the observation of the mouse erithroid cell line (MEL) transected with the Replicating Episomal Vector pEPI-EGFP. The cells even thought that they had lost their florescence a few days after the transfection with the Vector pEPI-EGFP, they still endure to the antibiotic (G418). In the fist place we have shown that the Replicating Episomal Vector pEPI-EGFP remains in episomatic condition at list two months after the transfect ion of the cell line with out any insertion eventhought the transferred gene is not translated. The second part of this work concerned the construction of two new vectors. The new vectors have the same reference gene with the pEPI-EGFP vector the EGFP gene but they have tow totally deferent new promoters for the EGFP gene. This contract was based on the replacement of the promoter pCMV 1. with the promoter pSFFV for the contraction of the pEPI-pSFFV new vector 2. with the promoter pβ-globin for the contraction of the pEPI-pβ-globin new vector These two new vectors the pEPI-pSFFV and the pEPI-pβ-globin were tested for their ability of being used as Replicating Episomal Vectors to Hematopoietic Stem Cells, HSC sach as CD34+ cells.

Τα επισωματικά αυτο-αναπαραγώμενα συστήματα αποτελούν υποσχόμενα εναλλακτικά οχήματα γονιδιακής μεταφοράς για εφαρμογές της γονιδιακής θεραπείας. Η πρόσφατη κατανόηση της ικανότητας των αλληλουχιών S/MAR να διαμεσολαβούν την επισωματική διατήρηση γενετικών στοιχείων επέτρεψε την ανάπτυξη ενός πρότυπου κυκλικού επισωματικού φορέα που λειτουργεί χωρίς να κωδικοποιεί πρωτεΐνες ιϊκής προέλευσης. Σε αυτή τη μελέτη, διερευνήθηκε για πρώτη φορά η δυνατότητα αυτού του φορέα, pEPI-eGFP, να μεσολαβεί γονιδιακή μεταφορά σε κυτταρικές σειρές προγονικών αιμοποιητικών κυττάρων καθώς και σε πρωτογενή ανθρώπινα κύτταρα και, κυρίως, σε ανθρώπινα προγονικά αιμοποιητικά κύτταρα. Δείχνουμε ότι ο φορέας pEPI-eGFP διατηρείται επισωματικά και υποστηρίζει παρατεταμένη έκφραση του γονιδίου αναφοράς eGFP, ακόμα και χωρίς πίεση επιλογής, στην ανθρώπινη κυτταρική σειρά K562, καθώς και σε πρωτογενείς ανθρώπινους ινοβλάστες. Αντίθετα, στην κυτταρική σειρά ερυθρολευχαιμίας ποντικού MEL, η έκφραση της eGFP αποσιωπάται μέσω αποακετυλίωσης ιστονών, παρά την επισωματική διατήρηση του φορέα. Προγονικά αιμοποιητικά κύτταρα με κλωνογόνο ικανότητα, προερχόμενα από αίμα ομφάλιου λώρου, διαμολύνονται αποτελεσματικά με το φορέα μέσω ηλεκτροδιάτρησης. Ημιστερεές αποικίες προερχόμενες από διαμολυσμένα CD34+ κύτταρα διατηρούν το φορέα και εκφράζουν eGFP. Μετά από 4 εβδομάδες ο φορέας διατηρείται επισωματικά σε περίπου 1% των θυγατρικών κυττάρων. Τα αποτελέσματά μας αποδεικνύουν για πρώτη φορά ότι ένα πλασμίδιο βασιζόμενο σε μια αλληλουχία S/MAR μπορεί να λειτουργεί ως σταθερό επιίσωμα σε πρωτογενή ανθρώπινα κύτταρα και, ιδιαίτερα, σε προγονικά αιμοποιητικά κύτταρα, υποστηρίζοντας παρατεταμένη έκφραση του διαγονιδίου. Η μελέτη αυτή αναδεικνύει τη χρησιμότητα του συστήματος αυτού για τους σκοπούς της γονιδιακής θεραπείας. Παράλληλα, καταδεικνύει τους στόχους στους οποίους πρέπει να επικεντρωθεί η μελλοντική έρευνα προς την κατεύθυνση της βελτίωσής του. / Episomally maintained self-replicating systems present attractive alternative vehicles for gene therapy applications. Recent insights into the ability of chromosomal scaffold/matrix attachment regions (S/MARs) to mediate episomal maintenance of genetic elements cloned in cis allowed the development of a small circular episomal vector that functions independently of virally encoded proteins. In this study, we investigated the potential of this vector, pEPI-eGFP, to mediate gene transfer in hematopoietic progenitor cell lines as well as in primary human cells and, importantly, in human hematopoietic progenitor cells. pEPI-eGFP was episomally maintained and conferred sustained eGFP expression even in nonselective conditions in the human cell line, K562, as well as in primary human fibroblast-like cells. In contrast, in the murine erythroleukemia cell line, MEL, transgene expression was silenced through histone deacetylation, despite the vector’s episomal persistence. Hematopoietic semisolid cell colonies derived from transfected human cord blood retained the vector and expressed eGFP. After 4 weeks, the vector was maintained in approximately 1% of progeny cells. Our results provide the first evidence that a S/MAR-based plasmid can function as a stable episome in primary human cells, supporting long-term transgene expression. The present study constitutes a proof of principle for the utility of this system in gene therapy applications and points at targets for future improvements.

Οι αυτοαναπαραγόμενοι επισωματικοί φορείς γονιδιακής μεταφοράς αποτελούν πολλά υποσχόμενους φορείς γονιδιακής θεραπείας. Στην παρούσα εργασία δημιουργήθηκε ο φορέας Zif-VP64-EP2 στα πλαίσια των μελετών γονιδιακής θεραπείας για τις αιμοσφαιρινοπάθειες. Πρόκειται για ένα κυκλικό πλασμίδιο, που φέρει το γονίδιο ενός τεχνητού μεταγραφικού παράγοντα της γ-σφαιρίνης του Zif-VP64 υπό την επενέργεια του ισχυρού υποκινητή pSFFV καθώς και τo γονίδιο της eGFP με το S/MAR στοιχείο από την περιοχή 5’ του γονιδίου της ανθρώπινης ιντερφερόνης β υπό την επενέργεια του υποκινητή pCMV. Διαπιστώθηκε ότι το Zif-VP64-EP2 μεσολαβεί γονιδιακή μεταφορά σε διαμολυσμένα κύτταρα της ανθρώπινης κυτταρικής σειράς Κ562. Η μακράς διάρκειας διαμολυσμένη καλλιέργεια (3 μήνες) καταδεικνύει ότι το όχημα είναι λειτουργικό και διατηρείται ως επισωματικό σε Κ562 κύτταρα διαμολυσμένα κύτταρα με το Zif-VP64- ΕΡ2. / Self-replicating episomal vectors for gene transfer are a new and very promising experimental approach to gene therapy. In this study, it was created the vector Zif-VP64-EP2, within the context of developing self-replicating episomal vectors for the gene therapy of hemoglobinopathies. Zif-VP64-EP2 is a circular plasmid which includes the gene of an artificial transcription factor for gamma globin: Zif-VP64 under the control of pSFFV promoter and the gene of eGFP with the S/MAR element from the region 5’ of the human interferon β gene under the control of pCMV promoter. It was established that Zif-VP64-EP2 was retained within the transfected Κ562 hematopoietic progenitor cell. Its episomal situation for a long time (3 months) and its normal expression in K562 human cells constitutes a proof of the utility of Zif-VP64- ΕΡ2 system in gene therapy applications.