Tο πρώτο μέρος της εργασίας αφορούσε την παρακολούθηση της ερυθρολευχαιμική σειρά ποντικού (MEL) διαμολυσμένη με το επισωματικό αυτό-αναπαραγώμενο όχημα pEPI-EGFP, τα κύτταρα της οποίας δεν παρουσίαζαν φθορισμό ενώ παρέμεναν ανθεκτικά στο αντιβιοτικό (G418). Αποδείχθηκε η επισωματική κατακράτηση του οχήματος για δύο μήνες μετά τη δημιουργία της διαμολυσμένης σειράς. Η διαπίστωση επίσης ότι το μεταφερόμενο γονίδιο μπορεί να μην εκφράζεται αλλά το όχημα να παραμένει για τουλάχιστον 60 ημέρες επισωματικό και χωρίς ενσωμάτωση μας ώθησε σε νέες προοπτικές αναζήτησης. Το δεύτερο μέρος της εργασίας έγινε παρασκευή δύο οχημάτων τα οποία διαφέρουν ως προς τον υποκινητή του γονιδίου αναφοράς ΕGFP τόσο μεταξύ τους όσο και από το όχημα pEPI-EGFP, το βασικό όχημα μελέτης έως τώρα. Η παρασκευή αυτή βασίστηκε στην αντικατάσταση του υποκινητή pCMV από: 1 τον υποκινητή pSFFV για την παρασκευή του οχήματος pEPI-pSFFV και 2 τον υποκινητή της β-σφαιρίνης (pβ-globin) για την παρασκευή του αντίστοιχου οχήματος pEPI-pβ-globin. Η παρασκευή των δύο αυτόν οχημάτων, του pEPI-pSFFV και pEPI-pβ-globin αποτελεί ένα σημαντικό βήμα στη ανάπτυξη νέων οχημάτων που αποτελέσουν οχήματα μεταφοράς γονιδίων σε αρχέγονα αιμοποιητικά κύτταρα. / The first part of this work concerned the observation of the mouse erithroid cell line (MEL) transected with the Replicating Episomal Vector pEPI-EGFP. The cells even thought that they had lost their florescence a few days after the transfection with the Vector pEPI-EGFP, they still endure to the antibiotic (G418). In the fist place we have shown that the Replicating Episomal Vector pEPI-EGFP remains in episomatic condition at list two months after the transfect ion of the cell line with out any insertion eventhought the transferred gene is not translated. The second part of this work concerned the construction of two new vectors. The new vectors have the same reference gene with the pEPI-EGFP vector the EGFP gene but they have tow totally deferent new promoters for the EGFP gene. This contract was based on the replacement of the promoter pCMV 1. with the promoter pSFFV for the contraction of the pEPI-pSFFV new vector 2. with the promoter pβ-globin for the contraction of the pEPI-pβ-globin new vector These two new vectors the pEPI-pSFFV and the pEPI-pβ-globin were tested for their ability of being used as Replicating Episomal Vectors to Hematopoietic Stem Cells, HSC sach as CD34+ cells.

Τα επισωματικά αυτο-αναπαραγώμενα συστήματα αποτελούν υποσχόμενα εναλλακτικά οχήματα γονιδιακής μεταφοράς για εφαρμογές της γονιδιακής θεραπείας. Η πρόσφατη κατανόηση της ικανότητας των αλληλουχιών S/MAR να διαμεσολαβούν την επισωματική διατήρηση γενετικών στοιχείων επέτρεψε την ανάπτυξη ενός πρότυπου κυκλικού επισωματικού φορέα που λειτουργεί χωρίς να κωδικοποιεί πρωτεΐνες ιϊκής προέλευσης. Σε αυτή τη μελέτη, διερευνήθηκε για πρώτη φορά η δυνατότητα αυτού του φορέα, pEPI-eGFP, να μεσολαβεί γονιδιακή μεταφορά σε κυτταρικές σειρές προγονικών αιμοποιητικών κυττάρων καθώς και σε πρωτογενή ανθρώπινα κύτταρα και, κυρίως, σε ανθρώπινα προγονικά αιμοποιητικά κύτταρα. Δείχνουμε ότι ο φορέας pEPI-eGFP διατηρείται επισωματικά και υποστηρίζει παρατεταμένη έκφραση του γονιδίου αναφοράς eGFP, ακόμα και χωρίς πίεση επιλογής, στην ανθρώπινη κυτταρική σειρά K562, καθώς και σε πρωτογενείς ανθρώπινους ινοβλάστες. Αντίθετα, στην κυτταρική σειρά ερυθρολευχαιμίας ποντικού MEL, η έκφραση της eGFP αποσιωπάται μέσω αποακετυλίωσης ιστονών, παρά την επισωματική διατήρηση του φορέα. Προγονικά αιμοποιητικά κύτταρα με κλωνογόνο ικανότητα, προερχόμενα από αίμα ομφάλιου λώρου, διαμολύνονται αποτελεσματικά με το φορέα μέσω ηλεκτροδιάτρησης. Ημιστερεές αποικίες προερχόμενες από διαμολυσμένα CD34+ κύτταρα διατηρούν το φορέα και εκφράζουν eGFP. Μετά από 4 εβδομάδες ο φορέας διατηρείται επισωματικά σε περίπου 1% των θυγατρικών κυττάρων. Τα αποτελέσματά μας αποδεικνύουν για πρώτη φορά ότι ένα πλασμίδιο βασιζόμενο σε μια αλληλουχία S/MAR μπορεί να λειτουργεί ως σταθερό επιίσωμα σε πρωτογενή ανθρώπινα κύτταρα και, ιδιαίτερα, σε προγονικά αιμοποιητικά κύτταρα, υποστηρίζοντας παρατεταμένη έκφραση του διαγονιδίου. Η μελέτη αυτή αναδεικνύει τη χρησιμότητα του συστήματος αυτού για τους σκοπούς της γονιδιακής θεραπείας. Παράλληλα, καταδεικνύει τους στόχους στους οποίους πρέπει να επικεντρωθεί η μελλοντική έρευνα προς την κατεύθυνση της βελτίωσής του. / Episomally maintained self-replicating systems present attractive alternative vehicles for gene therapy applications. Recent insights into the ability of chromosomal scaffold/matrix attachment regions (S/MARs) to mediate episomal maintenance of genetic elements cloned in cis allowed the development of a small circular episomal vector that functions independently of virally encoded proteins. In this study, we investigated the potential of this vector, pEPI-eGFP, to mediate gene transfer in hematopoietic progenitor cell lines as well as in primary human cells and, importantly, in human hematopoietic progenitor cells. pEPI-eGFP was episomally maintained and conferred sustained eGFP expression even in nonselective conditions in the human cell line, K562, as well as in primary human fibroblast-like cells. In contrast, in the murine erythroleukemia cell line, MEL, transgene expression was silenced through histone deacetylation, despite the vector’s episomal persistence. Hematopoietic semisolid cell colonies derived from transfected human cord blood retained the vector and expressed eGFP. After 4 weeks, the vector was maintained in approximately 1% of progeny cells. Our results provide the first evidence that a S/MAR-based plasmid can function as a stable episome in primary human cells, supporting long-term transgene expression. The present study constitutes a proof of principle for the utility of this system in gene therapy applications and points at targets for future improvements.

Η HDL είναι ένα μείγμα λιποπρωτεϊνικών σωματιδίων υψηλής πυκνότητας, που ανάλογα με τη σύσταση τους σε λιπίδια μπορούν να είναι δισκοειδή ή σφαιρικά. Η κύρια αθηροπροστατευτική δράση της HDL, οφείλεται στο γεγονός ότι η συγκεκριμένη λιποπρωτεΐνη συλλέγει την περίσσεια χοληστερόλης από τους περιφερικούς ιστούς και τη μεταφέρει στο ήπαρ όπου καταβολίζεται. Επιπλέον, έχει αντιφλεγμονώδη και αντιοξειδωτική δράση. Η κύρια πρωτεΐνη της HDL είναι η απολιποπρωτεΐνη Α-Ι (apoA-I). Ωστόσο, πρόσφατα αποδείχθηκε ότι σε πειραματόζωα με έλλειψη στην apoA-I και κατά συνέπεια στην κλασσική HDL, η απολιποπρωτεΐνη Ε (apoE) αλληλεπιδρά με τον μεταφορέα λιπιδίων ABCA1 προάγοντας την de novo σύνθεση HDL σωματιδίων. Στην παρούσα μελέτη, στόχος ήταν η εύρεση της περιοχής της apoE που είναι υπεύθυνη για την λειτουργική αλληλεπίδραση με τον ABCA1 για το σχηματισμό HDL. Για το σκοπό αυτό, ανασυνδυασμένοι αδενοϊοί που εξέφραζαν καρβοξυ-τελικές συντετμημένες μορφές της apoE4 (AdGFP-E4[1-259], AdGFP-E4[1-229], AdGFP-E4[1-202], AdGFP-E4[1-185]), χορηγήθηκαν σε ποντίκια με έλλειψη στην ApoA-I σε δόση 8x108 pfu και πέντε μέρες μετά τη μόλυνση δείγματα πλάσματος αναλύθηκαν για το σχηματισμό HDL. Κλασματοποίηση των λιποπρωτεϊνών του πλάσματος με υπερφυγοκέντρηση σε διαβάθμιση πυκνότητας καθώς και FPLC χρωματογραφία αποκάλυψε ότι όλες οι συντετμημένες μορφές της apoE4 προάγουν το σχηματισμό HDL. Ανάλυση ηλεκτρονικής μικροσκοπίας με αρνητική χρώση των HDL κλασμάτων, επιβεβαίωσε ότι όλες οι συντετμημένες μορφές της apoE4 είναι ικανές να προάγουν το σχηματισμό σωματιδίων με διάμετρο στην περιοχή της HDL. Τα δεδομένα αυτά οδηγούν στο συμπέρασμα ότι η αμινοτελική περιοχή της apoE που εκτείνεται από τα αμινοξέα 1 έως 185 αρκεί για το σχηματισμό HDL σωματιδίων in vivo. Αυτά τα ευρήματα, ανοίγουν το δρόμο στην έρευνα για το σχεδιασμό βιολογικών φαρμάκων με βάση την apoE για τη θεραπεία της δυσλιπιδαιμίας, της αθηροσκλήρωσης και της στεφανιαίας νόσου. / HDL is a mixture of high density lipoprotein particles that depending on the lipid composition may be discoidal or spherical. The main atheroprotective property of HDL is reverse cholesterol transport, a process that unloads excess cholesterol from peripheral tissues and transports it to the liver for catabolism. HDL has also anti-inflammatory and antioxidant properties. The main protein of HDL is apolipoprotein A-I (apoA-I). However, recently it was shown that in the absence of apoA-I and consequently classical HDL, apolipoprotein E (apoE) interacts functionally with the lipid transporter ABCA1, promoting the de novo synthesis of HDL-like particles. The present study focused on the identification of the domain of apoE that is responsible for the functional interaction with ABCA1 and the formation of apoE-containing HDL. Recombinant attenuated adenoviruses expressing carboxy-terminal truncated forms of apoE4 (apoE4[1-259], apoE4[1-229], apoE4[1-202], and apoE4[1-185]) were administered to apoA-I-deficient mice at a low dose of 8x108 pfu and five days post-infection plasma samples were isolated and analyzed for HDL formation. Fractionation of plasma lipoproteins of the infected mice by density gradient ultracentrifugation and FPLC revealed that all forms were capable of promoting HDL formation. Negative staining electron microscopy analysis of the HDL density fractions confirmed that all C-terminal truncated forms of apoE4 promoted the formation of particles with diameters in the HDL region. Taken together, these data establish that the aminoterminal 1 to 185 region of apoE suffices for the formation of HDL particles in vivo. These findings may have important ramifications in the design of apoE-based biological drugs for the treatment of dyslipidemia, atherosclerosis and coronary heart disease.