A anemia falciforme (AF) é uma doença monogênica de elevada mortalidade e morbidade, que afeta milhões de pessoas em todo o mundo. Não há tratamento definitivo que seja amplo, eficaz e seguro para a AF, de forma que os tratamentos paliativos são os mais utilizados. O tratamento definitivo disponível é transplante alogênico de células-tronco hematopoiéticas, porém com várias complicações envolvidas. O estabelecimento de um modelo in vitro permite uma melhor compreensão de como a doença ocorre, além de permitir o desenvolvimento de novos testes e tratamentos mais eficazes contra a doença. Neste contexto, a tecnologia das células-tronco pluripotentes induzidas (iPSC), que surgiu em 2006, é uma ferramenta poderosa na pesquisa básica, na pesquisa da diferenciação de tecidos e no modelamento de doenças, e uma promessa para futuras aplicações clínicas, na descoberta e triagem de novas drogas mais eficazes e seguras, além da possibilidade de utilização na medicina regenerativa, na produção de células paciente-específicas para terapia celular. Este trabalho teve como objetivo obter um modelo de estudo e tratamento da AF utilizando iPSC. Para isso, vetores epissomais foram utilizados para a reprogramação de células mononucleares de sangue periférico para obter iPSC livres de integração. Estas células foram coletadas de pacientes tratados com o medicamento hidroxiureia e sem tratamento, para avaliação do impacto da droga na reprogramação. As linhagens de iPSC PBscd geradas foram caracterizadas quanto ao potencial pluripotente e de diferenciação. Todas as linhagens geradas se mostraram pluripotentes com potencial de auto renovação e potencial de formar células e tecidos dos 3 folhetos germinativos. O rastreamento dos vetores utilizados na reprogramação mostrou que as células estão livres após cerca de 10 passagens em média, e que eles não se integram espontaneamente nas células. As linhagens de iPSC foram diferenciadas em progenitores hematopoiéticos através da agregação forçada associada à indução com citocinas específicas e um cultivo em suspensão. Dessa forma, nós obtivemos um protocolo dinâmico e eficiente de produção de células CD34+CD45+ com poucos dias de indução. Foram realizados experimentos iniciais de padronização da metodologia de CRISPR, para que essa metodologia possa ser utilizada no futuro para a correção da mutação da AF no gene da ?- globin. Além disso, a reação padronizada para o rastreamento da mutação no gene da ?-globin poderá ser usado em experimentos futuros de edição gênica para avaliar a correção da mutação. Em resumo, oferecemos uma ferramenta valiosa para uma melhor compreensão de como a AF ocorre, além de tornar possível o desenvolvimento de drogas e tratamentos mais eficazes e de fornecer um melhor entendimento dos tratamentos amplamente utilizados, como a hidroxiurea / Sickle cell anemia (SCA) is a monogenic disease of high mortality and morbidity, that affects millions of people worldwide. There is no definitive treatment that is broad, effective and safe for SCA, so the palliative treatments are the most used. The definitive treatment available is the allogeneic transplantation of hematopoietic stem cells, but with several complications involved. The establishment of an in vitro model allows better understanding of how the disease occurs, besides allowing the development of more effective new tests and treatments against the disease. In this context, the induced pluripotent stem cell (iPSC) technology, that emerged in 2006, is a powerful tool for basic research, tissue differentiation research and disease modeling, and a promise for future clinical applications, to find and screen new, more effective and safe drugs, besides the possibility of use in regenerative medicine, in the production of patient-specific cells for cell therapy. This work aimed to obtain a model for study and treatment of SCA using iPSC. For this, episomal vectors were used for reprogramming peripheral blood mononuclear cells to obtain integration-free iPSC. This cells were collected from patients treated with hydroxyurea and without treatment, for evaluation of the impact of the drug in reprogramming. The generated iPSC PBscd lines were characterized for pluripotent and differentiation potential. All the generated lines were shown to be pluripotent with potential for self-renewal and to form cells and tissues of the 3 germ layers. Screening of the vectors used for reprogramming showed that they are absent after about 10 passages, and that they do not integrate spontaneously into the cells. The iPSC lines were differentiated into hematopoietic progenitors through forced aggregation associated with induction with specific cytokines and culture in cell suspension. Thus, we obtained a dynamic and efficient protocol of CD34+CD45+ cells production with a few days of induction. Initial standardization experiments of CRISPR methodology was performed, so that this methodology can be used in the future to correct the ?-globin chain mutation of SCA. Also, the standardized reaction for the screening of ?-globin chain mutation can be used in future gene-editing experiments to evaluate the mutation correction. In summary, we offer a valuable tool for a better understanding of how SCA occurs, in addition to make possible the development of more effective drugs and treatments and providing better understanding of widely used treatments, such hydroxyrea

Η γονιδιακή θεραπεία θεωρείται μια πολλά υποσχόμενη προσέγγιση για την αντιμετώπιση διαφόρων ασθενειών, καθώς για αρκετές από αυτές δεν υπάρχει ουσιαστική θεραπεία παρά μόνο αντιμετώπιση των συμπτωμάτων. Οι αιμοσφαιρινοπάθειες ως μονογονιδιακές ασθένειες έχουν θεωρηθεί εδώ και πολλά χρόνια εξαιρετικά μοντέλα ασθενειών για τη γονιδιακή θεραπεία. Επιπλέον, ο μοριακός μηχανισμός της νόσου είναι από τους καλύτερα μελετημένους. Οι στρατηγικές που χρησιμοποιούνται στις προσπάθειες γονιδιακής θεραπείας των αιμοσφαιρινοπαθειών περιλαμβάνουν: Μεταφορά του φυσιολογικού γονιδίου β, κυρίως σε αρχέγονα αιμοποιητικά κύτταρα, και Προσπάθεια ενεργοποίησης των γ γονιδίων, καθώς ασθενείς με β- θαλασσαιμία και κληρονομική παραμονή της εμβρυϊκής αιμοσφαιρίνης παρουσιάζουν σχεδόν φυσιολογικό φαινότυπο. Όσον αφορά τη γονιδιακή μεταφορά, αυτή γίνεται κατά κύριο λόγο με ιϊκά συστήματα. Ωστόσο, οι φορείς αυτοί παρουσιάζουν ορισμένα μειονεκτήματα με κυριότερα την πρόκληση ανοσολογικών αντιδράσεων και την in vitro μεταλλαξιγένεση λόγω ενσωμάτωσης. Για το λόγο αυτό, τα τελευταία χρόνια οι έρευνες έχουν στραφεί στην κατασκευή επισωματικών φορέων που θεωρούνται γενικά πιο ασφαλείς καθώς δεν ενσωματώνονται στο γενετικό υλικό των κυττάρων. Σημαντικό βήμα στην ανάπτυξη επισωματικών φορέων για την γονιδιακή θερπαπεία των αιμοσφαιρινοπαθειών, επιτεύχθηκε με την κατασκευή του φορέα pEPI-eGFP ο οποίος έχει την ικανότητα να διατηρείται σε επισωματική κατάσταση χάρη στην αλληλουχία S/MAR που περιέχει και η οποία προέρχεται από το 5΄ άκρο του ανθρώπινου γονιδίου της ιντερφερόνης β. Επιπλέον, έρευνες στο παρελθόν έχουν δείξει ότι το mini LCR της β-σφαιρίνης είναι απαραίτητο για την υψηλή και ιστο-ειδική έκφραση του γενετικού τόπου της β-σφαιρίνης. Σκοπός της παρούσας εργασίας είναι η κατασκευή ενός επισωματικού φορέα που θα βασίζεται στον φορέα pEPI-eGFP και ο οποίος αποτελεί ενδιάμεσο στάδιο για την κατασκευή ενός κοσμιδιακού φορέα που θα περιλαμβάνει το mini locus της β-σφαιρίνης. / Gene therapy is considered many promising approach for the confrontation of enough various illnesses, while for from them does not exist essential treatment only that confrontation of symptoms. Haemoglobinopathies as monogenic disorders have been considered for many years exceptional models for gene therapy. Moreover, the molecular mechanism of haemoglobinopathies is very well studied. The strategies that are used in the efforts of gene therapy haemoglobinopathies include: Transport of physiologic gene b, mainly in original stem cells, and Effort of activation of γ-globin genes, since patients with b thalassaemia and hereditary presence of embrionic haemoglobin show almost physiologic phrenotype. With regard to the pertaining to genes transport, this becomes in the first place with virus systems. However, this vectors present certain disadvantages with mainly the challenge of immunological reactions and in vitro metallaxigenesi because incorporation. For this reason, in the past few year the researches have been turned in the manufacture of episomal vectors that is considered in general sure while is not incorporated in the genetic material of cells. Important step in the growth of episomal vectors for gene therapy of haemoglobinopathies, was achieved with the manufacture of pEPI-eGFP which has the faculty to be maintained in episomal situation thanks to the concatenation S/MAR that it contains and which is emanated from the 5΄ of the human gene of interferon β. Moreover, researches in the past have shown that mini LCR of b-globin is essential for high and specific expression of genetic place of b-globin. Aim of present work is the manufacture of episomal vector that will be based on the institution pEPI-eGFP and which constitutes intermediary stage for the manufacture of cosmidial vector that will include the mini locus b-globin.

Η αύξηση της έκφρασης του γονιδίου της γ-σφαιρίνης και κατ’ επέκταση και της εμβρυικής αιμοσφαιρίνης (HbF), μέσω ενεργοποίησης με φαρμακολογικούς παράγοντες ή μεταφοράς του γονιδίου της γ-σφαιρίνης, αποτελούν σημαντικές στρατηγικές για την θεραπεία της δρεπανοκυτταρικής και μεσογειακής αναιμίας. Καινοτομία αποτελεί η δημιουργία ενός ειδικού συνθετικού ενεργοποιητή της γ-σφαιρίνης, του Zif-VP64, με δομή δακτύλων ψευδαργύρου, ειδικά σχεδιασμένη για πρόσδεση σε αλληλουχία 18bp, περί την θέση -117HPFH του υποκινητή της γ-σφαιρίνης. Επιδίωξη της εργασίας αυτής ήταν η ανάπτυξη ενός μη ιϊκού, επισωματικού φορέα, που φέρει τον συνθετικό ενεργοποιητή του γονιδίου της γ-σφαιρίνης, ικανού να λειτουργεί με επάρκεια σε κύτταρα του αιμοποιητικού ιστού. Η φορέας αυτός, Zif-VP64-Ep1, περιλαμβάνει τον ενεργοποιητή της γ-σφαιρίνης και την μεταγραφική κασέτα CMV-eGFP-S/MAR, για την εξασφάλιση της επισωματικής του κατάστασης μέσω του στοιχείου S/MAR. Τα αποτελέσματά μας δείχνουν ότι ο φορέας Zif-VP64-Ep1: i. διαμολύνει επιτυχώς, K562 κύτταρα σε ποσοστό 45% παραμένοντας σε επισωματική κατάσταση και υποστηρίζοντας έκφραση του διαγονιδίου για τουλάχιστον 200 γενεές, προγονικά κύτταρα μυελού τον οστών ποντικού β-YAC BMCs σε ποσοστό 23% και CD34+ κύτταρα περιφερικού αίματος κινητοποιημένου υγιούς δότη σε ποσοστό 22,5%. ii. ο φορέας Zif-VP64-Ep1 υποστηρίζει σημαντική αύξηση των επιπέδων της γ-σφαιρίνης κατά 3.3±0.2 φορές σε Κ562 και 3.0±1 φορές σε CD34+ κύτταρα, και ενεργοποίηση του ανενεργού γονιδίου γ-σφαιρίνης σε κύτταρα β-YAC BMCs. Επιτυγχάνεται έτσι, για πρώτη φορά, επισωματική γονιδιακή μεταφορά του ενεργοποιητή Zif-VP64 και trans-ενεργοποίηση του γ-γονιδίου σε επίπεδο θεραπευτικής σημασίας. / The increase of HbF through activation of gamma-globin gene is a valid strategy for the treatment of hemoglobinopathies. Zif-VP64 is a selective, synthetic gamma-globin activator, containing a zinc-finger DNA protein that binds the gamma-globin promoter -117HPFH area and a transcription inducer that induces gamma globin gene in K562 cells, after viral transfer. We report the study of an episomal vector of this activator, which is based on a Scaffold/Matrix attachment region (S/MAR) that supports retention of episomes in the nucleus of the host cell. We constructed an episomal vector, Zif-VP64-Ep1, containing the activator Zif-VP64, the reporter gene cassette CMV-eGFP and the S/MAR element. Gene transfer into cells was done by electroporation or nucleofection. Expression of eGFP was documented by Florescent Microscopy and Flow Cytometry, while the fate of vector molecules in the cells was studied by Southern Blot and plasmid rescue experiments. Real time PCR, Western blotting and Intracellular Flow Cytometry were used to investigate gamma-globin mRNA, gamma-globin protein and HbF protein levels respectively. Binding specificity of the activator was determined by Chromatin Immunoprecipitation (ChIP). Gene transfer was done in K562 cells producing long term stable cell lines; murine beta-YAC cells, where the YAC contains the complete human, beta-globin gene locus; and human progenitor hemopoietic CD34+ cells from healthy, mobilized individuals, with transfection efficiencies of 65%, 25% and 23% respectively. In K562 cells, gamma-globin mRNA levels showed an increase of 250%, gamma-globin protein of 350% and HbF protein of 165%, as compared to the corresponding levels in the untransfected K562 cells, at least 200 generations post-transfection. Interestingly, vector Zif-VP64-Ep1 was able to mediate the activation of expression of the silent, human gamma-globin gene of the murine beta-YAC cells, at a level matching the (active) human beta-globin gene of the YAC, as well as the murine beta-globin gene, showing that it can efficiently activate the gamma-globin gene from within a heterochromatic region. Finally and most significantly, vector Zif-VP64-Ep1 was able to transfect the human, hemopoietic progenitor CD34+ cells and to mediate a 3.0±1 fold increase of gamma globin mRNA, compared to untrasnfected CD34+ cells, as estimated in cultures of 7-8 days after transfection. In conclusion, activation of human gamma-globin by episomal gene transfer of a synthetic activator, in three different hemopoietic cells, is documented, including the CD43+ cells, that are the target cells for gene therapy of the Hemoglobinopathies. This is the first time that an S/MAR based episomal vector is used for gene transactivation in a cell line and progenitor cells, aiming at specific gene therapy.

Στη γονιδιακή θεραπεία, οι κλινικές μελέτες μέχρι τώρα χρησιμοποιούν ιϊκούς φορείς για την μεταφορά του διαγονιδίου στα κύτταρα στόχους. Το DNA των ιϊκών φορέων ενσωματώνεται στο γενετικό υλικό των κυττάρων, και αυτό εμπεριέχει τον μεγάλο κίνδυνο της παρεμβολής στο ενδογενές πρόγραμμα γονιδιακής έκφρασης (μεταλλαξιγένεση λόγω ένθεσης). Μια λύση σε αυτή την ανεπιθύμητη κατάσταση είναι η χρήση επισωματικών φορέων και ιδιαίτερα όσων φέρουν χρωμοσωμικά στοιχεία. Παλαιότερα είχε αναφερθεί ότι ο πρότυπος επισωματικός φορέας pEPI που βασίζεται στο Scaffold /Matrix Attachment Region (S/MAR), παραμένει ως σταθερό επίσωμα για πολλές γενεές σε κυτταρικές σειρές ανθρώπου και ποντικού, αλλά δεν παραμένει για πολλές γενεές σε ανθρώπινα CD34+ κύτταρα. Για να ενισχυθεί η ικανότητα του φορέα να υποστηρίξει την γονιδιακή μεταφορά και συγκράτηση του σε πρωτογενή αρχέγονα/προγονικά αιμοποιητικά κύτταρα, πρώτον ενισχύθηκε η μεταγραφή του S/MAR χρησιμοποιώντας τους ισχυρούς υποκινητές EF1/HTLV ή SFFV για το διαγονιδίο της eGFP και δεύτερον προστέθηκε μια αλληλουχία έναρξης της αντιγραφής (IR) από το γενετικό τόπο των β σφαιρινικών γονιδίων. Στην εργασία αυτή έγινε μεταφορά των νέων αυτών φορέων με την μέθοδο της πυρινικής ηλεκτροδιάτρησης σε κύτταρα CD34+ που απομονώθηκαν από κινητοποιημένο περιφερικό αίμα δοτών μυελού των οστών τα οποία διαμόλυναν επιτυχώς. Στην συνέχεια τα διαμολυσμένα κύτταρα CD34+ επιλέχθηκαν με FACS και καλλιεργήθηκαν σε θρεπτικό υλικό μεθυλοκυτταρίνης. Μετά την πάροδο 14 ημερών, ανιχνεύτηκε, με μικροσκοπία φθορισμού, έκφραση της eGFP στις τελικά διαφοροποιημένες αιμοποιητικές αποικίες που προέκυψαν. / Gene therapy clinical trials are currently based on integrating viral vectors; this approach presents the major risk of insertional mutagenesis. A solution to this side effect could be the use of episomal vectors and particularly the ones carrying chromosomal elements.We previously reported that the prototype episomal vector pEPI, based on a Scaffold /Matrix Attachment Region (S/MAR), functions as a stable episome for many generations in human and murine hematopoietic cell lines, but mediates very low long term retention in human CD34+ cells. To enhance the vector’s potential for gene transfer into primary hematopoietic stem/progenitor cells, (a) was enforced transcription through the S/MAR by using the strong hybrid EF1/HTLV or SFFV promoters to drive expression of the upstream transgene (eGFP) and (b) was included the replication initiation region (IR) from the β-globin gene locus. In this thesis the new vectors where delivered by nucleofection in CD34+ cells isolated from mobilized peripheral blood of healthy donors; th cells were efficiently transfected. Moreover the the transfected CD34+ cells were separated with FACS and cultured in methylocyttarine containing medium. After 14 days, eGFP expression was readily detected by fluorescence microscopy in the differentiated hematopoietic colonies.

Background and objectives: In 2006 Shinya Yamanaka successfully reprogrammed mouse fibroblasts back to an embryonic stem cell-like state (called induced pluripotent cells, iPS cells) using retrovirus to introduce four genes that encode critical transcription factor proteins (Oct4, Sox2, KLF4, and c-Myc). This ability to reprogram has promising future applications in clinical and biomedical research for study of diseases, development of candidate drugs and to support therapeutic treatments in regenerative medicine. However, the clinical applications have to meet GMP requirements without the risk of insertional mutagenesis associated with retrovirus. Chromatin modifying agents are widely used in many protocols to generate iPS cells and culture of blood CD34+ cells with chromatin-modifying agents can lead to an increase in marrow repopulating cells and in the case of valproic acid increased erythroid cell colony formation. We undertook research to help understand what effects these reagents have on mobilised peripheral blood (mPB) CD34+ cells and optimised the expansion medium protocol to facilitate reprogramming work. This project aims to utilize peripheral blood mononuclear cells (MNC), one of the most easily accessible tissues to generate iPS cells using an efficient non-viral, feeder cell free methodology, with the ultimate goal of moving this methodology towards clinical use. Materials and Methods: G-CSF mobilised peripheral blood, buffy coat, cord blood and fetal liver were obtained from patients and donors under informed consent and ethics committee approval. Haematopoietic stem/progenitor cells CD34+ or CD133+) isolated by magnetic separation were flow cytometry sorted into CD34+/CD133+, CD34+/CD133-, and CD34-/CD133+ sub-populations and their lineage potential were assessed in colony forming unit assays. The effect of epigenetic modifiers valproic acid and 5-aza-2-deoxycytidine used singly or in combination with each other and with IL3 on phenotype and lineage potential of cultured CD34+ cells from mobilised peripheral blood were assessed by flow cytometry and colony-forming unit assays. Prior to reprogramming mononuclear cells from peripheral blood or CD34+ cells from blood were expanded in culture medium supplemented with stem cell factor (SCF), Fms-related tyrosine kinase 3 ligand (Flt3L) and Interleukin- 3 (IL-3) for several days. Actively proliferating cells were reprogrammed by electroporation using episomal vectors with an oriP/EBNA-1 backbone to deliver five reprogramming genes, Oct4, Sox2, Lin28, L-Myc, and Klf4. Electroporated cells were seeded onto matrigel coated plates immediately after transfection or were reseeded after three days’ culture. Subsequently, cells were cultured in specific medium on different days. When iPS colonies appeared, they were picked and cultured as for ES cells. Once established, iPS cell lines were immunophenotyped using flow cytometry and immunofluorescence and their potential to differentiate into the three germ layers was assessed in vitro. Results and Conclusion: The largest subpopulation of CD34+ cells was CD34+/CD133+ population which was essentially committed to myeloid colony production, while much smaller CD34+/CD133- subpopulation had a greater capacity to generate erythroid colonies. Optimised cytokine cocktail for expansion of CD34+ cells included IL-3, important in improving expansion and maintaining functionality of CD34+ cells. The optimised cytokine cocktail comprised 100 ng/ml SCF, 10 ng/ml Flt3L, and 20 ng/ml IL-3, which maintained CD34+ cells and MNC in an active proliferating state. In addition, valproic acid and IL3 were found to act synergistically, to increase the numbers of CD34+/CD36+ positive cells. However, we found that an apparent increase in red cell colony formation actually resulted from a decrease in white cell colonies, so no overall increase in red cell colonies was seen when equivalent numbers of CD34+ cells were plated. Proliferating MNC maintained in optimised cytokine cocktail were amenable to electroporation for the effective delivery of episomal transcription factors (Oct4, Sox2, Klf4, L-Myc, and Lin28) within a backbone of oriP/EBNA-1. We successfully developed an efficient and simple method for reprogramming MNC from fresh or frozen samples to generate induced pluripotent cells using episomal vectors in a feeder-free system without any requirement for small molecules and the highest reprogramming efficiency is 0.033% (65 colonies from 2 ◊ 105 seeding MNC). The cytokine cocktail and reprogramming methods work better in CD34+ cells from cord blood or fetal liver, and we obtained 148 iPS colonies from 105 seeding cells (0.148%) at most. In addition, fibroblasts from adult and fetal liver can be successfully reprogrammed using the same reprogramming method. The use of episomal vectors with an oriP/EBNA-1 backbone to deliver reprogramming genes, and efficient electroporation were the most important factors in efficiency of the reprogramming process. In addition, it is pivotal to initiate transfection when cells are actively proliferating. The iPS cell lines we generated maintained the successful expression of ES markers including Oct4, Nanog, SSEA3. SSEA4, TRA-1-60 and TRA-1-81, and had the capacity to successfully differentiate into cell types of ectoderm, mesoderm and endoderm layers in vitro.

Οι επισωματικοί φορείς αποτελούν την εναλλακτική επιλογή για την μεταφορά γονιδίων σε εφαρμογές γονιδιακής θεραπείας. Διπλασιάζονται αυτόνομα χωρίς να ενσωματώνονται στα χρωμοσώματα του κυττάρου και έτσι στερούνται της σοβαρής παρενέργειας του φαινομένου της μεταλλαξιγένεσης μέσω ενσωμάτωσης. Το ενδιαφέρον ως προς την ανάπτυξη επισωματικών φορέων για την γονιδιακή μεταφορά αυξήθηκε κατακόρυφα τα τελευταία χρόνια μετά την ανάπτυξη του φορέα pEPI-1, ο οποίος περιείχε το στοιχείο S/MAR του γονιδίου της ανθρώπινης βήτα- ιντερφερόνης. Ο φορέας αυτός είχε την ιδιότητα να διατηρείται επισωματικά χωρίς την ανάγκη μεταγραφής κάποιου ιϊκού γονιδίου. Τα στοιχεία S/MAR αποτελούν ετερογενείς περιοχές DNA οι οποίες συνδέονται στην θεμέλια ουσία του πυρήνα, συμμετέχοντας στην οργάνωση του ευκαρυωτικού γονιδιώματος, στην αντιγραφή του DNA και στην ρύθμιση της μεταγραφής. Αποφασίσαμε στην μελετήσουμε την δράση του S/MAR στοιχείου σε ένα διαφορετικό περιβάλλον DNA. Ξεκινώντας από τον φορέα pCEP4 που βασίζεται στα στοιχεία OriP και EBNA-1 του ιού η EBV κατασκευάσαμε τα εξής πλασμίδια: 1) pEBS/eGFP με το S/MAR να είναι κλωνοποιημένο μετά το γονίδιο της eGFP όπως στο pEPI-1. 2) pESdER / eGFP προερχόμενο από το pEBS/eGFP με διαγραφή του γονιδίου EBNA-1 και.3) pCEP4 / eGFP (πλασμίδιο μάρτυρας). Σε αντίθεση με τις προσδοκίες μας μόνο το πλασμιδίου pCEP4 / eGFP ήταν ικανό να εγκαταστήσει σταθερές κυτταρικές σειρές Jurkat. Ο υπολογισμός της αποσταθεροποίησης υπό τάση των παραπάνω πλασμιδίων απέδειξε μια υψηλή ουδό για την αποσταθεροποίηση της περιοχής του OriP, σε αντίθεση με το μητρικό φορέα pCEP4, γεγονός που οφείλεται στον ενεργειακό ανταγωνισμό μεταξύ του OriP και της υψηλά αποσταθεροποιημένης περιοχής του S/MAR. Η αντικατάσταση του OriP στο πλασμίδιο pESdER / eGFP από την περιοχή έναρξης της αντιγραφής το γονίδιο της β-σφαιρίνης (IR) (pESdER-IR/eGFP) έχει ως αποτέλεσμα την αποκατάσταση της επισωματική της κατάστασης, προσδίδοντας επιπλέον και υψηλή μιτωτική σταθερότητα χωρίς την ανάγκη ύπαρξης πίεσης επιλογής σε καλλιέργειες για χρονικό διάστημα τριών μηνών. Συμπεράνουμε ότι το δυναμικό πολλαπλασιασμού ενός επισωματικού συστήματος που περιέχει ένα στοιχείο S/MAR εξαρτάται από την ύπαρξη μιας δεύτερης υψηλά αποσταθεροποιημένης έννοιες περιοχής ικανής να ξεπεράσει την σταθεροποιητική δράση της αλληλουχίας S/MAR. Το γεγονός αυτό προσδίδει μια νέα διάσταση στη σχεδίαση αυτόνομων επισωματικών φορέων, που περιέχει τον υπολογισμό της αποσταθεροποίησης της διπλής έλικας DNA υπό τάση. Η ευρεία χρήση των ρετρο-ιϊκών φορέων ως συστήματα γονιδιακής μεταφοράς σε κλινικές δοκιμές γονιδιακής θεραπείας έφερε στην επιφάνεια την ανάγκη για μια ακριβή εκτίμηση της ασφάλειας των δοκιμών αυτών όσον αφορά το φαινόμενο της μεταλλαξιγένεσης μέσω ενσωμάτωσης. Στην εργασία αυτή αναφέρεται μια νέα μέθοδος για την ανίχνευση των θέσεων ενσωμάτωσης των ρετρο-ιϊκών φορέων που έχει κλινικό προσανατολισμό και ονομάζεται DSCP-PCR( partially Double stranded, Sterically Hindered Primer – PCR). Η μέθοδος αυτή έχει αυξημένη ευαισθησία και ειδικότητα, δεδομένου ότι δεν εξαρτάται από στάδια κατάτμησης με ένζυμα περιορισμού και αντιδράσεις λιγάσης που αποτελούν μέρος των υπαρχόντων μεθόδων (όπως η LAMPCR). Η μείζονα διαφορά ανάμεσα στην DSCP-PCR και στις προηγούμενες PCR μεθόδους συνιστάται στο στάδιο της σύνδεσης της συμπληρωματικής αλυσίδας του DNA όπου χρησιμοποιείται ένας εκκινητής που το ένα άκρο του είναι εκφυλισμένο ενώ το άλλο αποτελείται από διπλή έλικα DNA. Η σχεδίαση αυτή τον καθιστά ικανό να προσδένεται μόνο στο άκρο οποιασδήποτε μονής αλυσίδας. Η μέθοδος αυτή παράγει ένα υψηλά πληροφοριακό σύνολο δεδομένων για τον χαρακτηρισμό των θέσεων ενσωμάτωσης των φορέων. Επίσης μπορεί να χρησιμοποιηθεί για τη σύνθεση του προφίλ των κλώνων που συμμετέχουν στην αιμοποίηση σε κάποια χρονική περίοδο. Η παρακολούθηση το προφίλ αυτού μέσα στον χρόνο δίνει ενδείξεις για την κινητική της αιμοποίησης και κατά συνέπεια της εμφάνιση νέων κλώνων. / Episomal vectors have been considered valid alternatives to viral vectors for gene therapy applications, as they are replicating extrachromosomally and are devoid of the adverse effect of insertional mutagenesis. Interest in the episomal systems was boosted by the development of the pEPI-1 vector, containing the scaffold matrix attachment region (S/MAR) element of the human beta-interferon gene, which confers to it stable episomal status, without the need for transcription of any viral element. S/MARs are heterogeneous DNA regions that attach to the nuclear matrix, participating in the organization of the eukaryotic genome, initiation of DNA replication and regulation of transcription. We decided to study the performance of the S/MAR element in a completely different vector DNA context. Starting from vector pCEP4 (Invitrogen) based on OriP EBV and EBNA-1 latent retention system, we constructed plasmids: (1) pEBS/eGFP with SMAR element cloned after eGFP gene as in pEPI-1. (2) pESdER/eGFP derived from pEBS/eGFP by deletion of EBNA-1 gene and (3) pCEP4/eGFP as reporter plasmid. Contrary to expectations, only plasmid (3) was able to establish stable Jurkat cell line cultures. Calculation of stress-induced duplex destabilization of the above plasmids demonstrated a high threshold for the destabilization of the OriP region, unlike the parental vector pCEP4, caused by the energy competition of OriP with the highly destabilized S/MAR region. Substitution of OriP in plasmid (2) with the β-globin initiation region (IR) (pESdER-IR/eGFP) results in the restoration of episomal status, providing high mitotic stability without selection pressure for up to 3 months of culture. We deduce that the replication potential of an episomal system carrying an S/MAR element depends on the existence of highly destabilized vector sequences, sufficient to counteract the S/MAR effect of stabilization on vector’s DNA backbone molecule and maintain the plasmid’s accessibility to the cellular replication machinery. Thus emerges the concept of including the calculation of stress-induced duplex destabilization in the design of self-replicative extrachromosomal units. The widespread use of retroviral-based vectors as gene transfer systems in the context of gene therapy clinical trials has emerged the need for accurately assessing their safety profile in order to identify the potential risks of insertional mutagenesis. Here we report a new PCR - based method, DSHP-PCR ( partially Double stranded, Sterically Hindered Primer – PCR), a clinically orientated method for analysing the integration sites with high sensitivity and reliability, devoid of the restriction digestion and cloning bias present in the existing methods. The difference between DSHP-PCR and previous PCR-based methods (such as LAM-PCR) consists in the step of second strand synthesis where the use of a partially double stranded –degenerated primer that binds at the end of the DNA single strands bypasses the need for the restriction digestion step that inserts a bias in integration site detection and for the cassette ligation step that renders the whole procedure inefficient. This method generates a highly informative integration site library used for the sequencing of the human genomic – retroviral junctions, by creating a PCR product pool that contains a high percentage of specific fragments of similar length that can be subcloned with the same efficiency in a sequencing vector. It can also be used for the creation of the clonal composition profile of patient’s each cell lineage in time allowing the monitoring of clonal kinetics of the haematopoietic or immune system by detecting the emergence of new clones that contribute to haematopoiesis.

Τα επισωματικά αυτο-αναπαραγώμενα συστήματα αποτελούν υποσχόμενα εναλλακτικά οχήματα γονιδιακής μεταφοράς για εφαρμογές της γονιδιακής θεραπείας. Η πρόσφατη κατανόηση της ικανότητας των αλληλουχιών S/MAR να διαμεσολαβούν την επισωματική διατήρηση γενετικών στοιχείων επέτρεψε την ανάπτυξη ενός πρότυπου κυκλικού επισωματικού φορέα που λειτουργεί χωρίς να κωδικοποιεί πρωτεΐνες ιϊκής προέλευσης. Σε αυτή τη μελέτη, διερευνήθηκε για πρώτη φορά η δυνατότητα αυτού του φορέα, pEPI-eGFP, να μεσολαβεί γονιδιακή μεταφορά σε κυτταρικές σειρές προγονικών αιμοποιητικών κυττάρων καθώς και σε πρωτογενή ανθρώπινα κύτταρα και, κυρίως, σε ανθρώπινα προγονικά αιμοποιητικά κύτταρα. Δείχνουμε ότι ο φορέας pEPI-eGFP διατηρείται επισωματικά και υποστηρίζει παρατεταμένη έκφραση του γονιδίου αναφοράς eGFP, ακόμα και χωρίς πίεση επιλογής, στην ανθρώπινη κυτταρική σειρά K562, καθώς και σε πρωτογενείς ανθρώπινους ινοβλάστες. Αντίθετα, στην κυτταρική σειρά ερυθρολευχαιμίας ποντικού MEL, η έκφραση της eGFP αποσιωπάται μέσω αποακετυλίωσης ιστονών, παρά την επισωματική διατήρηση του φορέα. Προγονικά αιμοποιητικά κύτταρα με κλωνογόνο ικανότητα, προερχόμενα από αίμα ομφάλιου λώρου, διαμολύνονται αποτελεσματικά με το φορέα μέσω ηλεκτροδιάτρησης. Ημιστερεές αποικίες προερχόμενες από διαμολυσμένα CD34+ κύτταρα διατηρούν το φορέα και εκφράζουν eGFP. Μετά από 4 εβδομάδες ο φορέας διατηρείται επισωματικά σε περίπου 1% των θυγατρικών κυττάρων. Τα αποτελέσματά μας αποδεικνύουν για πρώτη φορά ότι ένα πλασμίδιο βασιζόμενο σε μια αλληλουχία S/MAR μπορεί να λειτουργεί ως σταθερό επιίσωμα σε πρωτογενή ανθρώπινα κύτταρα και, ιδιαίτερα, σε προγονικά αιμοποιητικά κύτταρα, υποστηρίζοντας παρατεταμένη έκφραση του διαγονιδίου. Η μελέτη αυτή αναδεικνύει τη χρησιμότητα του συστήματος αυτού για τους σκοπούς της γονιδιακής θεραπείας. Παράλληλα, καταδεικνύει τους στόχους στους οποίους πρέπει να επικεντρωθεί η μελλοντική έρευνα προς την κατεύθυνση της βελτίωσής του. / Episomally maintained self-replicating systems present attractive alternative vehicles for gene therapy applications. Recent insights into the ability of chromosomal scaffold/matrix attachment regions (S/MARs) to mediate episomal maintenance of genetic elements cloned in cis allowed the development of a small circular episomal vector that functions independently of virally encoded proteins. In this study, we investigated the potential of this vector, pEPI-eGFP, to mediate gene transfer in hematopoietic progenitor cell lines as well as in primary human cells and, importantly, in human hematopoietic progenitor cells. pEPI-eGFP was episomally maintained and conferred sustained eGFP expression even in nonselective conditions in the human cell line, K562, as well as in primary human fibroblast-like cells. In contrast, in the murine erythroleukemia cell line, MEL, transgene expression was silenced through histone deacetylation, despite the vector’s episomal persistence. Hematopoietic semisolid cell colonies derived from transfected human cord blood retained the vector and expressed eGFP. After 4 weeks, the vector was maintained in approximately 1% of progeny cells. Our results provide the first evidence that a S/MAR-based plasmid can function as a stable episome in primary human cells, supporting long-term transgene expression. The present study constitutes a proof of principle for the utility of this system in gene therapy applications and points at targets for future improvements.

Οι αυτοαναπαραγόμενοι επισωματικοί φορείς γονιδιακής μεταφοράς αποτελούν πολλά υποσχόμενους φορείς γονιδιακής θεραπείας. Στην παρούσα εργασία δημιουργήθηκε ο φορέας Zif-VP64-EP2 στα πλαίσια των μελετών γονιδιακής θεραπείας για τις αιμοσφαιρινοπάθειες. Πρόκειται για ένα κυκλικό πλασμίδιο, που φέρει το γονίδιο ενός τεχνητού μεταγραφικού παράγοντα της γ-σφαιρίνης του Zif-VP64 υπό την επενέργεια του ισχυρού υποκινητή pSFFV καθώς και τo γονίδιο της eGFP με το S/MAR στοιχείο από την περιοχή 5’ του γονιδίου της ανθρώπινης ιντερφερόνης β υπό την επενέργεια του υποκινητή pCMV. Διαπιστώθηκε ότι το Zif-VP64-EP2 μεσολαβεί γονιδιακή μεταφορά σε διαμολυσμένα κύτταρα της ανθρώπινης κυτταρικής σειράς Κ562. Η μακράς διάρκειας διαμολυσμένη καλλιέργεια (3 μήνες) καταδεικνύει ότι το όχημα είναι λειτουργικό και διατηρείται ως επισωματικό σε Κ562 κύτταρα διαμολυσμένα κύτταρα με το Zif-VP64- ΕΡ2. / Self-replicating episomal vectors for gene transfer are a new and very promising experimental approach to gene therapy. In this study, it was created the vector Zif-VP64-EP2, within the context of developing self-replicating episomal vectors for the gene therapy of hemoglobinopathies. Zif-VP64-EP2 is a circular plasmid which includes the gene of an artificial transcription factor for gamma globin: Zif-VP64 under the control of pSFFV promoter and the gene of eGFP with the S/MAR element from the region 5’ of the human interferon β gene under the control of pCMV promoter. It was established that Zif-VP64-EP2 was retained within the transfected Κ562 hematopoietic progenitor cell. Its episomal situation for a long time (3 months) and its normal expression in K562 human cells constitutes a proof of the utility of Zif-VP64- ΕΡ2 system in gene therapy applications.