Techn. University, Diss., 2005--München.

Zugl.: Berlin, Charité, Univ.-Med., Diss., 2008

Die Rheumatoide Arthritis ist eine chronische Autoimmunerkrankung, deren Pathogenese noch unvollständig verstanden ist. Eine Dysbalance von pro- und antiinflammatorischen T-Helferzellen ist an der Entzündungsreaktion wesentlich beteiligt. Die Rolle von proinflammatorischen Th17-Zellen und regulatorischen Tregs ist bereits recht gut erforscht und bietet bereits erfolgreiche Therapieansätze. Umstritten bleibt die Rolle der sogenannten Th9-Zellen, welche pro- und antiinflammatorische Wirkungen zu vereinen scheinen. Die vorliegende Untersuchung umfasst die Daten von 7 RA-Patientinnen und -Patienten und 10 gesunden Kontrollen. Nach Isolation von naiven CD4+ T-Zellen erfolgte eine durchflusszytometrische Phänotypisierung der T-Zellen. Diese Phänotypisierung zeigte keinen relevanten Unterschied zwischen Pat und HD. Im Anschluss an eine 3-tägige Zellkultur von naiven und nicht naiven CD4+ T-Zellen unter Th9- und Th17-Stimulation erfolgte eine Auswertung mittels Durchflusszytometrie, RT-PCR und ELISA. Hierbei wurde eine sehr ähnliche Wirkung beider Stimuli auf die T-Zelldifferenzierung, die Zytokinproduktion und die Expression von Oberflächenmarkern beobachtet. Insbesondere die IL-9-Produktion wurde durch beide Stimuli signifikant induziert. Es scheint, dass IL-9-produzierende Zellen durch unterschiedliche Differenzierungswege induziert werden. Dies unterstützt die kontroverse Hypothese, dass Th9-Zellen keinen eigenständigen T-Helferzellsubtyp darstellen. Im Vergleich zu den Pat in Remission war die induzierte Zytokinproduktion (IL-9, IL-17, IFNγ) bei den HD betont. Dies liegt vermutlich an unspezifischen Effekten durch die immunsuppressive Therapie. Bei den beiden Patientinnen und Patienten mit der höchsten Krankheitsaktivität jedoch wurde die höchste IL-9-Konzentration in den Überständen nach Stimulation festgestellt. Ein IL-9-Exzess bzw. eine IL-9-Blockade hatte keinen signifikanten Einfluss auf die T-Zelldifferenzierung, die Zytokinproduktion und die Expression der Oberflächenmarker und des Transkriptionsfaktors. Das Vorliegen eines relevanten IL-9-regulierenden, autokrinen Mechanismus ist daher unwahrscheinlich. Zusammenfassend ergeben sich Hinweise, dass es sich bei IL-9-produzierenden Zellen aufgrund der diversen Differenzierungswege nicht um einen eigenständige T-Helferzellsubtyp handelt. Es benötigt einen sehr gut ausbalancierten Zytokincocktail und vermutlich eine längere Kulturzeit, um tatsächlich Th9-Zellen zu polarisieren. Ob diese in vivo vorkommen und eine Rolle in der Pathogenese der RA spielen ist zum jetzigen Zeitpunkt ebenso unklar wie die Rolle des IL-9 in der Pathogenese der RA. Daher kommt IL-9 als therapeutisches Ziel nach jetziger Kenntnis nicht in Betracht. / Rheumatoid arthritis is a chronic autoimmune disease whose pathogenesis is not yet fully understood. An imbalance of proinflammatory and anti-inflammatory T helper cells is essential to the inflammatory response. The role of proinflammatory Th17 cells and regulatory T cells has already been researched well and offers successful therapeutic approaches. The role of Th9 cells, which seem to combine proinflammatory and anti-inflammatory effects, remains controversial. The present study includes data from 7 RA patients and 10 healthy controls. T cells were phenotyped by flow cytometry after isolation of naive CD4+ T cells from PBMC. This phenotyping showed no relevant difference between RA patients and HD. Following a 3-day cell culture of naive and non-naive CD4+ T cells under Th9- and Th17-inducing conditions, the evaluation was carried out using flow cytometry, RT-PCR and ELISA. A very similar effect of the Th9- and Th17-stimulus on T-cell differentiation, cytokine production and the expression of surface markers was observed. IL-9 production was significantly induced by both stimuli. It appears that IL-9 producing cells are induced by different pathways of differentiation. This supports the controversial hypothesis that Th9 cells are not an independent Th cell subset. In comparison to RA patients in remission, the induced cytokine production (IL-9, IL-17, IFNγ) was higher in HD. This is probably due to unspecific effects of immunosuppressive therapy. Two patients with the highest disease activity, however, also showed the highest IL-9 concentration in the supernatants after stimulation. Neither an IL-9 excess nor an IL-9 blockade had a significant influence on T-cell differentiation, cytokine production, the expression of surface markers and of the transcription factor PU.1. The existence of a relevant IL-9-regulating autocrine mechanism seems unlikely. In summary, there is evidence that IL-9-producing cells are not an independent Th cell subset. It takes a very well-balanced cytokine cocktail and probably a longer cell culture to polarize actual Th9 cells. Whether Th9 cells occur in vivo and play a role in the pathogenesis of RA remains unclear as well as the role of IL-9 in the pathogenesis of RA. Therefore, according to present knowledge, IL-9 is not an option as a therapeutical target.

Leishmaniasis is a neglected tropical disease that can be manifested through different clinical forms, ranging from cutaneous to visceral. The host response against Leishmania spp. is greatly dependent on T cell-mediated immunity, in which T helper 1 responses are associated with macrophage activation and elimination of the parasite, while regulatory T cells and T helper 2 responses are correlated with parasite survival and persistence of infection. Leishmania uses different virulence factors as strategies for evading the immune response of the host. One of them are cathepsin-like cysteine proteases, which are currently under extensive investigation as targets for drug development. Previous studies with inhibitors of cathepsins B and L in vivo revealed an outstanding modulation of the host T helper cell response. However, the mechanisms behind these observations were not further investigated. Given the urgent need for better treatments against leishmaniasis, the aim of this study was to investigate the effects that the lack of cathepsin B and L activity have on the signals that dendritic cells use to instruct T helper cell polarization in response to infection with Leishmania major. The cathepsin inhibitors tested showed low or no cytotoxicity in bone marrow-derived dendritic cells, and dendritic cells and macrophages could be generated from cathepsin B and cathepsin L-deficient mice without apparent alterations in their phenotype in comparison to wild-type controls. Furthermore, lack of cathepsin B and L activity showed no impact in the rate of promastigote processing by dendritic cells. Cathepsin B and cathepsin L-deficient macrophages showed no differences in parasite proliferation and capacity to produce nitric oxide in comparison to wild-type macrophages. In response to the parasite, dendritic cells treated with a cathepsin B inhibitor and dendritic cells from cathepsin B-deficient mice showed higher levels of expression of major histocompatibility complex (MHC) class II molecules than dimethyl sulfoxide (DMSO) or wild-type controls, but it was not accompanied by changes in the expression of costimulatory molecules. Wild-type dendritic cells and macrophages are not able to express the pro-inflammatory cytokine interleukin (IL)-12 in response to promastigotes. However, cells treated with a cathepsin B inhibitor or cells deficient for cathepsin B were able to express IL-12, whilethe expression of other cytokines -including IL-6 and tumor necrosis factor (TNF)-alpha-remained unchanged. These characteristics point towards a more “pro-Th1” profile of dendritic cells in the absence of cathepsin B. This data is the first report on IL-12 regulation depending on cathepsin B. The IL-12 up-regulation observed was already present at the transcriptional level. Furthermore, it was also present in macrophages and dendritic cells in response to LPS, and the latter had a higher capacity to induce T cell helper 1 polarization in vitro than wild-type dendritic cells. The activation of different signaling pathways was analyzed, but the up-regulation of IL-12 could not be attributed to modulation of nuclear factor-kappaB (NFkappaB), p38 mitogen activated protein kinase (MAPK) and extra-cellular signal-regulated kinase (ERK)1/2 pathways. Thus, the mechanism behind IL-12 regulation by cathepsin B remains to be elucidated, and the impact of these effects is yet to be confirmed in vivo. Altogether it is tempting to speculate that cathepsin B, in addition to its role in processing endocytosed material, is involved in the modulation of the pro-inflammatory cytokine IL-12. / Leishmaniose ist eine hauptsächlich in den Tropen vorkommende Infektionskrankheit, die sich in verschiedenen klinischen Formen, von kutan bis viszeral, manifestieren kann. Die Reaktion des Wirtes gegen Leishmania spp. hängt stark von der T-Zell-vermittelten Immunantwort ab, wobei die Antwort der T1-Helferzellen assoziiert ist mit der Aktivierung von Makrophagen und der Beseitigung des Parasiten, während die regulatorischen T-Zellen und T2-Helferzellen mit dem Überleben der Parasiten und der Fortdauer der Infektion in Verbindung stehen. Leishmania verwendet verschiedene Virulenzfaktoren als Strategie zur Umgehung der Immunantwort des Wirtes. Darunter zählen Cathepsin-ähnliche Cysteinproteasen, die derzeit Gegenstand umfangreicher Untersuchungen sind mit dem Ziel, für die Arzneimittelentwicklung eingesetzt werden zu können. Frühere Studien mit Inhibitoren von Cathepsin B und L in vivo zeigten eine hervorragende Modulation der Wirt-T-Helferzellantwort. Jedoch wurden die Mechanismen, die diesen Beobachtungen zu Grunde liegen, nicht weiter untersucht. Angesichts der dringenden Notwendigkeit einer besseren Behandlung gegen Leishmaniose war das Ziel dieser Studie die Auswirkungen zu untersuchen, die das Fehlen von Cathepsin B und L-Aktivität auf die Signale hat, welche die dendritischen Zellen verwenden, um die Reaktion der T-Helferzellen auf eine Infektion mit Leishmania major zu beeinflussen. Die getesteten Cathepsin-Inhibitoren zeigten geringe oder keine Cytotoxizität in den aus dem Knochenmark präparierten dendritischen Zellen. Dendritische Zellen und Makrophagen von Cathepsin B- und Cathepsin L-defizienten Mäusen zeigten keine offensichtlichen Veränderungen ihres Phänotyps im Vergleich zu Wildtypkontrollen. Weiterhin zeigte das Fehlen von Cathepsin B- und L-Aktivität keine Auswirkung auf die Prozessierung der Promastigoten durch dendritische Zellen. Auch zeigten Cathepsin Bund Cathepsin L-defiziente Makrophagen keine Unterschiede in der Parasitenproliferation und der Fähigkeit Stickoxid zu produzieren im Vergleich zu Wildtyp-Makrophagen. In Reaktion auf den Parasiten war bei mit einem Cathepsin-B-Inhibitor behandelten dendritischen Zellen und dendritischen Zellen von Cathepsin-B-defizienten Mäusen eine höhere Expression von MHC-Klasse-II-Molekülen ersichtlich im Vergleich zu DMSO oder Wildtyp-Kontrollen, aber es wurden keine Veränderungen in der Expression von costimulatorischen Molekülen festgestellt. Dendritische Zellen und Makrophagen von Wildtyp-Mäusen sind nicht in der Lage das pro-inflammatorische Zytokin IL-12 als Reaktion auf die Promastigoten zu exprimieren. Jedoch konnten dendritische Zellen, die mit einem Cathepsin-B-Inhibitor behandelt waren oder Cathepsin-B-defiziente Zellen, IL-12 exprimieren, während die Expression von anderen Zytokinen - einschließlich IL-6 und TNF-alpha- unverändert blieb. Diese Eigenschaften weisen in die Richtung einer "pro-Th1"-Antwort der dendritischen Zellen in Abwesenheit von Cathepsin B. Diese Daten sind der erste Bericht über die IL-12-Regulierung in Abhängigkeit von Cathepsin B. Die Hochregulation von IL-12 war bereits auf der Transkriptionsebene zu beobachten. Weiterhin war sie in Makrophagen und dendritischen Zellen auch als Reaktion auf LPS vorhanden. Dendritische Zellen von Cathepsin B-defizienten Mäusen hatten eine höhere Kapazität zur Induktion einer eine T1-Helferzell-Polarisierung in vitro als dendritische Zellen von Wildtyp-Mäusen. Die Aktivierung von verschiedenen Signalwegen wurde untersucht, jedoch konnte die Hochregulierung von IL-12 nicht auf die Modulation von NF_B, p38 MAPK und ERK1/2-Signalwege zurückgeführt werden. Damit ist der für die IL-12-Regulierung durch Cathepsin B verantwortliche Mechanismus noch nicht geklärt; auch die Auswirkungen dieser Effekte in vivo müssen noch bestätigt werden. Insgesamt lässt die vorliegende Studie vermuten, dass Cathepsin B nicht nur an der Prozessierung von endozytiertem Material sondern auch an der Regulierung des pro-inflammatorischen Zytokins IL-12 beteiligt ist.

Interleukin 2 (IL-2) ist ein Zytokin, welches in menschlichen Gedächtnis-T-Helfer-Zellen (Teff Zellen) exprimiert und sekretiert wird und damit die Immunantwort formt. Im Gegensatz dazu wird IL-2 normalerweise nicht in regulatorischen T-Zellen (Treg Zellen) exprimiert, sondern von diesen nur aufgenommen. Durch die Aktivierung des T-Zellrezeptors werden Signalkaskaden induziert, welche zur Aktivierung der Transkriptionsfaktoren AP-1, NFAT, und NF-kB führen. Diese sind entscheidend für die Genexpression von IL-2. Im Rahmen meiner Dissertation habe ich die Regulation der IL-2 Genexpression untersucht. Dabei vergleiche ich die transkriptionelle Regulation in Teff Zellen mit der Regulation in Treg Zellen. Insbesondere konnte ich zeigen, dass die endogene Konzentration der Transkriptionsfaktoren sich auf die Anzahl der IL-2 Produzenten auswirkt, aber nicht auf die Konzentration von IL-2 innerhalb einer Zelle. Deshalb untersuche ich wie sich die Konzentration der Transkriptionsfaktoren auf die Häufigkeit von IL-2 Produzenten auswirkt. Ich nutze die vorhandenen endogenen Konzentrationen und kann damit vorhersagen, dass die Zahl der IL-2 Produzenten entscheidend von der c-fos Konzentration in Teff Zellen abhängt. Mit Hilfe des entwickelten Modells kann ich voraussagen, wie der spezifische Inhibitor U0126 die Häufigkeit von IL-2 Produzenten verringert. Diese Vorhersage wurde durch Experimente belegt. Meine Modelle zeigen weiterhin, dass c-fos und NFATc2 die Häufigkeit der IL-2 Produzenten in Teff Zellen kooperativ regulieren. In Treg-Zellen zeigt meine Analyse, dass alle Transkriptionsfaktoren eine ähnliche sigmoidale Wirkung auf die Häufigkeit der IL-2-Produzenten ausüben. Im Gegensatz zu den Teff Zellen haben alle Transkriptionsfaktor eine ähnliche maximale Wirkung auf Genexpression von IL-2. Mittels eines Inhibitionsmodelles konnte ich zeigen, dass der Treg zellspezifische Transkriptionsfaktor FoxP3 allen aktivierenden Transkriptionsfaktoren entgegenwirkt. / Interleukin 2 (IL-2) is a cytokine expressed in human memory T helper cells (Teff cells) and the secretion of IL-2 shapes the immune response. In contrast, human regulatory T-cells (Treg cells) commonly do not express IL-2. The gene expression of IL-2 is induced by the activation of the T-cell receptor signaling network activating the transcription factors AP-1, NFAT, and NF-kB. These transcription factors are crucial for initiating IL-2 gene expression. Within my thesis I compare the regulation of IL-2 gene expression in Teff cells and Treg cells using experiments and modeling. I demonstrate that the transcription factor concentrations correlate with number of IL-2 producers but do not affect IL-2 concentration per cell. Thus, I investigate how the transcription factor concentration of c-fos, NFATc2, p65, and p-c-jun affects the frequency of IL-2 producing cells as a proxy for the probability of a cell to produce IL-2. Using the endogenous heterogeneity of transcription factor concentrations, I predict that the number of IL-2 producers is critically dependent on the amount of c-fos in Teff cells. I use my model to predict how perturbations of c-fos by the specific inhibitor U0126 decrease the frequency of IL-2 producers in Teff cells. This prediction was than validated by experiments. My models furthermore indicate the cooperative behavior of c-fos and NFATc2 on the level of frequency of IL-2 producers in Teff cells. In Treg cells, I show that all transcription factors exert a similar sigmoidal effect on the frequency of IL-2 producers. In contrast to the effects seen in Teff cells, all transcription factor have a similar maximal effect on the IL-2 gene expression. With an inhibitory model I explore the relation between the Treg cell-specific transcription factor FoxP3 the transcription factors c-fos, NFATc2, p65, and p-c-jun on the frequency of IL-2 producers. This model indicates that FoxP3 counteracts the activating function of NFATc2, AP-1, and also NF-kB.