For pathogenic microorganisms, heme uptake and degradation is a critical mechanism for iron acquisition that enables multiplication and survival within hosts they invade. While the bacterial proteins involved in heme transport had been identified at the initiation of our investigation, the fate of heme once it reached the cytoplasm was largely uncharacterized. Here we report the first crystal structures of two members of the heme utilization operon from the human pathogen Escherichia coli O157:H7. These are the heme oxygenase ChuS in its apo and heme-complexed forms, and the apo form of heme binding protein ChuX. Surprisingly, despite minimal sequence similarity between the N- and C-terminal halves, the structure of ChuS is a structural repeat. Furthermore, the ChuS monomer forms a topology that is similar to the homodimeric structure of ChuX. Based on spectral analysis and carbon monoxide measurement by gas chromatography, we demonstrated that ChuS is a heme oxygenase, the first to be identified in any E. coli strain. We also show that ChuS coordinates heme in a unique fashion relative to other heme oxygenases, potentially contributing to its enhanced activity. As ChuS and ChuX share structural homology, we extended the structural insight gained in our analysis of ChuS to purport a hypothesis of heme binding for ChuX. Furthermore, we demonstrated that ChuX may serve to modulate cytoplasmic stores of heme by binding heme and transferring it to other hemoproteins such as ChuS. Based on sequence and structural comparisons, we designed a number of site-directed mutations in ChuS and ChuX to probe heme binding sites and mechanisms in each. ChuS and ChuX mutants were analyzed through reconstitution experiments with heme and functional analyses, including enzyme catalysis by ChuS and mutants, and in culture development during heme challenge experiments by ChuX and mutants. Taken together, our results suggested that ChuX acts upstream of ChuS, and regulates heme uptake through ChuX-mediated heme binding and release. ChuS can degrade heme as a potential iron source or antioxidant, thereby contributing directly to E. coli O157:H7 pathogenesis. Functional implications that may be revealed from sequence and structure based information will be addressed as they pertained to our evaluation of ChuS and ChuX. / Thesis (Ph.D, Biochemistry) -- Queen's University, 2007-04-27 11:34:50.272

Les Bartonelles sont des bactéries hémotropes responsables de zoonoses émergentes. Ces Alphaprotéobactéries sont auxotrophes pour l'hème et doivent donc l'importer du milieu extérieur pour croître. Les Bartonelles possèdent un système complet de transport de l'hème permettant de transporter ce composé dans le cytoplasme. Chez Bartonella, il a été montré que l'hème pouvait être utilisé comme source de fer. Comme pour d'autres bactéries utilisant l'hème comme une source de fer, Bartonella doit dégrader l'hème pour libérer le fer. Chez Bartonella, un ensemble de gènes codant pour le système de transport de l'hème, contient un gène codant pour un polypeptide (HemS) présentant des homologies avec des protéines liant ou dégradant l'hème. En utilisant des expériences de complémentation de mutants d'E. coli incapables de dégrader l'hème, nous avons mis en évidence que HemS de Bartonella henselae permet la libération du fer de l'hème. HemS purifié lie l'hème et le dégrade en présence de donneurs d'électrons. La diminution du niveau de HemS chez B. henselae décroit sa capacité de survivre à une exposition à H2O2. Les Bartonelles expriment quatre ou cinq protéines de la membrane externe ayant la capacité de fixer l'hème. Les gènes de structure de ces protéines sont exprimés différemment en fonction de paramètres comme la température ainsi que la concentration en oxygène ou en hème. Ces protéines ont été proposées comme étant impliquées dans divers processus cellulaires étant donné leur profil d'expression. Dans ce manuscrit, nous montrons que ces protéines sont impliquées dans la défense contre le stress oxydatif, la colonisation des cellules endothèliales et la survie dans la puce