Abstract Deficiency of pulmonary surfactant is the main cause of respiratory distress syndrome (RDS) in premature newborn infants, which is often complicated by chronic lung disease (CLD). Preterm birth is often associated with intra-amniotic infection (IUI), which is characterized by increased proinflammatory cytokines, such as interleukin-1 (IL-1) and tumor necrosis factor-α (TNF-α), in the amniotic fluid. In very preterm birth due to IUI, the incidence of RDS is decreased, while the incidence of CLD is increased. Maternal glucocorticoids are used in imminent preterm birth to prevent RDS. This study was designed to clarify the contrasting association of these perinatal pulmonary diseases with IUI and the pathogenesis of these lung diseases using an in vitro rabbit model. IL-1 increased the expression of surfactant protein (SP)-A and SP-B in very immature lung. Contrariwise, in transitional and mature fetal lung as well as in newborn lung, IL-1 additively with TNF-α decreased the expression of SP-B and SP-C. Bacterial lipopolysaccharide (LPS) decreased SP-A, -B and -C mRNAs in mature fetal and newborn lung, but had no effect on SP expression in immature lung. Interferon-γ (IFN-γ) had no effect on SP expression at any gestational age, but it modified the effects of the other cytokines. Dexamethasone (Dx) and IL-1 in combination additively increased SP-A and SP-B mRNAs in immature lung. Dx abolished the inhibitory effect of IL-1 on SP-B and SP-C in mature lung. Dx and IL-1 together tended to stabilize SP mRNAs. The present findings provide additional evidence of the role of the transcription factors nuclear factor-κB (NF-κB) and C/CAAT enhancer-binding protein δ (C/EBPδ) in the upregulation of SP-A by IL-1 in immature lung. Proinflammatory cytokines profoundly influence the expression of surfactant proteins in a manner that is strictly dependent on the length of gestation. The present findings help to explain the differences in the incidence of RDS and CLD in preterm births caused by IUI, and they may clarify further the role of surfactant in the pathogenesesis of lung diseases in neonatal infants. / Tiivistelmä Keuhkosurfaktantin puute aiheuttaa ennenaikaisesti syntyville keskosille vastasyntyneen hengitysvaikeusoireyhtymää eli RDS-tautia (Respiratory Distress Syndrome). Toinen keskosilla esiintyvä keuhkosairaus on krooninen keuhkosairaus eli CLD (Chronic Lung Disease). Glukokortikoideja käytetään hoitona ennenaikaisen synnytyksen uhatessa, koska niiden tiedetään vähentävän RDS-taudin riskiä. Kohdunsisäinen infektio on huomattava ennenaikaisen synnytyksen aiheuttaja. Infektiossa tulehduksen välittäjäaineet, kuten sytokiinit interleukiini-1 (IL-1) ja tuumorinekroositekijä alfa (TNF-α) lisääntyvät lapsivedessä. Infektiosta aiheutunut ennenaikainen synnytys vähentää RDS-taudin ilmaantumista pienille keskosille ja toisaalta lisää kroonisen keuhkosairauden riskiä. Tutkimuksen oli tavoitteena selvittää, miksi RDS ja CLD ilmaantuvat eriävästi infektion vuoksi ennenaikaisesti syntyneille vauvoille. Viljelemällä eri-ikäisten kanin sikiöiden sekä vastasyntyneiden kanin poikasten keuhkon kappaleita tutkittiin tulehduksen välittäjäaineiden sekä anti-inflammatorisen glukokortikoidin (deksametasonin) vaikutusta surfaktantin toiminnalle tarpeellisten surfaktanttiproteiinien (SP) ilmentymiseen. IL-1 lisäsi SP-A:n ja SP-B:n ilmentymistä erittäin epäkypsässä kanin sikiön keuhkossa. Toisaalta IL-1 ja TNF-α vähensivät SP-B:n ja SP-C:n ilmentymistä kypsemmässä sikiön sekä vastasyntyneen kanin keuhkossa. Interferoni-gamma (IFN-γ) ei vaikuttanut surfaktanttiproteiinien ilmentymiseen missään gestaatioiässä, mutta se muunsi muiden sytokiinien surfaktanttivaikutusta. Gram-negatiivisten bakteerien soluseinän tuote, lipopolysakkaridi (LPS) vähensi SP-A:n, SP-B:n ja SP-C:n ilmentymistä kypsässä kanin sikiön ja vastasyntyneen kanin keuhkossa. IL-1:llä ja deksametasonilla oli positiivinen yhteisvaikutus surfaktanttiproteiinien ilmentymiseen. Tämän surfaktanttiproteiineja lisäävän vaikutuksen mekanismiksi havaittiin pääasiallisesti lisääntynyt mRNA:n stabiliteetti. Lisäksi tutkimus antaa lisätietoa kahden transkriptiofaktorin, NF-κB:n (nuclear factor kappa B) ja C/EBPγ:n (C/CAAT enhancer binding protein delta), osuudesta IL-1:n aiheuttamassa SP-A:n ilmentymisen lisääntymisessä. Sytokiinien vaikutukset surfaktanttiproteiinien ilmentymiseen ovat riippuvaisia gestaatioiästä. Tutkimuksen löydökset auttavat ymmärtämään RDS:n ja CLD:n vastakohtaista esiintymismäärää keskosilla, joiden ennenaikainen synnytys on aiheutunut kohdunsisäisestä tulehduksesta. Edelleen tutkimus selittää glukokortikoidien positiivista vaikutusta hengitysvajaukseen johtavassa keuhkotulehduksessa.

Abstract Respiratory distress syndrome, RDS, is a multifactorial lung disease of premature infants. The main cause of RDS is a deficiency of pulmonary surfactant, a lipoprotein mixture required to reduce surface tension at the air-liquid interface and to prevent generalized atelectasis of the alveolar ducts and alveoli. Prematurity is the most important factor predisposing to RDS. During the past decade the number of multiple pregnancies has increased significantly as a result of diversified infertility treatments and advanced maternal age. Due to the considerably higher rate of preterm births of multiples compared to singletons, RDS is one of the major causes of morbidity among them. The objectives of the present research were to evaluate the incidence and risk factors of RDS in twins compared to singletons, and to assess the role of SP-A and SP-B gene variations and gene-environment interactions in the susceptibility to the disease in a population of preterm twins and higher order multiples. This research showed that during the past fifteen years the gestational age-specific incidence of RDS has declined. Twin infants do not have increased risk of RDS except when born very immaturely at a very early gestational age. The presenting twin is less susceptible to RDS than the non-presenting twin or singleton infant after 28 weeks of gestation until term. Additionally the SP-B Ile131Thr polymorphism was shown to affect the susceptibility specifically in the presenting twin. The role of SP-A polymorphisms in the risk of RDS in twins turned out to be different from that in singletons. The major allele and genotype of SP-A1 were associated with a decreased risk of RDS in near-term twin infants. The threonine allele in SP-B Ile131Thr appeared interactively with SP-A1 to associate with the risk of RDS both in twins and in singletons: associating with a lower risk of RDS in singletons at very early gestation, but surprisingly associating with a protection in twins and multiples from RDS near term. The risk of RDS, defined by the interaction of SP-A and SP-B alleles, was additionally associated with the fetal mass. Thus, the difference in the susceptibility to RDS in premature singletons and multiples may depend on the size of the conceptus. In an evaluation of the genetic risk factors for RDS, the classical twin study method comparing the concordance of a disease between MZ and DZ twins underestimates the extent of heredity. Several predominant intrauterine and perinatal environmental factors contribute to disease susceptibility regardless of zygosity and are suspected to override the hereditary components of RDS. Twin gestation was shown to be an effect modifier in the genetic susceptibility to RDS. / Tiivistelmä Vastasyntyneen hengitysvaikeusoireyhtymä, RDS-tauti, on hyvin monitekijäinen ennenaikaisena syntyneiden lasten sairaus. Taudin tärkein syy on keuhkojen pintajännitystä alentavan aineen, surfaktantin, puute ennenaikaisessa synnytyksessä. Surfaktantti on rasva-proteiiniseos, joka alentaa keuhkorakkuloiden pintajännitystä ja estää rakkuloiden kasaan painumisen hengityksen aikana. Epäkypsyys on tärkein RDS-taudin kehittymiselle altistava tekijä. Viimeisen vuosikymmenen aikana monisikiöiset raskaudet ovat lisääntyneet merkittävästi keinohedelmöitysten ja synnyttäjien kohonneen iän seurauksena. RDS-tauti on monisikiösynnytyksissä tärkeä sairastavuutta aiheuttava tekijä, koska monisikiöraskaudet päättyvät huomattavasti useammin ennenaikaisesti kuin yksösraskaudet. Tämän tutkimuksen tarkoituksena oli selvittää RDS-taudin ilmaantuvuutta ja riskitekijöitä kaksosilla verrattuna yksösiin, tutkia surfaktanttiproteiinien A ja B geenivaihtelua sekä geenien ja ympäristötekijöiden vuorovaikutusta kaksosten ja monisikiöisistä raskauksista syntyneiden lasten RDS-taudissa. Tutkimus osoitti, että viimeisten viidentoista vuoden aikana RDS-taudin raskausikäkohtainen ilmaantuvuus on vähentynyt. Vain hyvin epäkypsillä, ennenaikaisilla kaksosilla on lisääntynyt riski sairastua RDS-tautiin verrattuna yksösiin. 28 raskausviikon jälkeen ensimmäisenä syntyvällä kaksosella on pienempi riski saada RDS-tauti kuin toisena syntyvällä tai yksösellä. Lisäksi surfaktanttiproteiini B:n (SP-B) geenin eksonin 4 monimuotoisuus osoittautui vaikuttavan RDS-taudin alttiuteen erityisesti ensin syntyvällä kaksosella. Surfaktanttiproteiini A:n (SP-A) geenin yhteys RDS-taudin riskiin osoittautui olevan erilainen kaksosilla verrattuna yksösiin. Lähes täysiaikaisilla kaksosilla SP-A1 geenin valta-alleeli ja genotyyppi liittyivät RDS-taudin vähentyneeseen riskiin. SP-B geenin eksonin 4 treoniini alleeli osoittautui liittyvän yhdessä SP-A1 valtagenotyypin kanssa RDS-taudin riskiin sekä yksösillä että kaksosilla: hyvin ennenaikaisilla yksösillä geenien yhteisvaikutus lisäsi riskiä, kun taas lähes täysiaikaisilla kaksosilla sama geenien yhteisvaikutus yllättäen suojeli RDS-taudilta. SP-A ja SP-B geenien vuorovaikutuksen kautta välittyvä RDS-taudin riski oli lisäksi yhteydessä sikiön kokoon. Siten ennenaikaisena syntyneiden yksösten ja monisikiöisten RDS-taudin alttiuden ero voi olla riippuvainen sikiön koosta. Klassinen kaksostutkimusmenetelmä, jossa verrataan identtisten ja ei-identtisten kaksosten sairastuvuutta, aliarvioi perimän määräämien tekijöiden osuutta RDS-taudin synnyssä. Useat hallitsevat kohdunsisäiset ja synnytykseen liittyvät ympäristötekijät vaikuttavat RDS-taudin syntyyn ja kumoavat perimän osuutta. Kaksosuus osoittautui olevan periytymisen vaikutusta muokkaava tekijä RDS-taudissa.

Abstract Pulmonary surfactant is a lipid-protein mixture that lines the inner surface of the lung. The main function of surfactant is to reduce surface tension at the air-liquid interface, thus preventing alveolar collapse at the end of expiration. Lack of surfactant is the main cause of respiratory distress syndrome (RDS) in preterm infants. Very preterm babies are at risk of developing a lung disease called bronchopulmonary dysplasia (BPD). The surfactant proteins SP-A, -B, -C and -D have important functions in surfactant structure, homeostasis and innate immunity of the lung. The genes of these proteins have been studied as candidates for several multifactorial lung diseases both in adults and in children. The aim of the present study was to examine the genetic variation in SP genes and to evaluate the role of SP gene polymorphism in the etiology of severe pulmonary infantile diseases, including RDS, BPD and severe respiratory syncytial virus (RSV) infection among the Finnish population. Conventional allelic association methods in combination with multiparameter analysis and family-based transmission disequilibrium test (TDT) were used. The SP-D Met11 allele was associated with a risk for severe RSV bronchiolitis in a matched case-control setting of 84 infants with severe RSV infection and 93 control infants. The variants of the SP-C gene had no detectable association with BPD. However, a modest association of SP-C Asn138 and Asn186 alleles with RDS was found. A length variation in the SP-B gene was associated with BPD among very preterm infants born before 32 weeks of gestation. The SP-B intron 4 deletion variant allele increased the risk for BPD especially in very low birth weight infants. The association was confounded by birth order, being evident only among presenting infants, who are more prone to ascending infections during a preterm birth process. The present study provides new evidence about the significance of SP gene polymorphisms in the etiology of complex infantile pulmonary diseases, including RDS, BPD and severe RSV bronchiolitis. The results help us to understand the molecular mechanisms underlying these diseases and may, in the long run, enable better treatment of these life-threatening diseases. / Tiivistelmä Keuhkosurfaktantti on keuhkon sisäpintaa peittävä kalvomainen rasva-proteiinikompleksi, jonka tärkein ominaisuus on pintajännityksen vähentäminen keuhkorakkuloissa. Surfaktantin puutos ennenaikaisesti syntyneillä lapsilla aiheuttaa hengitysvaikeusoireyhtymän, RDS-taudin (respiratory distress syndrome). Alle 30 raskausviikon iässä syntyneistä, useimmiten RDS-taudin saaneista keskosista n. 30 % sairastuu vakavaan krooniseen keuhkotautiin, BPD-tautiin (bronchopulmonary dysplasia). Surfaktanttiproteiineilla SP-A, -B, -C ja -D on osoitettu olevan tärkeä tehtävä surfaktantin toiminnassa ja keuhkon synnynnäisessä immuniteetissa. Tämän tutkimuksen tavoitteena oli selvittää surfaktanttiproteiineissa esiintyvän geneettisen muuntelun määrää ja merkitystä keskosten RDS- ja BPD-taudeissa sekä pienten lasten vakavassa respiratory syncytial -viruksen (RSV) aiheuttamassa keuhkotulehduksessa. Tutkimuksen laajin osa keskittyi tutkimaan keskosten BPD-tautia ja surfaktanttiproteiinien geenien osuutta siinä. Geneettisen muuntelun merkitystä tarkasteltiin populaatiogeneettisin keinoin tapaus-verrokkiasetelmissa ja perheaineistojen avulla. Yhteensä analysoitiin noin tuhannen lapsen ja yli kahdensadan vanhemman DNA-näytteet. Tutkimuksessa havaittiin SP-D-geenissä olevan metioniini11-geenimuodon liittyvän pienten lasten vakavaan RSV-infektioon. Lisäksi saatiin uutta tietoa SP-C-geenin populaatiotason yleisestä muuntelusta ja todettiin SP-C:n asparagiini138 ja asparagiini186 -geenimuotojen yhteys keskosten RDS-taudin esiintymiseen. Merkittävin löydös oli SP-B-geenissä olevan deleetiovariantin kytkeytyminen alle 32-viikkoisina syntyneiden keskosten BPD-tautiin. Geneettisen altistuksen lisäksi BPD-tautiin sairastumiseen vaikuttivat lukuisat keskosuudelle ominaiset seikat, kuten alhainen syntymäpaino, RDS-tauti ja syntymähetkellä todettu hapenpuute. Geneettisen tekijän vaikutus oli voimakkain erittäin pienipainoisilla keskosilla. Tutkimuksen tulokset ovat tuoneet arvokasta lisätietoa surfaktanttiproteiinien geenien osuudesta keskosten RDS- ja BPD-taudeissa sekä pienten lasten vakavassa RSV-infektiossa. Ne auttavat ymmärtämään näiden molekyylibiologisia syntymekanismeja ja voivat ajan mittaan olla edistämässä uusien hoitomuotojen kehittämistä.