In der vorliegenden Arbeit wurde die Expression des Hedgehog Signaltransduktionsweges (Hh) in Kopf-Hals-Tumoren (Head and Neck Squamous Cell Carcinoma, HNSCC) im Vergleich zu gesunder Mukosa immunhistochemisch untersucht und quantitativ analysiert. Dabei wurde die Expressionsstärke mit Hilfe einer eigens weiterentwickelten objektiven Auswertungsmethode analysiert, die sich auf die Rot-Grün-Blau(RGB)-Farblehre stützte. Untersucht wurden histologisch gesicherte Proben von Kopf-Hals-Tumoren und gesunde Mukosa der Mundhöhle. Nach Färbung mittels spezifischen Immunfluoreszenzantikörpern gegen die Hedgehog Komponenten Sonic Hedgehog (SHH), Patched-1 (PTCH1), Patched-2 (PTCH2), Smoothened (SMO), Glioma-Associated Oncogene Homolog-1, -2 und -3 (Gli-1, Gli-2 und Gli-3) erfolgte die bildanalytische Auswertung der Fluoreszenzsignale. Dabei zeigte sich eine deutliche Überexpression aller Hh-Komponenten in den Tumorproben gegenüber der gesunden Mukosa. Die Expression des Transkriptionsfaktors Gli-1 erreichte dabei etwa zehnfach höhere Werte als in der Mukosa und die des Liganden SHH etwa vierfach höhere Werte. Die nachgewiesene Überexpression des Hh-Signalwegs in den Tumorproben deuten wir als potentiellen Kofaktor in der Genese von Kopf-Hals-Tumoren. Eine mögliche Bedeutung für neue zielgerichtete Therapieansätze in der Zukunft wird diskutiert.

Made available in DSpace on 2018-08-01T21:35:05Z (GMT). No. of bitstreams: 1 tese_9875_Dissertação_Brígida de Almeida Amorim Spagnol.PDF: 76 bytes, checksum: 453ecdc366d650488a41fe2b7ee242fb (MD5) Previous issue date: 2016-02-25 / Muitos estudos mostram que existe uma forte relação entre a ativação de vias reguladoras de resposta ao estresse, longevidade e envelhecimento. Embora as causas do envelhecimento sejam multifatoriais, essas vias reguladoras se mostram surpreendentemente conservadas entre os eucariontes. Manter os mecanismos de resposta ao estresse eficientes pode ser uma estratégia potencial para prolongar a longevidade, retardar o envelhecimento e o surgimento das doenças associadas a idade. A ciência da longevidade e do envelhecimento conduz ao uso de organismos modelos como as leveduras Saccharomyces cerevisiae, pois estas células revelam também preservação das vias envolvidas com o balanço energético, acúmulo de danos, resposta ao estresse, integridade genômica, apoptose, entre outros. Diante disso, esse trabalho teve como objetivo avaliar os efeitos da alta pressão hidrostática (HHP) em células-mães e células-filhas de S. cerevisiae, a fim de elucidar se a longevidade favorece a resposta ao estresse. Para isso, separaram-se células-mães de células-filhas através do método de cromatografia de afinidade, onde as células-mães tiveram sua superfície celular marcada com biotina e estreptavidina contendo microesferas magnéticas. Após isso, permitiu-se que essas células-mães gerassem célulasfilhas que nascessem sem marcação. Assim, o inoculo foi adicionado a uma coluna magnética, na qual, as células marcadas ficavam retidas e as não marcadas eluiam para um tubo de ensaio. Para indução do estresse, utilizou-se a HHP que é uma ferramenta capaz de induzir estresse oxidativo em S. cerevisiae, e isso possibilitou analisar a sobrevivência das leveduras e a expressão de genes envolvidos com resposta ao estresse, longevidade e envelhecimento. Observou-se que células-mães e filhas apresentam consideráveis diferenças desde as taxas de sobrevivência quanto aos resultados de expressão gênica. De forma que o primeiro grupo de células apresentou melhores resultados na resposta adaptativa ao estresse do que o segundo grupo. Dessa forma, podemos concluir que o estresse mostrou contribuir com a longevidade e a longevidade também mostrou ser importante para os mecanismos de respostas adaptativas mais eficazes contra os estímulos estressores.

In der vorliegenden Arbeit wurde die Expression des Hedgehog Signaltransduktionsweges (Hh) in Kopf-Hals-Tumoren (Head and Neck Squamous Cell Carcinoma, HNSCC) im Vergleich zu gesunder Mukosa immunhistochemisch untersucht und quantitativ analysiert. Dabei wurde die Expressionsstärke mit Hilfe einer eigens weiterentwickelten objektiven Auswertungsmethode analysiert, die sich auf die Rot-Grün-Blau(RGB)-Farblehre stützte. Untersucht wurden histologisch gesicherte Proben von Kopf-Hals-Tumoren und gesunde Mukosa der Mundhöhle. Nach Färbung mittels spezifischen Immunfluoreszenzantikörpern gegen die Hedgehog Komponenten Sonic Hedgehog (SHH), Patched-1 (PTCH1), Patched-2 (PTCH2), Smoothened (SMO), Glioma-Associated Oncogene Homolog-1, -2 und -3 (Gli-1, Gli-2 und Gli-3) erfolgte die bildanalytische Auswertung der Fluoreszenzsignale. Dabei zeigte sich eine deutliche Überexpression aller Hh-Komponenten in den Tumorproben gegenüber der gesunden Mukosa. Die Expression des Transkriptionsfaktors Gli-1 erreichte dabei etwa zehnfach höhere Werte als in der Mukosa und die des Liganden SHH etwa vierfach höhere Werte. Die nachgewiesene Überexpression des Hh-Signalwegs in den Tumorproben deuten wir als potentiellen Kofaktor in der Genese von Kopf-Hals-Tumoren. Eine mögliche Bedeutung für neue zielgerichtete Therapieansätze in der Zukunft wird diskutiert.

Immunogenic cell death (ICD) is characterized by presence of specific molecules including surface exposed calreticulin (CRT) and the heat shock proteins HSP70 and HSP90. Release of ATP and high- mobility group box protein 1 (HMGB1) belongs to other typical characteristics. For induction of ICD in lung cancer cells high-hydrostatic pressure (HHP) was used. Treatment by HHP induces expression of immunogenic markers CRT, HSP70 and HSP90 on the cell surface. HHP also induces secretion of ATP to the extracellular milieu. Dendritic cells (DC) pulsed with HHP-treated tumor cells showed fenotypic maturation characterized by upregulation of maturation molecule CD83, costimulation molecules CD80 and CD86, chemokine receptor CCR7 and MHC class II molecule HLA-DR. Pulsed DCs have also higher rate of phagocytosis of HHP-treated tumor cells and they induce lower numbers of regulatory T cells compared to immature DCs. Moreover, activation of caspases (-8, -9, -3) and other proteins (phosphorylation of eIF2α) which are crucial in ER-stress mediated apoptotic pathway, was observed after HHP treatment. Using wide range of methods it was confirmed that HHP treatment is able to induce ICD in lung cancer cell lines, fenotypic and functional characteristics were described and the decreased induction of regulatory T-lymphocytes...

Os objetivos dos experimentos foram primeiro determinar as taxas de desenvolvimento in vitro de embriões murinos no estágio de 8-células expostos a 15.7 MPa de N2 durante 2 ou 4 horas. Segundo, determinar as taxas de sobrevivência embrionária à crioconservação dos blastocistos originados a partir do cultivo dos embriões de 8-células após a indução do estresse subletal celular com o auxílio da pressão gasosa. Terceiro, determinar a expressão dos genes BAX, Bcl2, GLUT1, GLUT3, IGF1, IGF2, IGF1-R, IGF2-R, SOD2, HSP70.1, AQP3 e PPIA nas seguintes etapas experimentais: no estágio de 8-células imediatamente após a coleta dos embriões; no estágio de blastocisto antes e após o congelamento. Nas seis replicações realizadas foram utilizados 14 machos e 60 fêmeas Mus musculus domesticus. Na primeira etapa dos experimentos, das fêmeas superovuladas, 38 produziram 1092 embriões viáveis no estágio de 8-células que foram, de forma aleatória, divididos em quatro grupos experimentais: Grupo P1 – os embriões foram expostos a 15.7 MPa de N2 gasoso durante 2 horas e após cultivados in vitro até alcançar o estádio de blastocisto; Grupo P2 – os embriões foram tratados de maneira idêntica aos do Grupo P1, sendo expostos aos 15.7 MPa de N2 gasoso durante 4 horas; Grupo controle CE - os embriões foram submetidos ao cultivo in vitro imediatamente após a coleta; Grupo controle CB: os embriões foram mantidos em temperatura ambiente (22 ºC) durante 4 horas e após colocados na estufa para o cultivo in vitro. Na segunda etapa, amostras dos embriões dos quatro grupos experimentais tiveram a expressão gênica determinada com auxílio da amplificação e determinação quantitativa do mRNA (“Real Time PCR”). Os resultados do desenvolvimento embrionário ao estágio de blastocisto na primeira etapa foram os seguintes: Grupo P1 – 96,4% (245/253); Grupo P2 – 94,0% (253/269); Grupo CE – 95,0% (249/262) e Grupo CB – 95,4 (249/261). Na segunda etapa dos experimentos os resultados de reexpansão dos blastocistos após a criopreservação foram: Grupo P1 – 86,3% (63/73); Grupo P2 – 80,0 (76/95); Grupo CE – 72,8 (67/92); Grupo CB – 83,6 (92/110). A análise da expressão da maioria dos genes não revelou diferenças entre os grupos experimentais, provavelmente devido à variação biológica dos embriões entre os grupos e dentro de um mesmo grupo. A exposição dos embriões no estágio de 8-células a 15.7 MPa de N2 gasoso não comprometeu a viabilidade in vitro para desenvolverem-se ao estágio de blastocisto. As taxas de sobrevivência dos blastocistos à criopreservação diferiram somente entre os grupos de embriões expostos à HGP durante 2 horas (P1) no estágio de 8-células (86,3%) e o grupo de embriões submetidos ao cultivo in vitro (CE) (72,8%). Os resultados dos experimentos revelaram que a HGP pode ser empregada na indução de estresse celular subletal em embriões murinos. / The first objective of the experiments was to determine the development rates of mouse embryos exposed to high gaseous pressure (HGP – 15.7 MPa gaseous N2) at 8-cell stage for 2 or 4 hours. Second, determine the blastocyst re-expansion rates after cryopreservation. Third, determine the relative expression of BAX, Bcl2, GLUT1, GLUT3, IGF1, IGF2, IGF1-R, IGF2-R, SOD2, HSP70.1, AQP3 and PPIA in the following experimental steps: immediately after collection of 8-cell stage embryos, at the blastocyst stage before and after freezing. Fourteen males and 60 females Mus musculus domesticus were used in six experiment replications. Thirty-eight (63%) from the 60 superovulated, females produced 1092 viable embryos. These 8-cell stage embryos were then randomly divided into four experimental groups: P1 group – embryos were first exposed to 15.7 MPa of gaseous N2 for 2 hours and after cultured in vitro until the blastocyst stage; P2 group - embryos were treated identically to the P1 group, but were exposed to 15.7 MPa of gaseous N2 for 4 hours; CE control group - embryos were submitted to in vitro culture immediately after collection; CB control group - embryos were maintained at room temperature (22ºC) for 4 hours and after cultured in vitro. The results of embryo in vitro development to the blastocyst stage were: P1 Group- 96.4% (245/253); P2 group- 94.0% (253/269); CE group- 95.0% (249/262) and CB- 95.4 (249/261). After cryopreservation the blastocyst re-expansion rates were: P1 group- 86.3 % (63/73); P2 group- 80.0 (76/95); CE group – 72.8 (67/92), CB group- 83.6 (92/110). No major differences in gene expression were observed among treatment groups for most genes analyzed in this study, likely due to the biological variability in groups of embryos within each group. Exposure of embryos at 8-cells stage to 15.7 MPa of gaseous N2 did not compromise in vitro embryo viability to reach the blastocyst stage. The survival rates of blastocysts to cryopreservation differ only among the embryos that were exposed to the HGP during 2 hours at 8-cell stage (86,3 %) and the 8-cell stage embryos that were submitted to the in vitro culture immediately after collection (72,8 %). The experimental results showed that HGP can be used to induce sublethal cell stress in murine embryos.

Os objetivos dos experimentos foram primeiro determinar as taxas de desenvolvimento in vitro de embriões murinos no estágio de 8-células expostos a 15.7 MPa de N2 durante 2 ou 4 horas. Segundo, determinar as taxas de sobrevivência embrionária à crioconservação dos blastocistos originados a partir do cultivo dos embriões de 8-células após a indução do estresse subletal celular com o auxílio da pressão gasosa. Terceiro, determinar a expressão dos genes BAX, Bcl2, GLUT1, GLUT3, IGF1, IGF2, IGF1-R, IGF2-R, SOD2, HSP70.1, AQP3 e PPIA nas seguintes etapas experimentais: no estágio de 8-células imediatamente após a coleta dos embriões; no estágio de blastocisto antes e após o congelamento. Nas seis replicações realizadas foram utilizados 14 machos e 60 fêmeas Mus musculus domesticus. Na primeira etapa dos experimentos, das fêmeas superovuladas, 38 produziram 1092 embriões viáveis no estágio de 8-células que foram, de forma aleatória, divididos em quatro grupos experimentais: Grupo P1 – os embriões foram expostos a 15.7 MPa de N2 gasoso durante 2 horas e após cultivados in vitro até alcançar o estádio de blastocisto; Grupo P2 – os embriões foram tratados de maneira idêntica aos do Grupo P1, sendo expostos aos 15.7 MPa de N2 gasoso durante 4 horas; Grupo controle CE - os embriões foram submetidos ao cultivo in vitro imediatamente após a coleta; Grupo controle CB: os embriões foram mantidos em temperatura ambiente (22 ºC) durante 4 horas e após colocados na estufa para o cultivo in vitro. Na segunda etapa, amostras dos embriões dos quatro grupos experimentais tiveram a expressão gênica determinada com auxílio da amplificação e determinação quantitativa do mRNA (“Real Time PCR”). Os resultados do desenvolvimento embrionário ao estágio de blastocisto na primeira etapa foram os seguintes: Grupo P1 – 96,4% (245/253); Grupo P2 – 94,0% (253/269); Grupo CE – 95,0% (249/262) e Grupo CB – 95,4 (249/261). Na segunda etapa dos experimentos os resultados de reexpansão dos blastocistos após a criopreservação foram: Grupo P1 – 86,3% (63/73); Grupo P2 – 80,0 (76/95); Grupo CE – 72,8 (67/92); Grupo CB – 83,6 (92/110). A análise da expressão da maioria dos genes não revelou diferenças entre os grupos experimentais, provavelmente devido à variação biológica dos embriões entre os grupos e dentro de um mesmo grupo. A exposição dos embriões no estágio de 8-células a 15.7 MPa de N2 gasoso não comprometeu a viabilidade in vitro para desenvolverem-se ao estágio de blastocisto. As taxas de sobrevivência dos blastocistos à criopreservação diferiram somente entre os grupos de embriões expostos à HGP durante 2 horas (P1) no estágio de 8-células (86,3%) e o grupo de embriões submetidos ao cultivo in vitro (CE) (72,8%). Os resultados dos experimentos revelaram que a HGP pode ser empregada na indução de estresse celular subletal em embriões murinos. / The first objective of the experiments was to determine the development rates of mouse embryos exposed to high gaseous pressure (HGP – 15.7 MPa gaseous N2) at 8-cell stage for 2 or 4 hours. Second, determine the blastocyst re-expansion rates after cryopreservation. Third, determine the relative expression of BAX, Bcl2, GLUT1, GLUT3, IGF1, IGF2, IGF1-R, IGF2-R, SOD2, HSP70.1, AQP3 and PPIA in the following experimental steps: immediately after collection of 8-cell stage embryos, at the blastocyst stage before and after freezing. Fourteen males and 60 females Mus musculus domesticus were used in six experiment replications. Thirty-eight (63%) from the 60 superovulated, females produced 1092 viable embryos. These 8-cell stage embryos were then randomly divided into four experimental groups: P1 group – embryos were first exposed to 15.7 MPa of gaseous N2 for 2 hours and after cultured in vitro until the blastocyst stage; P2 group - embryos were treated identically to the P1 group, but were exposed to 15.7 MPa of gaseous N2 for 4 hours; CE control group - embryos were submitted to in vitro culture immediately after collection; CB control group - embryos were maintained at room temperature (22ºC) for 4 hours and after cultured in vitro. The results of embryo in vitro development to the blastocyst stage were: P1 Group- 96.4% (245/253); P2 group- 94.0% (253/269); CE group- 95.0% (249/262) and CB- 95.4 (249/261). After cryopreservation the blastocyst re-expansion rates were: P1 group- 86.3 % (63/73); P2 group- 80.0 (76/95); CE group – 72.8 (67/92), CB group- 83.6 (92/110). No major differences in gene expression were observed among treatment groups for most genes analyzed in this study, likely due to the biological variability in groups of embryos within each group. Exposure of embryos at 8-cells stage to 15.7 MPa of gaseous N2 did not compromise in vitro embryo viability to reach the blastocyst stage. The survival rates of blastocysts to cryopreservation differ only among the embryos that were exposed to the HGP during 2 hours at 8-cell stage (86,3 %) and the 8-cell stage embryos that were submitted to the in vitro culture immediately after collection (72,8 %). The experimental results showed that HGP can be used to induce sublethal cell stress in murine embryos.

Os objetivos dos experimentos foram primeiro determinar as taxas de desenvolvimento in vitro de embriões murinos no estágio de 8-células expostos a 15.7 MPa de N2 durante 2 ou 4 horas. Segundo, determinar as taxas de sobrevivência embrionária à crioconservação dos blastocistos originados a partir do cultivo dos embriões de 8-células após a indução do estresse subletal celular com o auxílio da pressão gasosa. Terceiro, determinar a expressão dos genes BAX, Bcl2, GLUT1, GLUT3, IGF1, IGF2, IGF1-R, IGF2-R, SOD2, HSP70.1, AQP3 e PPIA nas seguintes etapas experimentais: no estágio de 8-células imediatamente após a coleta dos embriões; no estágio de blastocisto antes e após o congelamento. Nas seis replicações realizadas foram utilizados 14 machos e 60 fêmeas Mus musculus domesticus. Na primeira etapa dos experimentos, das fêmeas superovuladas, 38 produziram 1092 embriões viáveis no estágio de 8-células que foram, de forma aleatória, divididos em quatro grupos experimentais: Grupo P1 – os embriões foram expostos a 15.7 MPa de N2 gasoso durante 2 horas e após cultivados in vitro até alcançar o estádio de blastocisto; Grupo P2 – os embriões foram tratados de maneira idêntica aos do Grupo P1, sendo expostos aos 15.7 MPa de N2 gasoso durante 4 horas; Grupo controle CE - os embriões foram submetidos ao cultivo in vitro imediatamente após a coleta; Grupo controle CB: os embriões foram mantidos em temperatura ambiente (22 ºC) durante 4 horas e após colocados na estufa para o cultivo in vitro. Na segunda etapa, amostras dos embriões dos quatro grupos experimentais tiveram a expressão gênica determinada com auxílio da amplificação e determinação quantitativa do mRNA (“Real Time PCR”). Os resultados do desenvolvimento embrionário ao estágio de blastocisto na primeira etapa foram os seguintes: Grupo P1 – 96,4% (245/253); Grupo P2 – 94,0% (253/269); Grupo CE – 95,0% (249/262) e Grupo CB – 95,4 (249/261). Na segunda etapa dos experimentos os resultados de reexpansão dos blastocistos após a criopreservação foram: Grupo P1 – 86,3% (63/73); Grupo P2 – 80,0 (76/95); Grupo CE – 72,8 (67/92); Grupo CB – 83,6 (92/110). A análise da expressão da maioria dos genes não revelou diferenças entre os grupos experimentais, provavelmente devido à variação biológica dos embriões entre os grupos e dentro de um mesmo grupo. A exposição dos embriões no estágio de 8-células a 15.7 MPa de N2 gasoso não comprometeu a viabilidade in vitro para desenvolverem-se ao estágio de blastocisto. As taxas de sobrevivência dos blastocistos à criopreservação diferiram somente entre os grupos de embriões expostos à HGP durante 2 horas (P1) no estágio de 8-células (86,3%) e o grupo de embriões submetidos ao cultivo in vitro (CE) (72,8%). Os resultados dos experimentos revelaram que a HGP pode ser empregada na indução de estresse celular subletal em embriões murinos. / The first objective of the experiments was to determine the development rates of mouse embryos exposed to high gaseous pressure (HGP – 15.7 MPa gaseous N2) at 8-cell stage for 2 or 4 hours. Second, determine the blastocyst re-expansion rates after cryopreservation. Third, determine the relative expression of BAX, Bcl2, GLUT1, GLUT3, IGF1, IGF2, IGF1-R, IGF2-R, SOD2, HSP70.1, AQP3 and PPIA in the following experimental steps: immediately after collection of 8-cell stage embryos, at the blastocyst stage before and after freezing. Fourteen males and 60 females Mus musculus domesticus were used in six experiment replications. Thirty-eight (63%) from the 60 superovulated, females produced 1092 viable embryos. These 8-cell stage embryos were then randomly divided into four experimental groups: P1 group – embryos were first exposed to 15.7 MPa of gaseous N2 for 2 hours and after cultured in vitro until the blastocyst stage; P2 group - embryos were treated identically to the P1 group, but were exposed to 15.7 MPa of gaseous N2 for 4 hours; CE control group - embryos were submitted to in vitro culture immediately after collection; CB control group - embryos were maintained at room temperature (22ºC) for 4 hours and after cultured in vitro. The results of embryo in vitro development to the blastocyst stage were: P1 Group- 96.4% (245/253); P2 group- 94.0% (253/269); CE group- 95.0% (249/262) and CB- 95.4 (249/261). After cryopreservation the blastocyst re-expansion rates were: P1 group- 86.3 % (63/73); P2 group- 80.0 (76/95); CE group – 72.8 (67/92), CB group- 83.6 (92/110). No major differences in gene expression were observed among treatment groups for most genes analyzed in this study, likely due to the biological variability in groups of embryos within each group. Exposure of embryos at 8-cells stage to 15.7 MPa of gaseous N2 did not compromise in vitro embryo viability to reach the blastocyst stage. The survival rates of blastocysts to cryopreservation differ only among the embryos that were exposed to the HGP during 2 hours at 8-cell stage (86,3 %) and the 8-cell stage embryos that were submitted to the in vitro culture immediately after collection (72,8 %). The experimental results showed that HGP can be used to induce sublethal cell stress in murine embryos.