Orientador: Lilia Freire Rodrigues de Souza Li / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas / Made available in DSpace on 2018-08-04T01:03:01Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Cardoso_KiaraCarolina_M.pdf: 5096959 bytes, checksum: 95490d441d98c8290277d5b6c7e125c3 (MD5) Previous issue date: 2004 / Resumo: Introdução: O receptor sensor de cálcio (CASR)pertence à famíliados receptores que acoplam à proteínaG e possui homologiacom a subfamíliados receptores metabotrópicos do glutamato.Ele é importante no processo de homeostase do cálcio,e quando a concentração de cálcio se eleva,ele inibe a secreção de paratonnônio pelas paratireóidese a reabsorção renal de cálcio. O receptor sensor de cálcio possui 1078 aminoácidos, com 612 aminoácidos no domínio extracelular (Em), 250 aminoácidos em sete regiões ttansmembrana (TM) conectadas com 3 alças extracelularese intracelularese uma longa cauda intracitoplasmática com 216 aminoácidos.A região ttansmembrana tem um papel fundamental na ativação do receptor e análise da distn"buiçãodas mutações ativadoras demonstra que a sua porção distal (IM 5, 6, 7 e alça extracelular 3) é a mais crítica no processo de ativação do receptor. O estudo de receptores mutados auxilia a elucidar a imponância da polaridade de detenninados aminoácidos presentes na região ttansmembrana na expressão do CASR A produção da proteína recombinante do domínio extracelulardo CASRproporciona novas expectativaspara uma análiseestruturaldesta regiãotão importante para a ligaçãocom o agonista. Objetivos: Os objetivos do presente estudo foram: 1-investigaro grau de expressão de receptores mutados na região ttansmembrana. 2- Produzir a proteína recombinante do domínio extracelular do CASR em sistema de E.. Resultados e Conclusões: Nos resultados de análise da expressão, observamos que todos os receptores mutados e ttansfectados em células HEK 293 foram expressos, no entanto os receptores mutados nas posiçõesF806C,A824S,A835D e A843Tapresentaram diminuição na expressão quando comparados com o receptor nativo, sugerindo que a mutação de arninoácidoshidrofóbicos para hidrofílicosna porção transmembrana pode diminuir o grau de expressão do CASR Obtivemos alta produção da proteína recombinante correspondente ao domínio extracelular do CASR, entretanto não conseguimos quantidades suficientes de proteína solúveLdevido a fonnação de cOIposde inclusões.Isto sugere que o sistemade E. não é eficiente para produzir proteínas com estruturas mais complexas como o domínio extracelulardo receptor sensor de cálcio / Abstract: Introduction: The calcium sensrng receptor is a member of the G protein coupled receptor superlamily.It has homologyto the family3 of the metabotropic glutamatereceptor fami1y. It is impottant to the calcium homeostasis. When the extrncellular calcium concentration increase, the CASR inhibits P1H secretion in the parathyroid cel1sand the calcium reabsorption in the kidney.The structure of the CASRconsistSof 1078amino acids, and it is characterized bya large extracellulardomain (Em) with 612 amino acids residues, seven transmernbrane domains (fMDs) with 250 amino acids and a large intracellulartail of 216 amino acids. The 1M domain has fundamental imponance inthe receptor activation and analysisof the distribution of the activatIDgmutations showsthat its dista!portion (IM 5,6,7 and extrncellularthird loop) is the most critical region for receptor activation. Mutagenesis studies of the calcium sensing receptor willhelp the elucidationof the relevance of the amino acids polarityin the transmernbrane domain and the degree of its expression. The production of a recornbinant pIOtein of the extracellulardomain of the caleium sensing receptor will pIOvidenewperspectivesto the stru.ctUral analysisof this portion of the receptor. Objectives: The objectives of this thesis are: 1- To investigatethe expressionof the receptoIS with of mutations in the transmembrane domain. 2- To produce a recombinant protein of the extracellular domain of the receptOr in an E. coli system. Results and Conclusions: We demonstrated that ali mutant receptOISwere expressed in HEK 293 cel1s,however the mutant receptOISF806C, A824S,A835D and A843T showed reduced expression leveIscompared to the wild type. These resultSshowed that substitution of an hydrophobic tO an hydrophiJicamino acids in the transmembrane domain of the caleium sensingreceptor can impairthe receptor expression.Wewere able to produce the recombinant protein of the extracelullardomain of the CASR,however, very few amount were soluble due to the fonnation of inc1usionbodies. This suggeststhat the E.ali system is not suitable for the production of large scale protein of complex protein such as the extracellularportion of the CASR / Mestrado / Mestre em Farmacologia

Cryptococcus neoformans é um patógeno humano oportunista e uma das principais causas de infecções fúngicas relacionadas à óbitos, especialmente em pacientes imunocomprometidos. O processo de infecção inicia-se com a colonização do tecido pulmonar, e posteriormente a levedura se dissemina pela via hematogênica até alcançar o sistema nervoso central (SNC), provocando meningite. A fim de transmigrar e alcançar o SNC, as células fúngicas devem atravessar a barreira hematoencefálica (BHE). O estabelecimento adequado da doença é dependente de diferentes fatores de virulência como a cápsula polissacarídica, a capacidade de se desenvolver a 37 ºC, e outros fatores diretamente relacionados à transmigração como urease, fosfolipase B1 e ácido hialurônico sintase que são descritas como componentes essenciais para a habilidade de atravessar a BHE. O cálcio (Ca2+) é um segundo mensageiro celular que atua na via de sinalização da calcineurina. Essa via em C. neoformans é necessária e responsável pela virulência e adaptação no hospedeiro. Além disso, a regulação dos níveis intracelulares de Ca2+ é mediada pela ação de transportadores de cálcio como Pmc1 e Vcx1, os quais são foco de nossos estudos. Apesar de grandes avanços no entendimento dos mecanismos moleculares de infecção de C. neoformans, as opções terapêuticas ainda são escassas, por isso a elucidação de fatores que regulam a transmigração e a descoberta de novos alvos para fármacos é importante. Nesta dissertação foi demonstrado que os mutantes nulos para o transportador de cálcio Pmc1 (pmc1) e o duplo mutante pmc1vcx1 são avirulentos em um modelo murino de infecção sistêmica e incapazes de acessar o SNC. Além disto, a deleção do gene PMC1 causa alterações no perfil de expressão gênica da levedura, principalmente nas vias envolvidas com a transmigração e homeostase de Ca2+. Genes relacionados com a atividade de urease, e envolvidos com o mecanismo paracelular de transmigração tiveram alterações no seu perfil de expressão. Considerando os dados obtidos, é comprovada a participação do transportador Pmc1 no processo de transmigração através da BHE e para o estabelecimento adequado da doença criptococose. / Cryptococcus neoformans an opportunistic human pathogen, is the main cause of fungal infections related to death, especially in immunocompromised patients. The infection starts with the colonization of the lung tissue, thereafter the yeast disseminates hematogenously to reach the central nervous system (CNS), causing meningoencephalitis. In order to transmigrate to CNS the fungal cells must cross the blood brain barrier (BBB). For infection establishment, C. neoformans relies on virulence factors, such as polysaccharide capsule, the ability to grow at 37 ºC, and some factors directly related to transmigration. Enzymes as urease, phospholipase B and hyaluronic acid synthase are known as essential components to cross the BBB. The calcium (Ca2+) is a cellular second messenger that participates on calcineurin signaling pathway. This pathway in C. neoformans is crucial and responsible for virulence and host adaptation. Moreover, the regulation of Ca2+ intracellular levels is coordinated by Ca2+ transporters such as Pmc1 and Vcx1, which are the main foccus of our studies. Despite of many advances in understanding the molecular mechanisms of C. neoformans infection the available repertoire of antifungal drugs is still poor, therefore it is necessary to comprise the factors that regulate dissemination to CNS, and also unveil new targets for antifungal therapy. In the present study it was demonstrated through a murine model of systemic infection that the null mutants pmc1 and pmc1vcx1 are avirulent and unable to access the SNC. Besides, the disruption of PMC1 gene leads to alterations on the gene expression profile, mainly in pathways involved with transmigration and calcium homeostasis. Genes related to urease activity, and connected to paracellular mechanism of transmigration had alterations on their expression profile. Taken togheter the result shows the requirement of Pmc1 transporter to transmigration events through BBB and for proper cryptococcosis establishment.

As espécies reativas de oxigênio (ROS) são importantes moléculas sinalizadoras, ou mensageiros secundários, em uma complexa rede de sinalização, que em plantas, é fundamental para o desenvolvimento, e para a resposta a diferentes estímulos ambientais. Por outro lado, estas moléculas representam uma ameaça oxidativa à celula, e em altas concentrações podem danificar diferentes componentes celulares. Dessa forma, as vias de produção e eliminação de ROS devem ser finamente moduladas. Apesar destas vias terem sido amplamente estudadas, incontáveis aspectos ainda permanecem desconhecidos. Este trabalho objetivou estudar os mecanismos de geração e eliminação de ROS nas mitocôndrias e cloroplastos, e seus efeitos no desenvolvimento e na resposta de plantas ao estresse. Assim, foi demonstrado que a enzima succinato desidrogenase (SDH), correspondente ao complexo II da respiração, é um importante sítio de geração de ROS em células vegetais. Além disso, a manipulação da geração de ROS em organelas, como a mitocôndria e o cloroplasto, promoveu alterações claras no padrão de desenvolvimento e nas respostas de plantas a diferentes estresses. Enquanto a indução da geração mitocondrial de ROS via SDH inibiu o desenvolvimento e levou a ativação da expressão de genes de defesa. Por outro lado, alterações nas respostas antioxidantes no cloroplasto, via manipulação genética das ascorbato peroxidases cloroplastídicas (OsAPX7 e OsAPX8), embora tenham afetado em menor grau o desenvolvimento da planta, modularam os parâmetros fisiológicos e a resposta ao estresse. Desta forma, plantas de arroz silenciadas, ou nocaute, para a isoformas cloroplastídicas de APX apresentaram um padrão diferenciado de abertura estomática e tolerância ao estresse hídrico. Além disso, experimentos de monohíbrido permitiram a identificação dos fatores de trasncrição OsDST, OsABF7, Os11g28270 e OsVOZ1, como potenciais reguladores da expressão de OsAPX8. A complexidade das respostas induzidas por ROS indicam que estas possuem uma alta especificidade e dependem da localização subcelular e da atividade de cada um dos componentes dessa intricada rede de sinalização, assim como o nível de expressão de cada um deles. O conjunto dos resultados obtidos amplia a visão do papel das ROS no desenvolvimento vegetal e nos mecanismos de respostas de plantas a estímulos ambientais geradores de estresse oxidativo. / The reactive oxygen species (ROS) are important signaling molecules, or secondary messengers, involved in a complex signaling network, which, in plants, is essential for development, and different environmental stimuli responses. Moreover, these molecules represent an oxidative risk to the cell, and at high concentrations may damage various cellular components. Thus, the ROS production and elimination routes should be finely regulated. Although these pathways have been extensively studied, many aspects remain unknown. Here we investigated the mechanisms of generation and elimination of ROS in mitochondria and chloroplasts, and its effects in plant development and stress responses. The results demonstrated that the enzyme succinate dehydrogenase, which corresponds to the mitochondrial complex II, is an important site of ROS production in plant cells. In addition, the control of ROS production in cellular organelles, such as mitochondria and chloroplast, promotes changes in development patterns and in plant stress response. While the induction of mitochondrial ROS production by SDH inhibit the development and activated defense genes expression, changes in chloroplast antioxidant response, by genetic manipulation of chloroplastic ascorbate peroxidases (OsAPX7 e OsAPX8), modulates physiologic parameters and stress response, despite inducing lower changes related to plant development. In this way, rice plants silenced or knockout for chloroplastic isoforms of APX showed a differential stomata opening pattern and drought stress tolerance. In addition, one-hybrid experiments, allowed the identification of the transcription factors OsDST, OsABF7, Os11g28270 e OsVOZ1, as potential regulators of the OsAPX8 expression. The complexity of the responses induced by ROS indicates that these mechanisms have a high specificity and is dependent of the subcelullar location, their activity, and the expression of each one of the components of this signaling network. The results obtained expands our vision of the role of ROS in plant development and in plant responses to environmental stimuli related to oxidative stress.

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:35:46Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2010-08-12Bitstream added on 2014-06-13T20:26:53Z : No. of bitstreams: 1 blanch_gt_dr_arafo.pdf: 1786222 bytes, checksum: ad1e37adb10eabe9c9ee8dd690c60759 (MD5) / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) / O sistema nervoso central (SNC) tem um papel fundamental na regulação de mecanismos que controlam a osmolaridade dos líquidos corporais. O núcleo do trato solitário (NTS) é o sítio primário das aferências cardiovasculares e de osmorreceptores periféricos e se projeta à áreas prosencefálicas envolvidas com a regulação cardiovascular e do equilíbrio hidroeletrolítico. Demonstramos anteriormente que animais com lesão da porção comissural do NTS (commNTS) tem maior ingestão de água, natriurese e resposta pressora frente a sobrecarga intragástrica (ig) de NaCl 2 M. Os mecanismos responsáveis por estas alterações ainda não foram determinados. Uma vez que o estímulo com NaCl 2 M ig (2 ml) ativa osmorreceptores centrais e periféricos, não sabemos até o momento os efeitos da lesão do commNTS sobre as respostas observadas após a estimulação específica de osmorreceptores periféricos, que pode ser feita com NaCl 0,6 M ig. (2 ml). Desta forma os nossos objetivos foram: a) estudar os mecanismos que medeiam o aumento da pressão arterial e da natriurese após a sobrecarga de NaCl 2 M em animais com lesão do commNTS; b) verificar as alterações na expressão da proteína c-Fos após NaCl 2 M ig em ratos com lesão fictícia (sham) ou lesão do commNTS; c) verificar as alterações na expressão gênica no PVN após NaCl 2 M ig, d) estudar os efeitos na pressão arterial, na ingestão de água e na excreção renal subseqüentes a administração de NaCl 0,6 M ig, bem como os mecanismos responsáveis pelas alterações, em ratos com lesão fictícia (sham) ou lesão do commNTS; e) verificar as alterações na expressão da proteína c-Fos após NaCl 0,6 M ig em ratos com lesão fictícia (sham) ou lesão do commNTS. Ratos Holtzman (280-320 g) foram utilizados. A lesão eletrolítica... / The central nervous system has an important role controlling the mechanisms involved in the regulation of body fluid osmolality. The nucleus of the solitary tract (NTS) is the primary site of cardiovascular and peripheral osmoreceptors afferents and projects to prosencephalic areas involved in hydroelectrolytic balance and cardiovascular regulation. We have demonstrated that commissural NTS (commNTS) lesioned rats had an increase in arterial pressure and a greater increase in water intake and natriuresis after 2 M NaCl intragastric (ig) load. The mechanisms involved in these responses are not known. Since 2 M NaCl ig (2 ml) activates central and peripheral osmoreceptors, it is not known the effects of the commNTS lesion on the responses induced only by the activation of the peripheral osmoreceptors, which can be done by 0.6 M NaCl (2 ml) ig. Thus, the aims of this study were: a) to study the mechanisms involved in the increase of the arterial pressure and natriuresis in commNTS lesioned rats after 2 M NaCl ig; b) to verify the changes in c-Fos expression after 2 M NaCl ig in sham and commNTS lesioned rats; c) to verify the changes in gene expression in PVN after 2 M NaCl ig in naïve rats; d) to study the effects on arterial pressure, water intake and renal excretion after 0.6 M NaCl, as well as, the mechanisms involved in these responses, in sham and in commNTS lesioned rats; e) to verify the changes in c-Fos expression after 0.6 M NaCl ig in sham and commNTS lesioned rats. Male Holtzman rats (280-320 g) were used. Electrolytic lesion of the commNTS and all experiments were be performed in chronic period of lesion (14 to 21 days. For the lesion, a partial craniotomy of the occipital bone was performed, and the dorsal surface of the brainstem was exposed. The electrolytic lesion was performed using... (Complete abstract click electronic access below)

As espécies reativas de oxigênio (ROS) são importantes moléculas sinalizadoras, ou mensageiros secundários, em uma complexa rede de sinalização, que em plantas, é fundamental para o desenvolvimento, e para a resposta a diferentes estímulos ambientais. Por outro lado, estas moléculas representam uma ameaça oxidativa à celula, e em altas concentrações podem danificar diferentes componentes celulares. Dessa forma, as vias de produção e eliminação de ROS devem ser finamente moduladas. Apesar destas vias terem sido amplamente estudadas, incontáveis aspectos ainda permanecem desconhecidos. Este trabalho objetivou estudar os mecanismos de geração e eliminação de ROS nas mitocôndrias e cloroplastos, e seus efeitos no desenvolvimento e na resposta de plantas ao estresse. Assim, foi demonstrado que a enzima succinato desidrogenase (SDH), correspondente ao complexo II da respiração, é um importante sítio de geração de ROS em células vegetais. Além disso, a manipulação da geração de ROS em organelas, como a mitocôndria e o cloroplasto, promoveu alterações claras no padrão de desenvolvimento e nas respostas de plantas a diferentes estresses. Enquanto a indução da geração mitocondrial de ROS via SDH inibiu o desenvolvimento e levou a ativação da expressão de genes de defesa. Por outro lado, alterações nas respostas antioxidantes no cloroplasto, via manipulação genética das ascorbato peroxidases cloroplastídicas (OsAPX7 e OsAPX8), embora tenham afetado em menor grau o desenvolvimento da planta, modularam os parâmetros fisiológicos e a resposta ao estresse. Desta forma, plantas de arroz silenciadas, ou nocaute, para a isoformas cloroplastídicas de APX apresentaram um padrão diferenciado de abertura estomática e tolerância ao estresse hídrico. Além disso, experimentos de monohíbrido permitiram a identificação dos fatores de trasncrição OsDST, OsABF7, Os11g28270 e OsVOZ1, como potenciais reguladores da expressão de OsAPX8. A complexidade das respostas induzidas por ROS indicam que estas possuem uma alta especificidade e dependem da localização subcelular e da atividade de cada um dos componentes dessa intricada rede de sinalização, assim como o nível de expressão de cada um deles. O conjunto dos resultados obtidos amplia a visão do papel das ROS no desenvolvimento vegetal e nos mecanismos de respostas de plantas a estímulos ambientais geradores de estresse oxidativo. / The reactive oxygen species (ROS) are important signaling molecules, or secondary messengers, involved in a complex signaling network, which, in plants, is essential for development, and different environmental stimuli responses. Moreover, these molecules represent an oxidative risk to the cell, and at high concentrations may damage various cellular components. Thus, the ROS production and elimination routes should be finely regulated. Although these pathways have been extensively studied, many aspects remain unknown. Here we investigated the mechanisms of generation and elimination of ROS in mitochondria and chloroplasts, and its effects in plant development and stress responses. The results demonstrated that the enzyme succinate dehydrogenase, which corresponds to the mitochondrial complex II, is an important site of ROS production in plant cells. In addition, the control of ROS production in cellular organelles, such as mitochondria and chloroplast, promotes changes in development patterns and in plant stress response. While the induction of mitochondrial ROS production by SDH inhibit the development and activated defense genes expression, changes in chloroplast antioxidant response, by genetic manipulation of chloroplastic ascorbate peroxidases (OsAPX7 e OsAPX8), modulates physiologic parameters and stress response, despite inducing lower changes related to plant development. In this way, rice plants silenced or knockout for chloroplastic isoforms of APX showed a differential stomata opening pattern and drought stress tolerance. In addition, one-hybrid experiments, allowed the identification of the transcription factors OsDST, OsABF7, Os11g28270 e OsVOZ1, as potential regulators of the OsAPX8 expression. The complexity of the responses induced by ROS indicates that these mechanisms have a high specificity and is dependent of the subcelullar location, their activity, and the expression of each one of the components of this signaling network. The results obtained expands our vision of the role of ROS in plant development and in plant responses to environmental stimuli related to oxidative stress.

Cryptococcus neoformans é um patógeno humano oportunista e uma das principais causas de infecções fúngicas relacionadas à óbitos, especialmente em pacientes imunocomprometidos. O processo de infecção inicia-se com a colonização do tecido pulmonar, e posteriormente a levedura se dissemina pela via hematogênica até alcançar o sistema nervoso central (SNC), provocando meningite. A fim de transmigrar e alcançar o SNC, as células fúngicas devem atravessar a barreira hematoencefálica (BHE). O estabelecimento adequado da doença é dependente de diferentes fatores de virulência como a cápsula polissacarídica, a capacidade de se desenvolver a 37 ºC, e outros fatores diretamente relacionados à transmigração como urease, fosfolipase B1 e ácido hialurônico sintase que são descritas como componentes essenciais para a habilidade de atravessar a BHE. O cálcio (Ca2+) é um segundo mensageiro celular que atua na via de sinalização da calcineurina. Essa via em C. neoformans é necessária e responsável pela virulência e adaptação no hospedeiro. Além disso, a regulação dos níveis intracelulares de Ca2+ é mediada pela ação de transportadores de cálcio como Pmc1 e Vcx1, os quais são foco de nossos estudos. Apesar de grandes avanços no entendimento dos mecanismos moleculares de infecção de C. neoformans, as opções terapêuticas ainda são escassas, por isso a elucidação de fatores que regulam a transmigração e a descoberta de novos alvos para fármacos é importante. Nesta dissertação foi demonstrado que os mutantes nulos para o transportador de cálcio Pmc1 (pmc1) e o duplo mutante pmc1vcx1 são avirulentos em um modelo murino de infecção sistêmica e incapazes de acessar o SNC. Além disto, a deleção do gene PMC1 causa alterações no perfil de expressão gênica da levedura, principalmente nas vias envolvidas com a transmigração e homeostase de Ca2+. Genes relacionados com a atividade de urease, e envolvidos com o mecanismo paracelular de transmigração tiveram alterações no seu perfil de expressão. Considerando os dados obtidos, é comprovada a participação do transportador Pmc1 no processo de transmigração através da BHE e para o estabelecimento adequado da doença criptococose. / Cryptococcus neoformans an opportunistic human pathogen, is the main cause of fungal infections related to death, especially in immunocompromised patients. The infection starts with the colonization of the lung tissue, thereafter the yeast disseminates hematogenously to reach the central nervous system (CNS), causing meningoencephalitis. In order to transmigrate to CNS the fungal cells must cross the blood brain barrier (BBB). For infection establishment, C. neoformans relies on virulence factors, such as polysaccharide capsule, the ability to grow at 37 ºC, and some factors directly related to transmigration. Enzymes as urease, phospholipase B and hyaluronic acid synthase are known as essential components to cross the BBB. The calcium (Ca2+) is a cellular second messenger that participates on calcineurin signaling pathway. This pathway in C. neoformans is crucial and responsible for virulence and host adaptation. Moreover, the regulation of Ca2+ intracellular levels is coordinated by Ca2+ transporters such as Pmc1 and Vcx1, which are the main foccus of our studies. Despite of many advances in understanding the molecular mechanisms of C. neoformans infection the available repertoire of antifungal drugs is still poor, therefore it is necessary to comprise the factors that regulate dissemination to CNS, and also unveil new targets for antifungal therapy. In the present study it was demonstrated through a murine model of systemic infection that the null mutants pmc1 and pmc1vcx1 are avirulent and unable to access the SNC. Besides, the disruption of PMC1 gene leads to alterations on the gene expression profile, mainly in pathways involved with transmigration and calcium homeostasis. Genes related to urease activity, and connected to paracellular mechanism of transmigration had alterations on their expression profile. Taken togheter the result shows the requirement of Pmc1 transporter to transmigration events through BBB and for proper cryptococcosis establishment.

As espécies reativas de oxigênio (ROS) são importantes moléculas sinalizadoras, ou mensageiros secundários, em uma complexa rede de sinalização, que em plantas, é fundamental para o desenvolvimento, e para a resposta a diferentes estímulos ambientais. Por outro lado, estas moléculas representam uma ameaça oxidativa à celula, e em altas concentrações podem danificar diferentes componentes celulares. Dessa forma, as vias de produção e eliminação de ROS devem ser finamente moduladas. Apesar destas vias terem sido amplamente estudadas, incontáveis aspectos ainda permanecem desconhecidos. Este trabalho objetivou estudar os mecanismos de geração e eliminação de ROS nas mitocôndrias e cloroplastos, e seus efeitos no desenvolvimento e na resposta de plantas ao estresse. Assim, foi demonstrado que a enzima succinato desidrogenase (SDH), correspondente ao complexo II da respiração, é um importante sítio de geração de ROS em células vegetais. Além disso, a manipulação da geração de ROS em organelas, como a mitocôndria e o cloroplasto, promoveu alterações claras no padrão de desenvolvimento e nas respostas de plantas a diferentes estresses. Enquanto a indução da geração mitocondrial de ROS via SDH inibiu o desenvolvimento e levou a ativação da expressão de genes de defesa. Por outro lado, alterações nas respostas antioxidantes no cloroplasto, via manipulação genética das ascorbato peroxidases cloroplastídicas (OsAPX7 e OsAPX8), embora tenham afetado em menor grau o desenvolvimento da planta, modularam os parâmetros fisiológicos e a resposta ao estresse. Desta forma, plantas de arroz silenciadas, ou nocaute, para a isoformas cloroplastídicas de APX apresentaram um padrão diferenciado de abertura estomática e tolerância ao estresse hídrico. Além disso, experimentos de monohíbrido permitiram a identificação dos fatores de trasncrição OsDST, OsABF7, Os11g28270 e OsVOZ1, como potenciais reguladores da expressão de OsAPX8. A complexidade das respostas induzidas por ROS indicam que estas possuem uma alta especificidade e dependem da localização subcelular e da atividade de cada um dos componentes dessa intricada rede de sinalização, assim como o nível de expressão de cada um deles. O conjunto dos resultados obtidos amplia a visão do papel das ROS no desenvolvimento vegetal e nos mecanismos de respostas de plantas a estímulos ambientais geradores de estresse oxidativo. / The reactive oxygen species (ROS) are important signaling molecules, or secondary messengers, involved in a complex signaling network, which, in plants, is essential for development, and different environmental stimuli responses. Moreover, these molecules represent an oxidative risk to the cell, and at high concentrations may damage various cellular components. Thus, the ROS production and elimination routes should be finely regulated. Although these pathways have been extensively studied, many aspects remain unknown. Here we investigated the mechanisms of generation and elimination of ROS in mitochondria and chloroplasts, and its effects in plant development and stress responses. The results demonstrated that the enzyme succinate dehydrogenase, which corresponds to the mitochondrial complex II, is an important site of ROS production in plant cells. In addition, the control of ROS production in cellular organelles, such as mitochondria and chloroplast, promotes changes in development patterns and in plant stress response. While the induction of mitochondrial ROS production by SDH inhibit the development and activated defense genes expression, changes in chloroplast antioxidant response, by genetic manipulation of chloroplastic ascorbate peroxidases (OsAPX7 e OsAPX8), modulates physiologic parameters and stress response, despite inducing lower changes related to plant development. In this way, rice plants silenced or knockout for chloroplastic isoforms of APX showed a differential stomata opening pattern and drought stress tolerance. In addition, one-hybrid experiments, allowed the identification of the transcription factors OsDST, OsABF7, Os11g28270 e OsVOZ1, as potential regulators of the OsAPX8 expression. The complexity of the responses induced by ROS indicates that these mechanisms have a high specificity and is dependent of the subcelullar location, their activity, and the expression of each one of the components of this signaling network. The results obtained expands our vision of the role of ROS in plant development and in plant responses to environmental stimuli related to oxidative stress.

Cryptococcus neoformans é um patógeno humano oportunista e uma das principais causas de infecções fúngicas relacionadas à óbitos, especialmente em pacientes imunocomprometidos. O processo de infecção inicia-se com a colonização do tecido pulmonar, e posteriormente a levedura se dissemina pela via hematogênica até alcançar o sistema nervoso central (SNC), provocando meningite. A fim de transmigrar e alcançar o SNC, as células fúngicas devem atravessar a barreira hematoencefálica (BHE). O estabelecimento adequado da doença é dependente de diferentes fatores de virulência como a cápsula polissacarídica, a capacidade de se desenvolver a 37 ºC, e outros fatores diretamente relacionados à transmigração como urease, fosfolipase B1 e ácido hialurônico sintase que são descritas como componentes essenciais para a habilidade de atravessar a BHE. O cálcio (Ca2+) é um segundo mensageiro celular que atua na via de sinalização da calcineurina. Essa via em C. neoformans é necessária e responsável pela virulência e adaptação no hospedeiro. Além disso, a regulação dos níveis intracelulares de Ca2+ é mediada pela ação de transportadores de cálcio como Pmc1 e Vcx1, os quais são foco de nossos estudos. Apesar de grandes avanços no entendimento dos mecanismos moleculares de infecção de C. neoformans, as opções terapêuticas ainda são escassas, por isso a elucidação de fatores que regulam a transmigração e a descoberta de novos alvos para fármacos é importante. Nesta dissertação foi demonstrado que os mutantes nulos para o transportador de cálcio Pmc1 (pmc1) e o duplo mutante pmc1vcx1 são avirulentos em um modelo murino de infecção sistêmica e incapazes de acessar o SNC. Além disto, a deleção do gene PMC1 causa alterações no perfil de expressão gênica da levedura, principalmente nas vias envolvidas com a transmigração e homeostase de Ca2+. Genes relacionados com a atividade de urease, e envolvidos com o mecanismo paracelular de transmigração tiveram alterações no seu perfil de expressão. Considerando os dados obtidos, é comprovada a participação do transportador Pmc1 no processo de transmigração através da BHE e para o estabelecimento adequado da doença criptococose. / Cryptococcus neoformans an opportunistic human pathogen, is the main cause of fungal infections related to death, especially in immunocompromised patients. The infection starts with the colonization of the lung tissue, thereafter the yeast disseminates hematogenously to reach the central nervous system (CNS), causing meningoencephalitis. In order to transmigrate to CNS the fungal cells must cross the blood brain barrier (BBB). For infection establishment, C. neoformans relies on virulence factors, such as polysaccharide capsule, the ability to grow at 37 ºC, and some factors directly related to transmigration. Enzymes as urease, phospholipase B and hyaluronic acid synthase are known as essential components to cross the BBB. The calcium (Ca2+) is a cellular second messenger that participates on calcineurin signaling pathway. This pathway in C. neoformans is crucial and responsible for virulence and host adaptation. Moreover, the regulation of Ca2+ intracellular levels is coordinated by Ca2+ transporters such as Pmc1 and Vcx1, which are the main foccus of our studies. Despite of many advances in understanding the molecular mechanisms of C. neoformans infection the available repertoire of antifungal drugs is still poor, therefore it is necessary to comprise the factors that regulate dissemination to CNS, and also unveil new targets for antifungal therapy. In the present study it was demonstrated through a murine model of systemic infection that the null mutants pmc1 and pmc1vcx1 are avirulent and unable to access the SNC. Besides, the disruption of PMC1 gene leads to alterations on the gene expression profile, mainly in pathways involved with transmigration and calcium homeostasis. Genes related to urease activity, and connected to paracellular mechanism of transmigration had alterations on their expression profile. Taken togheter the result shows the requirement of Pmc1 transporter to transmigration events through BBB and for proper cryptococcosis establishment.

Orientadores: Sebastião Araujo, Margaret de Castro / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas / Made available in DSpace on 2018-08-03T15:29:15Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Martins_EdnaFreitas_M.pdf: 4803103 bytes, checksum: 259532b5aa3ba675d8102e2c09f7a3de (MD5) Previous issue date: 2003 / Resumo: Objetivo. Avaliar os níveis séricos de vasopressina (AVP) em pacientes submetidos à cirurgia cardíaca com circulação extracorpórea (CC-CEC), não complicada, até o terceiro dia pós-operatório (pós-OP). Métodos. A A VP foi dosada por radioimunoensaio em amostras sangüíneas colhidas de 51 pacientes adultos, não consecutivos, não complicados, submetidos à CC-CEC não pulsátil, nos seguintes tempos: 12h pré-OP (t-12); 15min após a indução anestésica (tO); 5min pós-CEC (t1); 2h (t2) e 6h (t6) após o término da cirurgia; e manhãs do 10 (t24) , 20 (t48) e 30 (t72) dia pós-OP. Como controle, dosagens dos níveis basais de A VP foram realizadas em amostras sangüíneas colhidas pela manhã, em repouso, de 29 indivíduos adultos (21 a 45 anos), sadios, de ambos os sexos (17M e 12F). Resultados. A idade média dos pacientes foi de 47,6 :f: 13,9 anos (21 a 73 anos), sendo 30 homens e 21 mulheres. Os tipos de cirurgias realizadas foram: revascularização miocárdica em 16 (31%) pacientes, troca valvar em 25 (49%) e outros em 10 (20%). Os níveis séricos de AVP [média :f: DP pg/ml; (min -max) foram baixos e dentro da faixa de normalidade nos tempos t-12 [2,4 :f: 1,7 (0,58 - 10,4); controle] e tO [2,0 :f: 1,8 (0,125 - 8,7); P = 0,19], mostrando uma dramática elevação logo após a CEC [t1: 151,3 :f: 125,5 (7,1 - 615,0); P < 0,0001], tendendo posteriormente à queda, porém com valores ainda superiores ao período basal até o 30 PO [t72: 3,5 :f: 1,7 (0,8 - 8,0); P = 0,0004]. Os valores da AVP sérica (média :f: DP) nos voluntários sadios foram de 2,22 :f: 1, 15pg/ml (0,4 a 5,2). Conclusão. Em pacientes que evoluem sem complicações, os níveis séricos de A VP mantêm-se elevados até o 30 dia PO após CC-CEC, sugerindo, como tem sido descrito por diversos autores recentemente, que este hormônio tenha um importante papel na manutenção da estabilidade hemodinâmica e/ou homeostática nesta condição clínica / Abstract: Objective. To evaluate plasma vasopressin (A VP) levels in patients undergoing uncomplicated cardiopulmonary bypass open heart surgery (CPB-OHS) until the 3rd post-operative (post-OP) day. Methods. Plasma AVP concentration was measured by radioimmunoassay in 51 non-consecutive adult patients undergoing uncomplicated non-pulsatile CPB-OHS at the following moments: 12h pre-OP (t-12); 15min after anaesthetic induction (tO); 5min post-CPB (t1); 2h (t2) and 6h (t6) after ending surgery; and by the morning at the 1st (t24) , 2nd (t48) and 3rd (t72) post-OP days. Basal plasma A VP was also measured in 29 healthy volunteer adults (21 to 45 years), both sexes (17M and 12F), to serve as controls. Results. Patients median age was 47.6:t 13.9 years (ranging 21 to 73 years), with 30 males and 21 females. The types of surgical procedures were: coronary artery bypass grafting in 16 (31 %) patients, valvular heart surgery in 25 (49%) and others in 10 (20%). AVP plasma levels [median :t 5D pg/mL; (min - max)] were low and within the normal range at moments t-12 [2.4 :t 1.7 (0.58 - 10.4); control] and tO [2.0 :t 1.8 (0.125 - 8.7); P = 0.19], showing a dramatic increase just after CPB [t1: 151.3 :t 125.5 (7.1 - 615.0); P < 0.0001], with a slow and progressive fali in the subsequent hours, but remaining over the normal range until the 3rd post-OP day [t72: 3.5 :t 1.7 (0.8 - 8.0); P = 0.0004]. Healthy volunteers' AVP plasma AVP levels (median :t SD) were 2.22 :t 1.15pg/mL (ranging 0.4 to 5.2). Conclusion. Plasma A VP levels remain elevated until the 3rd post-operative day in these uncomplicated patients undergoing non-pulsatile CPB-OHS, suggesting that this hormone may play an important role in the maintenance of hemodynamic and/or homeostatic stability in this clinical condition, as has been recently reported by many authors / Mestrado / Medicina Interna / Mestre em Ciências Médicas

Orientador: Ione Salgado Martins / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-07-23T19:28:37Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Souza_JoseFranciscode_M.pdf: 5635452 bytes, checksum: b9bb1fee866a1316197d55de23837520 (MD5) Previous issue date: 1998 / Resumo: Protoplastos isolados a partir de cultura de células de Citrus sinensis em suspensão foram utilizados como modelo experimental para o estudo do transporte e da homeostase de em células vegetais. Fluxos de 'Ca POT. 2¿ Foram acompanhados por observação das alterações de 'Ca POT. 2¿ livre do meio, utilizando se o indicador de 'Ca POT. 2¿ arsenazo III que é sensível a baixas concentrações desse íon. Alterações na concentração de Ca2+citoss61ico foram acompanhadas por microscopia confocal de fluorescência, utilizando-se o indicador de 'Ca POT. 2¿ fluorescente, indo-1. Protoplastos incubados na presença de 20 'mu¿M de 'Ca POT. 2¿ livre apresentaram-se praticamente inativos para a captação do íon, uma vez que a baixa concentração externa de 'Ca POT. 2¿ não foi suficiente para gerar um gradiente capaz de impulsionar a entrada do íon na celula. Entretanto, quando o 'Ca POT. 2¿ foi removido do meio por adição de EGTA , o efluxo de 'Ca POT. 2¿ foi estimulado por antagonistas de calmodulina como trifluoperazina (TFP), clorpromazina (CP) e calmidazolium, de uma maneira dose-dependente. A eficiência com que os diferentes antagonistas de calmodulina induziram o efluxo de Ca2+ em protoplastos de C. sinensis indicaram que este processo foi resultante de um efeito inespecífico na membrana dos protoplastos e não devido a uma ação anticalmodulina ...Observação: O resumo, na íntegra, poderá ser visualizado no texto completo da tese digital / Abstract: Isolated protoplasts from suspension-cultured Citrus sinensis cells were used as an experimental model for the study of the 'Ca POT. 2¿ transport and homeostasis in plant cells. 'Ca POT. 2¿ fluxes were accompanied through the medium free 'Ca POT. 2¿ alterations using the 'Ca POT. 2¿ indicator arsenazo III that is sensitive to low concentrations of that ion. Citosolic free 'Ca POT. 2¿ concentration changes were accompanied through fluorescence confocal microscopy, using the fluorescent 'Ca POT. 2¿ indicator, indo-1. In the presence of 20¿mu¿M free 'Ca POT. 2¿ protoplasts were practically inactive for the uptake of that ion, since the low external 'Ca POT. 2¿ concentration did not generate a enough gradient able to impel the entrance of the ion inside of the cell. However, when 'Ca POT. 2¿ was removed from the medium through the EGTA addition, the 'Ca POT. 2¿ efflux was stimulated by calmodulin antagonists such as trifluoperazin (TFP), chlorpromazin (CP) and calmidazolium, in a dose-dependent manner. The efficiency in which the different calmodulin antagonists induced the 'Ca POT. 2¿ efflux from the C. sinensis protoplasts indicated that this process resulted from an unspecific effect in the protoplast membrane and not due to an anti-calmodulin action ...Note: The complete abstract is available with the full electronic digital thesis or dissertations / Mestrado / Biologia Vegetal / Mestre em Ciências Biológicas