faculty of Science School of Molecular and Cell Biology 9605145v vhaakuria@yahoo.co.uk / Cassava is a food crop planted in many countries in Africa. Its tubers are a major source of food and are processed to produce a variety of food products, one of which is the fermented product called gari. This research report aimed to evaluate the performance of three lactic acid bacteria for several properties with regard to the fermentation of cassava to produce gari. Three organisms were used for the evaluation, namely Lactobacillus plantarum, Lactobacillus fermentum and Leuconostoc mesenteroides. The organisms were evaluated for viability, biomass formation and glucose utilisation in static flasks, biomass formation and glucose utilisation in 2 L fermenters, cell viability after dehydration processes and pH and cyanide reduction in cassava substrate. In static flasks, the organisms were found to retain above 80% cell viability after cryopreservation. Maximum biomass of 108 cells/ml was formed within the first 12 hours by all the organisms. While L. fermentum, depleted glucose within 24 hours, L. plantarum formed the highest biomass of 4 x 108 cells/ml. In 2 L Braunstat B fermenters, a cell count of 109 cells/ml was obtained by L. fermentum and Leuconostoc mesenteroides within 12-15 hours. Biomass formation for L. plantarum during the same period was 1010 cells/ml. Glucose was depleted within 12 - 15 hours. The viability of cells between the dehydration processes of centrifugation, glycerol and maltodextrin addition and lyophilisation, was above 80% for all the organisms. However, this high cell viability was influenced by concentration of cells during the centrifugation step. In cassava substrate, L. fermentum, though heterofermentative, was found to be particularly acid tolerant and reduced pH to 3.98. All the organisms were able to retain good viability after lyophilisation. However, the results of cyanide reduction were inconclusive. These results show that while cultures show promise for pilot scale studies of starter culture development, further cyanide experiments need to be conducted, and synergy between the organisms investigated.

As características do processo industrial brasileiro para a produção do bioetanol tornam as destilarias susceptíveis a presença de microrganismos contaminantes que ocasionam na queda de rendimento de produção. Dentre as etapas do processo, tem-se a fermentação alcoólica, que consiste na metabolização de açúcares pela cepa de levedura selecionada da espécie Saccharomyces cerevisiae produzindo o etanol. Nesta etapa ocorre a contaminação por leveduras do gênero Saccharomyces, leveduras não Saccharomyces e bactérias. As bactérias mais encontradas são as pertencentes ao grupo das bactérias láticas (LAB), que por utilizarem diferentes vias para metabolizar os açúcares, são classificadas em heterofermentativa obrigatória, homofermentativa obrigatória e heterofermentativa facultativa. Entre os gêneros deste grupo, os Lactobacillus são os mais comuns devido à sua habilidade em tolerar altas concentrações de etanol e açúcares, altas temperaturas e baixo pH. As espécies L. fermentum e L. plantarum foram relatadas em diversos trabalhos como entre as espécies mais encontradas contaminando esse ambiente. Os Lactobacillus contaminantes estão em constante interação com a cepa de levedura que por consequência, tem sua eficiência fermentativa reduzida. Este trabalho teve por objetivo analisar os metabólitos produzidos durante a fermentação alcoólica industrial e que podem ser utilizados pelas bactérias contaminantes, obtendo assim, condições para serem competitivas e persistentes no processo. Para isso, foram utilizadas duas linhagens, isoladas de destilaria e identificadas como L. fermentum (I3a) com metabolismo heterofermentativo obrigatório e L. plantarum (I4a) com metabolismo heterofermentativo facultativo, apresentando nas condições estudadas um metabolismo homofermentativo. Ambas as linhagens foram submetidas ao crescimento na presença do glicerol, malato e piruvato, que são metabólitos produzidos e excretados pela levedura e o manitol produzido e excretado pela bactéria heterofermentativa obrigatória. Foi observado que o metabólito manitol é uma eficiente fonte de carbono para ambas as linhagens proporcionando crescimento mesmo sem a presença de açúcares. Além disso, a combinação entre glicose, frutose, manitol e malato foi capaz de aumentar o crescimento das linhagens. Já a presença do piruvato, apresentou estímulo de crescimento para a linhagem heterofermentativa. Em relação ao consumo, as linhagens foram capazes de metabolizar o manitol, malato e piruvato, entretanto, não apresentaram consumo do glicerol. Com isso, ambas as linhagens são beneficiadas pelo metabolismo da levedura e ainda a heterofermentativa é capaz de reabsorver o manitol quando os açúcares fermentescíveis são esgotados e de disponibilizar o metabólito para uso da homofermentativa. / The characteristics of the Brazilian industrial process to produce bioethanol make the distilleries susceptible to the presence of contaminating microorganisms that cause in the fall of production yield. Among the stages of the process, we have the alcoholic fermentation, which consists in the metabolization of sugars by the yeast strain selected from the Saccharomyces cerevisiae species producing the ethanol. At this stage contamination occurs by yeasts of the genus Saccharomyces, yeasts not Saccharomyces and bacteria. The most commonly found bacteria are those belonging to the group of lactic bacteria (LAB), which, because they use different routes to metabolize sugars, are classified as obligate heterofermentative, obligate homofermentative and facultative heterofermentative. Among the genera of this group, Lactobacillus are the most common because of their ability to tolerate high concentrations of ethanol and sugars, high temperatures and low pH. The species L. fermentum and L. plantarum have been reported in several studies as among the most frequent species contaminating this environment. Lactobacillus contaminants are in constant interaction with the yeast strain which consequently has its fermentative efficiency reduced. This work aimed to analyze the metabolites produced during industrial alcoholic fermentation and that can be used by the contaminating bacteria, thus obtaining conditions to be competitive and persistent in the process. For this, two strains were used, isolated from distillery and identified as L. fermentum (I3a) with obligate heterofermentative metabolism and L. plantarum (I4a) with facultative heterofermentative metabolism, presenting a homofermentative metabolism under the conditions studied. Both strains were submitted to growth in the presence of glycerol, malate and pyruvate, which are metabolites produced and excreted by yeast and mannitol produced and excreted by the obligate heterofermentative bacterium. It was observed that the metabolite mannitol is an efficient source of carbon for both strains providing growth even without the presence of sugars. In addition, the combination of glucose, fructose, mannitol and malate was able to increase strains growth. However, the presence of pyruvate presented growth stimulus for the heterofermentative strain. In relation to consumption, the strains were able to metabolize mannitol, malate and pyruvate, however, they did not present glycerol consumption. Thus, both strains are benefited by yeast metabolism and the heterofermentative can reabsorb mannitol when the fermentable sugars are depleted and to make the metabolite available for homofermentative use.

O processo fermentativo para a obtenção de etanol constitui um sistema complexo. Durante a fermentação se desenvolvem infecções em forma crônica e os surtos de infecção aguda aparecem em condições que; por causa da dinâmica não-linear do processo que envolve uma rede de reações metabólicas dos microrganismos, a alta dependência às condições de contorno e pelas interações sinérgicas e antagônicas envolvidas neste ecossistema; ainda representam um tema relevante de pesquisa em aberto. O presente trabalho propõe contribuir na tarefa de interpretar tais efeitos por intermédio de um modelo que inclua a interferência das bactérias. É proposto um cenário em escala laboratorial e controlado com a linhagem isolada de Saccharomyces cerevisiae PE-2 em co-cultura com bactérias de metabolismo heterofermentativo e homofermentativo. A interferência é explicada por intermédio de um modelo com efeito fixo baseado em um modelo não estruturado proposto por Lee (1983), e modificado a partir dos estudos de Andrietta (2003). São conduzidos ensaios de quatro tratamentos: uma fermentação controle e outras contaminadas com cada um dos diferentes tipos de bactérias e também em conjunto, a fim de fornecer dados experimentais para ajuste do modelo em discussão. Em seguida, são realizadas estimativas dos parâmetros que compõem as equações diferenciais da cinética da fermentação, utilizando um algoritmo genético baseado em evolução diferencial Storn e Price (1997). Completa-se a avaliação dos parâmetros por intermédio da análise de sensibilidade paramétrica dos mesmos. De posse desses resultados, é utilizado o modelo do tratamento controle como base, e são inseridos vetores de variáveis categóricas, correspondentes a efeitos fixos. Tais variáveis permitem modelar a interferência da contaminação no modelo matemático proposto. A estatística descritiva, a análise utilizando inferência bayesiana e a interpretação bioquímica dos resultados complementam as inferências obtidas a respeito do modelo. A análise de sensibilidade e correlação dos parâmetros, mostrou que os modelos para a cinética da fermentação, estudados e bem conhecidos não são adequados para modelar o processo, pela alta correlação dos seus parâmetros. O tratamento controle teve um rendimento de 46,97% na produção de etanol, o tratamento com bactéria heterofermentativa teve uma redução de 2.35% e com a mistura de ambas a redução foi de 1,58%. Uma das principais contribuições deste estudo relacionasse à produção de glicerol, o resultado mostra que no há impacto significativo na presença de bactérias homofermentativas e sim uma clara tendência a inibir a sua produção. Apresentam-se também indícios de sinergia entre as bactérias e de consumo de manitol pela bactéria homofermentativa. / The fermentation process for obtaining ethanol is a complex system. During fermentation develop chronic infections and outbreaks of acute infection in conditions that appear, because of the nonlinear dynamics of the process that involves a network of metabolic reactions of microorganisms, the high dependence on boundary conditions and the synergistic interactions and antagonistic involved in this ecosystem, still represent a relevant topic of research open. This paper proposes to contribute in the interpreting such effects through a model that includes the interference of bacteria. We propose a scenario in laboratory scale and controlled with the strain isolated from Saccharomyces cerevisiae PE-2 in co-culture with bacteria and homofermentativo heterofermentative metabolism. The interference is explained by means of a template with fixed effect based on a non structured proposed by Lee (1983) and modified from studies Andrietta (2003). Tests are conducted four treatments: a control fermentation and other contaminated with each of the different bacteria and also in conjunction in order to provide experimental data to fit the model under discussion. Are then carried estimates of the parameters that make up the differential equations of the kinetics of the fermentation, using a genetic algorithm based on differential evolution Storm and Price (1997). To complete the parameters evaluated through analysis of the same parameter sensitivity. With these results, the model is used as the basis of the control treatment, and are inserted vectors of categorical variables, corresponding to fixed effects. These variables allow modeling the interference of contamination in the mathematical model. Descriptive statistics and Bayesian inference analysis and interpretation of biochemical results obtained complement inferences about the model. Sensitivity analysis and correlation of parameters for the models showed that the kinetics of the fermentation, well studied and known are not suitable for modeling the process, the high correlation between the parameters. The control had a yield of 46.97% in ethanol, treatment with heterofermentative bacteria was reduced by 2.35% and a mixture of both reduction was 1.58%. A major contribution of this study is related to the glycerol, the result shows that no significant impact on the presence of homofermentative bacteria but a clear tendency to inhibit their production. It also presents evidence of synergy between bacteria and consumption of mannitol by homofermentative bacteria.

O processo fermentativo para a obtenção de etanol constitui um sistema complexo. Durante a fermentação se desenvolvem infecções em forma crônica e os surtos de infecção aguda aparecem em condições que; por causa da dinâmica não-linear do processo que envolve uma rede de reações metabólicas dos microrganismos, a alta dependência às condições de contorno e pelas interações sinérgicas e antagônicas envolvidas neste ecossistema; ainda representam um tema relevante de pesquisa em aberto. O presente trabalho propõe contribuir na tarefa de interpretar tais efeitos por intermédio de um modelo que inclua a interferência das bactérias. É proposto um cenário em escala laboratorial e controlado com a linhagem isolada de Saccharomyces cerevisiae PE-2 em co-cultura com bactérias de metabolismo heterofermentativo e homofermentativo. A interferência é explicada por intermédio de um modelo com efeito fixo baseado em um modelo não estruturado proposto por Lee (1983), e modificado a partir dos estudos de Andrietta (2003). São conduzidos ensaios de quatro tratamentos: uma fermentação controle e outras contaminadas com cada um dos diferentes tipos de bactérias e também em conjunto, a fim de fornecer dados experimentais para ajuste do modelo em discussão. Em seguida, são realizadas estimativas dos parâmetros que compõem as equações diferenciais da cinética da fermentação, utilizando um algoritmo genético baseado em evolução diferencial Storn e Price (1997). Completa-se a avaliação dos parâmetros por intermédio da análise de sensibilidade paramétrica dos mesmos. De posse desses resultados, é utilizado o modelo do tratamento controle como base, e são inseridos vetores de variáveis categóricas, correspondentes a efeitos fixos. Tais variáveis permitem modelar a interferência da contaminação no modelo matemático proposto. A estatística descritiva, a análise utilizando inferência bayesiana e a interpretação bioquímica dos resultados complementam as inferências obtidas a respeito do modelo. A análise de sensibilidade e correlação dos parâmetros, mostrou que os modelos para a cinética da fermentação, estudados e bem conhecidos não são adequados para modelar o processo, pela alta correlação dos seus parâmetros. O tratamento controle teve um rendimento de 46,97% na produção de etanol, o tratamento com bactéria heterofermentativa teve uma redução de 2.35% e com a mistura de ambas a redução foi de 1,58%. Uma das principais contribuições deste estudo relacionasse à produção de glicerol, o resultado mostra que no há impacto significativo na presença de bactérias homofermentativas e sim uma clara tendência a inibir a sua produção. Apresentam-se também indícios de sinergia entre as bactérias e de consumo de manitol pela bactéria homofermentativa. / The fermentation process for obtaining ethanol is a complex system. During fermentation develop chronic infections and outbreaks of acute infection in conditions that appear, because of the nonlinear dynamics of the process that involves a network of metabolic reactions of microorganisms, the high dependence on boundary conditions and the synergistic interactions and antagonistic involved in this ecosystem, still represent a relevant topic of research open. This paper proposes to contribute in the interpreting such effects through a model that includes the interference of bacteria. We propose a scenario in laboratory scale and controlled with the strain isolated from Saccharomyces cerevisiae PE-2 in co-culture with bacteria and homofermentativo heterofermentative metabolism. The interference is explained by means of a template with fixed effect based on a non structured proposed by Lee (1983) and modified from studies Andrietta (2003). Tests are conducted four treatments: a control fermentation and other contaminated with each of the different bacteria and also in conjunction in order to provide experimental data to fit the model under discussion. Are then carried estimates of the parameters that make up the differential equations of the kinetics of the fermentation, using a genetic algorithm based on differential evolution Storm and Price (1997). To complete the parameters evaluated through analysis of the same parameter sensitivity. With these results, the model is used as the basis of the control treatment, and are inserted vectors of categorical variables, corresponding to fixed effects. These variables allow modeling the interference of contamination in the mathematical model. Descriptive statistics and Bayesian inference analysis and interpretation of biochemical results obtained complement inferences about the model. Sensitivity analysis and correlation of parameters for the models showed that the kinetics of the fermentation, well studied and known are not suitable for modeling the process, the high correlation between the parameters. The control had a yield of 46.97% in ethanol, treatment with heterofermentative bacteria was reduced by 2.35% and a mixture of both reduction was 1.58%. A major contribution of this study is related to the glycerol, the result shows that no significant impact on the presence of homofermentative bacteria but a clear tendency to inhibit their production. It also presents evidence of synergy between bacteria and consumption of mannitol by homofermentative bacteria.