Le cholestérol est le principal stérol présent dans la rétine. Dans sa forme libre, le cholestérol est distribué dans toutes les couches cellulaires de la rétine, alors que le cholestérol estérifié s'accumule essentiellement à la base de l'épithélium pigmentaire rétinien. La capacité intrinsèque de la rétine à synthétiser le cholestérol paraît limitée, ce qui implique nécessairement que des voies extra-rétiniennes participent activement à suppléer la rétine en cholestérol. Les cellules gliales de Müller contribueraient à l'apport de cholestérol aux neurones de la rétine, en particulier pour la formation des synapses. Les conséquences délétères d'une accumulation ou à l'inverse d'un déficit en cholestérol dans les neurones sur leur survie souligne l'importance de maintenir l'équilibre entre l'apport et la néosynthèse du cholestérol d'une part et son élimination d'autre part. Pour cela, la rétine neurale a en particulier la capacité de convertir, pour l'éliminer, le cholestérol en 24S-hydroxycholestérol. En effet, le transport du 24S-hydroxycholestérol au travers des membranes est facilité par la présence d'un groupe hydroxyle supplémentaire, lui conférant une polarité plus importante par rapport au cholestérol. L'enzyme qui catalyse cette réaction est la cholestérol-24S-hydroxylase (CYP46A1). Des liens ont été établis entre CYP46A1, 24S-hydroxycholestérol et processus neurodégénératifs dans le cerveau, suggérant un rôle potentiel dans certaines pathologies comme la maladie d'Alzheimer. CYP46A1 est exprimée dans la rétine neurale, et plus particulièrement dans les cellules ganglionnaires de la rétine. Le rôle de CYP46A1 dans la rétine reste pour l'instant inconnu. Cependant, par analogie avec le cerveau, nous pouvons supposer une fonction dans le contrôle de l'homéostasie du cholestérol dans les neurones et envisager une association avec des pathologies dégénératives de la rétine comme la Dégénérescence Maculaire Liée à l'Âge (DMLA) ou le glaucome. Dans ce contexte, l'objectif de nos travaux a consisté à évaluer le rôle de la cholestérol-24S-hydroxylase dans la rétine en conditions physiologiques et pathologiques. Par une approche clinique, nous avons trouvé qu'un polymorphisme génétique dans CYP46A1 était un facteur de risque de glaucome (Risque relatif=1,26, intervalle de confiance à 95%=1,006-1,574, p<0,05) (Fourgeux et al. 2009, Invest Ophthalmol Vis Sci 50:5712-7). Par contre, ce polymorphisme génétique n'a pas été retrouvé, en tant que tel, comme facteur de risque chez des patients DMLA, mais pourrait l'être chez les patients non porteurs d'allèles à risque dans les gènes CFH et LOC388715 (Fourgeux et al. 2012, Invest Ophthalmol Vis Sci 53:7026-33). Deux approches expérimentales nous ont permis de suggérer qu'il existe un lien entre le stress des cellules de la rétine et le 24S-hydroxycholestérol. En effet, dans une étude in vivo faite chez le rat, après avoir reproduit une caractéristique principale du glaucome par l'augmentation de la pression intraoculaire, nous avons suggéré le rôle crucial de la glie dans le maintien de l'expression de CYP46A1 au cours de la neurodégénérescence de la rétine (Fourgeux et al. 2012, Acta Ophthalmol, Sep 23 ; doi: 10.1111/j.1755-3768.2012.02490.x.). Enfin, l'inhibition pharmacologique de l'activité CYP46A1 dans la rétine par le voriconazole injecté in vivo chez le rat nous a permis de mettre en évidence que la diminution du contenu en 24S-hydroxycholestérol de la rétine était associée à une dysfonction des cellules ganglionnaires, évaluée par électrorétinographie. En parallèle, nous avons observé une activation gliale, dont l'amplitude était amplifiée par l'inhibition de l'activation microgliale induite par la minocycline [...]

<p> Exposure to chronic low oxygen (hypoxia) leads to a series of adaptive responses involving changes in gene expression that are critical for cell, tissue, and organismal survival. These changes are mediated by an important set of regulators belonging to the hypoxia inducible factor (HIF) family of transcription factors (e.g. HIF-lα, HIF-2α, HIF3α) which undergo rapid degradation during normal oxygen (normoxia) but are rapidly stabilized during hypoxia. While the role of HIF-1α has been extensively studied in many cell types, there have been relatively few studies on the role of HIF-2α, though recent evidence suggests its function maybe tissue specific. This thesis examined the hypothesis that HIF-2α plays a central role in the development and function of catecholaminergic cells of the sympathoadrenal (SA) lineage. The study was aided by use of an immortalized line of rat adrenomedullary chromaffin cells (i.e. MAH cells), derived from fetal SA progenitors, which express several hypoxia-sensitive properties characteristic of native cells in the adrenal gland. In Chapter 2, I investigated the potential contributions of mitochondrial reactive oxygen species (ROS) and 0 2 consumption to HIF-2α induction in MAH cells exposed to chronic hypoxia (2% O(2); 24 hr). In MAH cells, chronic hypoxia caused an increase in HIF-2α induction which was blocked by inhibition of any of the mitochondrial complexes using pharmacological agents, or by specific inhibition of complexes III and IV using RNAi techniques. It was found that in this 0 2-sensitive chromaffin cell line mitochondrial O(2) consumption, rather than changes in ROS, regulated HIF-2α induction during hypoxia. In Chapter 3, I investigated the hypothesized role of HIF-2α in the development of the catecholaminergic phenotype in cells of the SA lineage using the MAH cell line as a model. Mutant MAH cells, with depleted HIF-2α due to siRNA knock-down, showed dramatically lower levels of dopamine and noradrenaline compared to untransfected and scrambled control cells, regardless of whether the cells were cultured under normoxia or chronic hypoxia. This was correlated with a marked reduction in the expression of DOPA decarboxylase (DDC) and dopamine B hydroxylase (DBH), though the expression of tyrosine hydroxylase (TH) was unaffected. Moreover, HIF-2α was able to bind to a region of the DDC gene promoter which contains two putative hypoxia response elements (HREs). These data suggest that a basal level of HIF-2α function is required for the normal developmental expression of DDC and DBH in SA progenitor cells, and that loss of this function leads to impaired catecholamine (CA) biosynthesis. In Chapter 4, I investigated genes regulated by chronic hypoxia in MAH cells, with a focus on those involved in CA metabolism, storage, and secretion. Using microarray analysis combined with QPCR and RNAi knock-down methodology I uncovered several genes, involved in amine vesicular packaging, trafficking and secretion, which were upregulated during chronic hypoxia. One gene specifically, the adenosine A(2A) receptor (A(2A)R) gene, which appears to modulate CA secretion via autocrine or paracrine actions of extracellular adenosine, was dramatically upregulated in chronic hypoxia. Interestingly, this effect was completely abolished in HIF-2α knockdown MAH cells, suggesting a critical involvement of HIF-2α. Chromatin immunoprecipitation (ChIP) assays revealed that HIF-2α bound to the promoter region of the A(2A)R gene which contains a putative hypoxia response element (HRE) immediately upstream of exon 1. Ratiometric fluorescence measurements of intracellular Ca(2+) revealed that adenosine (50 μM) potentiated the high K(+)-evoked rise in [Ca(2+)]i in MAH cells. This effect of adenosine was further enhanced after chronic hypoxia, but was abolished in HIF-2α knock-down cells. In conclusion, these data suggest that HIF-2α is a key regulator of several genes involved in CA biosynthesis, and of others that mediate the facilitatory effects of chronic hypoxia on CA secretion in sympathoadrenal derivatives. / Thesis / Doctor of Philosophy (PhD)