Mycoplasma hyopneumoniae é uma das menores bactérias encontradas na natureza, apresentando genoma altamente reduzido e ausência de parede celular. Este organismo é o agente causador da pneumonia enzoótica suína, a qual apresenta distribuição mundial, causando importantes perdas econômicas. Na última década, várias espécies de Mycoplasma tiveram seus genomas completamente seqüenciados, incluindo quatro cepas de M. hyopneumoniae. Apesar da grande quantidade de dados gerados, pouco se sabe sobre as seqüências nucleotídicas que controlam a expressão gênica nestes microrganismos. A grande variabilidade encontrada nas regiões promotoras, o baixo conteúdo de GC presente no genoma e a carência de promotores experimentalmente caracterizados, são fatores que dificultam o reconhecimento in silico das seqüências reguladoras no gênero Mycoplasma. Assim sendo, este trabalho tem como objetivo identificar seqüências nucleotídicas envolvidas com o início da transcrição em M. hyopneumoniae, gerando dados que possibilitem a construção de uma matriz capaz de fazer a predição de promotores nesta espécie. Inicialmente, os sítios de início de transcrição (TSSs) de 23 genes de M. hyopneumoniae foram definidos. Os resultados mostraram que os TSSs identificados localizavam-se entre 2 e 144 pb de distância do início dos genes, sendo compostos em sua grande maioria por um resíduo de adenosina. Um padrão semelhante ao elemento −10 de promotores σ70 foi encontrado a montante dos TSSs. No entanto, não foi possível identificar conservação de uma provável região −35, porém, um sinal periódico AT-rico foi observado. Aproximadamente metade dos genes analisados continha o motivo 5'-TRTG-3', que é idêntico ao elemento −16, comumente encontrado em bactérias gram-positivas. A partir da determinação dos promotores, foi construída uma matriz de pontuação posição-específica que foi utilizada para localizar promotores putativos a montante de todas as seqüências codificantes (CDSs) de M. hyopneumoniae. Duzentos e um sinais foram encontrados associados a 169 CDSs. A maioria destas seqüências estava localizada até 100 nucleotídeos de distância dos códons de iniciação. Este estudo mostra que o número de seqüências promotoras preditas no genoma de M. hyopneumoniae é mais freqüente que o esperado ao acaso, indicando que a maioria das seqüências detectadas são provavelmente sítios de ligação funcionais. / Mycoplasma hyopneumoniae is one of the smallest bacteria found in nature, presenting a small genome and absence of cell wall. It is present in the majority of swine herds throughout the world, and is considered an important pathogen in the swine industry. In the last decade, many species of this genus had their genome completely sequenced, including four strains of M. hyopneumoniae. Nevertheless, very little is understood of the nucleotide sequences that control transcription initiation in these microorganisms. Like its relatives, M. hyopneumoniae lacks several major regulators of gene expression, including two component regulatory systems and multiple σ factors, thus it appears that the signals for promotion and regulation of transcription may differ significantly from other bacteria. In addition, the low GC content and the dearth of experimentally characterized promoters in this genus severely limit the recognition of the controlling sequences. Therefore, this study aims to identify nucleotide sequences involved in transcription initiation in M. hyopneumoniae, and thus generate data to enable the construction of a matrix capable of predicting promoters in this species. Initially, the transcription start sites (TSSs) of 23 genes of M. hyopneumoniae were experimentally defined. The results showed that the identified TSSs were located between 2 and 144 bp away from the gene starts, being composed mostly of an adenosine residue. A pattern that resembles the σ70 promoter −10 element was found upstream of the TSSs. However, no −35 element was distinguished. Instead, an AT-rich periodic signal was identified. About half of the experimentally defined promoters contained the motif 5'-TRTG-3', which was identical to the −16 element usually found in gram-positive bacteria. The defined promoters were utilized to build position-specific scoring matrices in order to scan putative promoters upstream of all coding sequences (CDSs) in the M. hyopneumoniae genome. Two hundred and one signals were found associated with 169 CDSs. Most of these sequences were located within 100 nucleotides of the start codons. This study has shown that the number of promoter-like sequences in the M. hyopneumoniae genome is more frequent than expected by chance, indicating that most of the sequences detected are probably biologically functional.

Mycoplasma hyopneumoniae é uma das menores bactérias presentes na natureza, apresentando um genoma reduzido com alto conteúdo de A+T e ausência de parede celular. Este organismo é o agente etiológico da pneumonia enzoótica suína, uma doença crônica que afeta rebanhos em todo mundo sendo responsável por grandes perdas econômicas. Para investigar a patogênese de M. hyopneumoniae é importante entender seus mecanismos genéticos, porém, apesar do sequenciamento do genoma de várias linhagens (7448, J, 232 e 168), pouco se sabe sobre os mecanismos que regulam e controlam a expressão gênica neste microrganismo, principalmente no que se relaciona às proteínas regulatórias. Os fatores de transcrição são proteínas que se ligam ao DNA e propiciam a capacidade de controlar a expressão gênica sob diferentes estímulos metabólicos ou condições de crescimento. O conhecimento que se tem sobre essas proteínas em M. hyopneumoniae é escasso, então, desta forma, este trabalho tem como objetivo a análise de potencias fatores de transcrição de M. hyopneumoniae. Para isso foram selecionadas proteínas tradicionalmente descritas em bancos de dados como fatores de transcrição (HrcA – MHP7448_0010; transcriptional regulator – MHP7448_0279; e a proteína hipotética MHP7448_0551), além de uma proteína hipotética que apresenta similaridades estruturais com fatores sigma (MHP7448_0639). Estas proteínas foram clonadas por recombinação homóloga in vivo no vetor de expressão pGEX 4T1 e transformadas em Escherichia coli para expressão das proteínas recombinantes. Porém, para empregar essa técnica foi necessário realizar a mutagênese sítio-dirigida para a substituição do códon UGA (triptofano em micoplasmas) para UGG (triptofano no código genético universal) nas proteínas que apresentavam este códon. As mutações foram inseridas através da técnica de overlap extension PCR, utilizando primers mutagênicos. Foram obtidos clones para três proteínas (MHP7448_0551, MHP7448_0639 e MHP7448_0010), que foram eficientemente expressas em E. coli. Depois de solubilizadas com 0,5% de sarcosil, essas proteínas foram submetidas a um processo de purificação por cromatografia de afinidade. A purificação foi bem sucedida para duas das três proteínas testadas, e novos testes serão realizados com a proteína ainda não purificada (MHP7448_0010). Uma vez purificados, os potenciais fatores de transcrição serão utilizados na identificação das regiões do DNA que essas proteínas regulam e que estão envolvidas no controle da expressão gênica em M. hyopneumoniae. / Mycoplasma hyopneumoniae is one of the smallest bacteria found in nature, presenting a reduced genome with a high A+T content and no cell wall. This bacterium is the etiological agent of swine enzootic pneumonia, a chronic disease that affects herds throughout the world and is responsible for great economic losses. To investigate the pathogenesis of M. hyopneumoniae it is important to understand their genetic mechanisms, however, despite the genome sequencing of several strains (7448, J, 232 and 168), little is known about the mechanisms that regulate and control the gene expression in this bacterium, especially about regulatory proteins. Transcription factors are proteins that bind to DNA providing the ability to control gene expression under different metabolic stimuli or growth conditions. The knowledge about these proteins in M. hyopneumoniae is scarce; therefore, the aim of this study is the analysis of potential transcription factors of M. hyopneumoniae. We selected proteins traditionally reported in databases as transcriptional factors (HrcA – MHP7448_0010; transcriptional regulator – MHP7448_0279; and the hypothetical protein MHP7448_0551), and a hypothetical protein which has structural similarities with sigma factors (MHP7448_0639). These proteins were cloned by in vivo homologous recombination in the expression vector pGEX 4T1 and were transformed into Escherichia coli to express the recombinant proteins. Nevertheless, for the application of this system it was necessary to perform site-directed mutagenesis to replace the codon UGA (tryptophan in mycoplasma) to UGG (tryptophan in the universal genetic code) in the proteins that presented this codon. The mutations were introduced by overlap extension PCR technique, using mutagenic primers. Clones were obtained for three proteins (MHP7448_0551, MHP7448_0639 and MHP7448_0010), which were efficiently expressed in E. coli. After solubilization with 0.5% sarkosyl, these proteins were subjected to purification by affinity chromatography. Purification was successful for two of the three tested proteins, and further tests will be carried out with the protein not purifyed (MHP7448_0010). After purification, the potential transcription factors will be used to identify the regions of DNA that these proteins regulate and which are involved in the control of gene expression in M. hyopneumoniae.

Mycoplasma hyopneumoniae é uma das menores bactérias encontradas na natureza, apresentando genoma altamente reduzido e ausência de parede celular. Este organismo é o agente causador da pneumonia enzoótica suína, a qual apresenta distribuição mundial, causando importantes perdas econômicas. Na última década, várias espécies de Mycoplasma tiveram seus genomas completamente seqüenciados, incluindo quatro cepas de M. hyopneumoniae. Apesar da grande quantidade de dados gerados, pouco se sabe sobre as seqüências nucleotídicas que controlam a expressão gênica nestes microrganismos. A grande variabilidade encontrada nas regiões promotoras, o baixo conteúdo de GC presente no genoma e a carência de promotores experimentalmente caracterizados, são fatores que dificultam o reconhecimento in silico das seqüências reguladoras no gênero Mycoplasma. Assim sendo, este trabalho tem como objetivo identificar seqüências nucleotídicas envolvidas com o início da transcrição em M. hyopneumoniae, gerando dados que possibilitem a construção de uma matriz capaz de fazer a predição de promotores nesta espécie. Inicialmente, os sítios de início de transcrição (TSSs) de 23 genes de M. hyopneumoniae foram definidos. Os resultados mostraram que os TSSs identificados localizavam-se entre 2 e 144 pb de distância do início dos genes, sendo compostos em sua grande maioria por um resíduo de adenosina. Um padrão semelhante ao elemento −10 de promotores σ70 foi encontrado a montante dos TSSs. No entanto, não foi possível identificar conservação de uma provável região −35, porém, um sinal periódico AT-rico foi observado. Aproximadamente metade dos genes analisados continha o motivo 5'-TRTG-3', que é idêntico ao elemento −16, comumente encontrado em bactérias gram-positivas. A partir da determinação dos promotores, foi construída uma matriz de pontuação posição-específica que foi utilizada para localizar promotores putativos a montante de todas as seqüências codificantes (CDSs) de M. hyopneumoniae. Duzentos e um sinais foram encontrados associados a 169 CDSs. A maioria destas seqüências estava localizada até 100 nucleotídeos de distância dos códons de iniciação. Este estudo mostra que o número de seqüências promotoras preditas no genoma de M. hyopneumoniae é mais freqüente que o esperado ao acaso, indicando que a maioria das seqüências detectadas são provavelmente sítios de ligação funcionais. / Mycoplasma hyopneumoniae is one of the smallest bacteria found in nature, presenting a small genome and absence of cell wall. It is present in the majority of swine herds throughout the world, and is considered an important pathogen in the swine industry. In the last decade, many species of this genus had their genome completely sequenced, including four strains of M. hyopneumoniae. Nevertheless, very little is understood of the nucleotide sequences that control transcription initiation in these microorganisms. Like its relatives, M. hyopneumoniae lacks several major regulators of gene expression, including two component regulatory systems and multiple σ factors, thus it appears that the signals for promotion and regulation of transcription may differ significantly from other bacteria. In addition, the low GC content and the dearth of experimentally characterized promoters in this genus severely limit the recognition of the controlling sequences. Therefore, this study aims to identify nucleotide sequences involved in transcription initiation in M. hyopneumoniae, and thus generate data to enable the construction of a matrix capable of predicting promoters in this species. Initially, the transcription start sites (TSSs) of 23 genes of M. hyopneumoniae were experimentally defined. The results showed that the identified TSSs were located between 2 and 144 bp away from the gene starts, being composed mostly of an adenosine residue. A pattern that resembles the σ70 promoter −10 element was found upstream of the TSSs. However, no −35 element was distinguished. Instead, an AT-rich periodic signal was identified. About half of the experimentally defined promoters contained the motif 5'-TRTG-3', which was identical to the −16 element usually found in gram-positive bacteria. The defined promoters were utilized to build position-specific scoring matrices in order to scan putative promoters upstream of all coding sequences (CDSs) in the M. hyopneumoniae genome. Two hundred and one signals were found associated with 169 CDSs. Most of these sequences were located within 100 nucleotides of the start codons. This study has shown that the number of promoter-like sequences in the M. hyopneumoniae genome is more frequent than expected by chance, indicating that most of the sequences detected are probably biologically functional.

Mycoplasma hyopneumoniae é uma das menores bactérias presentes na natureza, apresentando um genoma reduzido com alto conteúdo de A+T e ausência de parede celular. Este organismo é o agente etiológico da pneumonia enzoótica suína, uma doença crônica que afeta rebanhos em todo mundo sendo responsável por grandes perdas econômicas. Para investigar a patogênese de M. hyopneumoniae é importante entender seus mecanismos genéticos, porém, apesar do sequenciamento do genoma de várias linhagens (7448, J, 232 e 168), pouco se sabe sobre os mecanismos que regulam e controlam a expressão gênica neste microrganismo, principalmente no que se relaciona às proteínas regulatórias. Os fatores de transcrição são proteínas que se ligam ao DNA e propiciam a capacidade de controlar a expressão gênica sob diferentes estímulos metabólicos ou condições de crescimento. O conhecimento que se tem sobre essas proteínas em M. hyopneumoniae é escasso, então, desta forma, este trabalho tem como objetivo a análise de potencias fatores de transcrição de M. hyopneumoniae. Para isso foram selecionadas proteínas tradicionalmente descritas em bancos de dados como fatores de transcrição (HrcA – MHP7448_0010; transcriptional regulator – MHP7448_0279; e a proteína hipotética MHP7448_0551), além de uma proteína hipotética que apresenta similaridades estruturais com fatores sigma (MHP7448_0639). Estas proteínas foram clonadas por recombinação homóloga in vivo no vetor de expressão pGEX 4T1 e transformadas em Escherichia coli para expressão das proteínas recombinantes. Porém, para empregar essa técnica foi necessário realizar a mutagênese sítio-dirigida para a substituição do códon UGA (triptofano em micoplasmas) para UGG (triptofano no código genético universal) nas proteínas que apresentavam este códon. As mutações foram inseridas através da técnica de overlap extension PCR, utilizando primers mutagênicos. Foram obtidos clones para três proteínas (MHP7448_0551, MHP7448_0639 e MHP7448_0010), que foram eficientemente expressas em E. coli. Depois de solubilizadas com 0,5% de sarcosil, essas proteínas foram submetidas a um processo de purificação por cromatografia de afinidade. A purificação foi bem sucedida para duas das três proteínas testadas, e novos testes serão realizados com a proteína ainda não purificada (MHP7448_0010). Uma vez purificados, os potenciais fatores de transcrição serão utilizados na identificação das regiões do DNA que essas proteínas regulam e que estão envolvidas no controle da expressão gênica em M. hyopneumoniae. / Mycoplasma hyopneumoniae is one of the smallest bacteria found in nature, presenting a reduced genome with a high A+T content and no cell wall. This bacterium is the etiological agent of swine enzootic pneumonia, a chronic disease that affects herds throughout the world and is responsible for great economic losses. To investigate the pathogenesis of M. hyopneumoniae it is important to understand their genetic mechanisms, however, despite the genome sequencing of several strains (7448, J, 232 and 168), little is known about the mechanisms that regulate and control the gene expression in this bacterium, especially about regulatory proteins. Transcription factors are proteins that bind to DNA providing the ability to control gene expression under different metabolic stimuli or growth conditions. The knowledge about these proteins in M. hyopneumoniae is scarce; therefore, the aim of this study is the analysis of potential transcription factors of M. hyopneumoniae. We selected proteins traditionally reported in databases as transcriptional factors (HrcA – MHP7448_0010; transcriptional regulator – MHP7448_0279; and the hypothetical protein MHP7448_0551), and a hypothetical protein which has structural similarities with sigma factors (MHP7448_0639). These proteins were cloned by in vivo homologous recombination in the expression vector pGEX 4T1 and were transformed into Escherichia coli to express the recombinant proteins. Nevertheless, for the application of this system it was necessary to perform site-directed mutagenesis to replace the codon UGA (tryptophan in mycoplasma) to UGG (tryptophan in the universal genetic code) in the proteins that presented this codon. The mutations were introduced by overlap extension PCR technique, using mutagenic primers. Clones were obtained for three proteins (MHP7448_0551, MHP7448_0639 and MHP7448_0010), which were efficiently expressed in E. coli. After solubilization with 0.5% sarkosyl, these proteins were subjected to purification by affinity chromatography. Purification was successful for two of the three tested proteins, and further tests will be carried out with the protein not purifyed (MHP7448_0010). After purification, the potential transcription factors will be used to identify the regions of DNA that these proteins regulate and which are involved in the control of gene expression in M. hyopneumoniae.

Mycoplasma hyopneumoniae é uma das menores bactérias encontradas na natureza, apresentando genoma altamente reduzido e ausência de parede celular. Este organismo é o agente causador da pneumonia enzoótica suína, a qual apresenta distribuição mundial, causando importantes perdas econômicas. Na última década, várias espécies de Mycoplasma tiveram seus genomas completamente seqüenciados, incluindo quatro cepas de M. hyopneumoniae. Apesar da grande quantidade de dados gerados, pouco se sabe sobre as seqüências nucleotídicas que controlam a expressão gênica nestes microrganismos. A grande variabilidade encontrada nas regiões promotoras, o baixo conteúdo de GC presente no genoma e a carência de promotores experimentalmente caracterizados, são fatores que dificultam o reconhecimento in silico das seqüências reguladoras no gênero Mycoplasma. Assim sendo, este trabalho tem como objetivo identificar seqüências nucleotídicas envolvidas com o início da transcrição em M. hyopneumoniae, gerando dados que possibilitem a construção de uma matriz capaz de fazer a predição de promotores nesta espécie. Inicialmente, os sítios de início de transcrição (TSSs) de 23 genes de M. hyopneumoniae foram definidos. Os resultados mostraram que os TSSs identificados localizavam-se entre 2 e 144 pb de distância do início dos genes, sendo compostos em sua grande maioria por um resíduo de adenosina. Um padrão semelhante ao elemento −10 de promotores σ70 foi encontrado a montante dos TSSs. No entanto, não foi possível identificar conservação de uma provável região −35, porém, um sinal periódico AT-rico foi observado. Aproximadamente metade dos genes analisados continha o motivo 5'-TRTG-3', que é idêntico ao elemento −16, comumente encontrado em bactérias gram-positivas. A partir da determinação dos promotores, foi construída uma matriz de pontuação posição-específica que foi utilizada para localizar promotores putativos a montante de todas as seqüências codificantes (CDSs) de M. hyopneumoniae. Duzentos e um sinais foram encontrados associados a 169 CDSs. A maioria destas seqüências estava localizada até 100 nucleotídeos de distância dos códons de iniciação. Este estudo mostra que o número de seqüências promotoras preditas no genoma de M. hyopneumoniae é mais freqüente que o esperado ao acaso, indicando que a maioria das seqüências detectadas são provavelmente sítios de ligação funcionais. / Mycoplasma hyopneumoniae is one of the smallest bacteria found in nature, presenting a small genome and absence of cell wall. It is present in the majority of swine herds throughout the world, and is considered an important pathogen in the swine industry. In the last decade, many species of this genus had their genome completely sequenced, including four strains of M. hyopneumoniae. Nevertheless, very little is understood of the nucleotide sequences that control transcription initiation in these microorganisms. Like its relatives, M. hyopneumoniae lacks several major regulators of gene expression, including two component regulatory systems and multiple σ factors, thus it appears that the signals for promotion and regulation of transcription may differ significantly from other bacteria. In addition, the low GC content and the dearth of experimentally characterized promoters in this genus severely limit the recognition of the controlling sequences. Therefore, this study aims to identify nucleotide sequences involved in transcription initiation in M. hyopneumoniae, and thus generate data to enable the construction of a matrix capable of predicting promoters in this species. Initially, the transcription start sites (TSSs) of 23 genes of M. hyopneumoniae were experimentally defined. The results showed that the identified TSSs were located between 2 and 144 bp away from the gene starts, being composed mostly of an adenosine residue. A pattern that resembles the σ70 promoter −10 element was found upstream of the TSSs. However, no −35 element was distinguished. Instead, an AT-rich periodic signal was identified. About half of the experimentally defined promoters contained the motif 5'-TRTG-3', which was identical to the −16 element usually found in gram-positive bacteria. The defined promoters were utilized to build position-specific scoring matrices in order to scan putative promoters upstream of all coding sequences (CDSs) in the M. hyopneumoniae genome. Two hundred and one signals were found associated with 169 CDSs. Most of these sequences were located within 100 nucleotides of the start codons. This study has shown that the number of promoter-like sequences in the M. hyopneumoniae genome is more frequent than expected by chance, indicating that most of the sequences detected are probably biologically functional.

Mycoplasma hyopneumoniae é uma das menores bactérias presentes na natureza, apresentando um genoma reduzido com alto conteúdo de A+T e ausência de parede celular. Este organismo é o agente etiológico da pneumonia enzoótica suína, uma doença crônica que afeta rebanhos em todo mundo sendo responsável por grandes perdas econômicas. Para investigar a patogênese de M. hyopneumoniae é importante entender seus mecanismos genéticos, porém, apesar do sequenciamento do genoma de várias linhagens (7448, J, 232 e 168), pouco se sabe sobre os mecanismos que regulam e controlam a expressão gênica neste microrganismo, principalmente no que se relaciona às proteínas regulatórias. Os fatores de transcrição são proteínas que se ligam ao DNA e propiciam a capacidade de controlar a expressão gênica sob diferentes estímulos metabólicos ou condições de crescimento. O conhecimento que se tem sobre essas proteínas em M. hyopneumoniae é escasso, então, desta forma, este trabalho tem como objetivo a análise de potencias fatores de transcrição de M. hyopneumoniae. Para isso foram selecionadas proteínas tradicionalmente descritas em bancos de dados como fatores de transcrição (HrcA – MHP7448_0010; transcriptional regulator – MHP7448_0279; e a proteína hipotética MHP7448_0551), além de uma proteína hipotética que apresenta similaridades estruturais com fatores sigma (MHP7448_0639). Estas proteínas foram clonadas por recombinação homóloga in vivo no vetor de expressão pGEX 4T1 e transformadas em Escherichia coli para expressão das proteínas recombinantes. Porém, para empregar essa técnica foi necessário realizar a mutagênese sítio-dirigida para a substituição do códon UGA (triptofano em micoplasmas) para UGG (triptofano no código genético universal) nas proteínas que apresentavam este códon. As mutações foram inseridas através da técnica de overlap extension PCR, utilizando primers mutagênicos. Foram obtidos clones para três proteínas (MHP7448_0551, MHP7448_0639 e MHP7448_0010), que foram eficientemente expressas em E. coli. Depois de solubilizadas com 0,5% de sarcosil, essas proteínas foram submetidas a um processo de purificação por cromatografia de afinidade. A purificação foi bem sucedida para duas das três proteínas testadas, e novos testes serão realizados com a proteína ainda não purificada (MHP7448_0010). Uma vez purificados, os potenciais fatores de transcrição serão utilizados na identificação das regiões do DNA que essas proteínas regulam e que estão envolvidas no controle da expressão gênica em M. hyopneumoniae. / Mycoplasma hyopneumoniae is one of the smallest bacteria found in nature, presenting a reduced genome with a high A+T content and no cell wall. This bacterium is the etiological agent of swine enzootic pneumonia, a chronic disease that affects herds throughout the world and is responsible for great economic losses. To investigate the pathogenesis of M. hyopneumoniae it is important to understand their genetic mechanisms, however, despite the genome sequencing of several strains (7448, J, 232 and 168), little is known about the mechanisms that regulate and control the gene expression in this bacterium, especially about regulatory proteins. Transcription factors are proteins that bind to DNA providing the ability to control gene expression under different metabolic stimuli or growth conditions. The knowledge about these proteins in M. hyopneumoniae is scarce; therefore, the aim of this study is the analysis of potential transcription factors of M. hyopneumoniae. We selected proteins traditionally reported in databases as transcriptional factors (HrcA – MHP7448_0010; transcriptional regulator – MHP7448_0279; and the hypothetical protein MHP7448_0551), and a hypothetical protein which has structural similarities with sigma factors (MHP7448_0639). These proteins were cloned by in vivo homologous recombination in the expression vector pGEX 4T1 and were transformed into Escherichia coli to express the recombinant proteins. Nevertheless, for the application of this system it was necessary to perform site-directed mutagenesis to replace the codon UGA (tryptophan in mycoplasma) to UGG (tryptophan in the universal genetic code) in the proteins that presented this codon. The mutations were introduced by overlap extension PCR technique, using mutagenic primers. Clones were obtained for three proteins (MHP7448_0551, MHP7448_0639 and MHP7448_0010), which were efficiently expressed in E. coli. After solubilization with 0.5% sarkosyl, these proteins were subjected to purification by affinity chromatography. Purification was successful for two of the three tested proteins, and further tests will be carried out with the protein not purifyed (MHP7448_0010). After purification, the potential transcription factors will be used to identify the regions of DNA that these proteins regulate and which are involved in the control of gene expression in M. hyopneumoniae.

Mycoplasma hyopneumoniae é uma bactéria pertencente à classe Mollicutes, sendo o agente etiológico da pneumonia enzoótica suína e o agente primário do complexo de doenças respiratórias de suínos (CDRS). A sinal-peptidase I (SPase I) é uma endopeptidase de membrana que cliva os peptídeos-sinal (PS) de proteínas transportadas pelo sistema geral de secreção. A SPase I do M. hyopneumoniae (MhSPase I) é codificada pela sequência de DNA codificadora (CDS) sipS, presente nas 3 linhagens da espécie com genomas já sequenciados. Este trabalho tem como objetivo caracterizar funcional e imunologicamente a MhSPase I, assim como investigar a sua relação com a virulência da bactéria. Foi demonstrado que sipS é parte de um operon, sendo cotranscrita com outras 4 CDSs. A CDS sipS foi clonada e a MhSPase I recombinante (rMhSPase I) foi expressa em Escherichia coli. A rMhSPase I mostrou-se altamente imunogênica para camundongos e seu caráter antigênico foi confirmado para suínos. A MhSPase I apresentou expressão diferencial em linhagens patogênicas e não patogênicas de M. hyopneumoniae corroborando a ideia de que essa enzima é um fator de virulência da bactéria. Análises de sequências de aminoácidos evidenciaram que a MhSPase I tem baixa identidade com enzimas ortólogas de outras espécies de micoplasmas e de bactérias relacionadas ao CDRS. O potencial sorodiagnóstico da rMhSPase I foi demonstrado em um ELISA. Predições in silico de possíveis PSs clivados pela MhSPase I indicaram que proteínas hipotéticas e proteínas de membrana, incluindo adesinas, seriam substratos da enzima. Ensaios de atividade in vitro com PSs sintéticos derivados de predições in silico, contudo, não foram conclusivos. Estudos futuros deverão elucidar o papel da SPase I na exportação de proteínas em M. hyopneumoniae e explorar o potencial da enzima como antígeno vacinal ou diagnóstico. / Mycoplasma hyopneumoniae is a bacterium that belongs to the Mollicutes class, being the etiological agent of porcine enzootic pneumoniae and one of the primary agents of the porcine respiratory disease complex (PRDC). Signal peptidase I (SPase I) is a membrane-bound endopeptidase that cleaves the signal peptide (SP) of proteins exported by the general secretory pathway. The M. hyopneumoniae SPase I (MhSPase I) is coded by the sipS gene in all of the three M. hyopneumoniae genomes sequenced. The aims of this work are to functional and immunologically characterize the MhSPase I and to investigate its relation with the virulence of the bacterium. The sipS coding DNA sequence (CDS) was demonstrated to be part of an operon, being co-transcribed along with 4 other CDSs. The sipS CDS was cloned and the recombinant MhSPase I (rMhSPase I) was expressed in Escherichia coli. The rMhSPase I was highly immunogenic for mice and the antigenicity for pigs was demonstrated. The observed differential expression of MhSPase I between pathogenic strains and one non pathogenic strain of M. hyopneumoniae corroborates the notion of MhSPase I as a virulence factor. Amino acid sequence analyses of MhSPase I and SPases I from other Mycoplasma and PRDC bacteria evidenced low conservation between these enzymes. The potential serodiagnosis application of rMhSPase I was demonstrated by an ELISA. In silico predictions of putative SPs cleaved by MhSPase I were performed, indicating that hypothetical and membrane proteins, including adhesins, have cleavable SPs. In vitro cleavage assays of rMhSPase I were developed with synthetic SPs, but the results were not conclusive. Further studies should elucidate the role of SPase I in the exportation of proteins in M. hyopneumoniae and the putative application of MhSPase I as an antigen for vaccination and diagnosis.

Mycoplasma hyopneumoniae é uma bactéria pertencente à classe Mollicutes, sendo o agente etiológico da pneumonia enzoótica suína e o agente primário do complexo de doenças respiratórias de suínos (CDRS). A sinal-peptidase I (SPase I) é uma endopeptidase de membrana que cliva os peptídeos-sinal (PS) de proteínas transportadas pelo sistema geral de secreção. A SPase I do M. hyopneumoniae (MhSPase I) é codificada pela sequência de DNA codificadora (CDS) sipS, presente nas 3 linhagens da espécie com genomas já sequenciados. Este trabalho tem como objetivo caracterizar funcional e imunologicamente a MhSPase I, assim como investigar a sua relação com a virulência da bactéria. Foi demonstrado que sipS é parte de um operon, sendo cotranscrita com outras 4 CDSs. A CDS sipS foi clonada e a MhSPase I recombinante (rMhSPase I) foi expressa em Escherichia coli. A rMhSPase I mostrou-se altamente imunogênica para camundongos e seu caráter antigênico foi confirmado para suínos. A MhSPase I apresentou expressão diferencial em linhagens patogênicas e não patogênicas de M. hyopneumoniae corroborando a ideia de que essa enzima é um fator de virulência da bactéria. Análises de sequências de aminoácidos evidenciaram que a MhSPase I tem baixa identidade com enzimas ortólogas de outras espécies de micoplasmas e de bactérias relacionadas ao CDRS. O potencial sorodiagnóstico da rMhSPase I foi demonstrado em um ELISA. Predições in silico de possíveis PSs clivados pela MhSPase I indicaram que proteínas hipotéticas e proteínas de membrana, incluindo adesinas, seriam substratos da enzima. Ensaios de atividade in vitro com PSs sintéticos derivados de predições in silico, contudo, não foram conclusivos. Estudos futuros deverão elucidar o papel da SPase I na exportação de proteínas em M. hyopneumoniae e explorar o potencial da enzima como antígeno vacinal ou diagnóstico. / Mycoplasma hyopneumoniae is a bacterium that belongs to the Mollicutes class, being the etiological agent of porcine enzootic pneumoniae and one of the primary agents of the porcine respiratory disease complex (PRDC). Signal peptidase I (SPase I) is a membrane-bound endopeptidase that cleaves the signal peptide (SP) of proteins exported by the general secretory pathway. The M. hyopneumoniae SPase I (MhSPase I) is coded by the sipS gene in all of the three M. hyopneumoniae genomes sequenced. The aims of this work are to functional and immunologically characterize the MhSPase I and to investigate its relation with the virulence of the bacterium. The sipS coding DNA sequence (CDS) was demonstrated to be part of an operon, being co-transcribed along with 4 other CDSs. The sipS CDS was cloned and the recombinant MhSPase I (rMhSPase I) was expressed in Escherichia coli. The rMhSPase I was highly immunogenic for mice and the antigenicity for pigs was demonstrated. The observed differential expression of MhSPase I between pathogenic strains and one non pathogenic strain of M. hyopneumoniae corroborates the notion of MhSPase I as a virulence factor. Amino acid sequence analyses of MhSPase I and SPases I from other Mycoplasma and PRDC bacteria evidenced low conservation between these enzymes. The potential serodiagnosis application of rMhSPase I was demonstrated by an ELISA. In silico predictions of putative SPs cleaved by MhSPase I were performed, indicating that hypothetical and membrane proteins, including adhesins, have cleavable SPs. In vitro cleavage assays of rMhSPase I were developed with synthetic SPs, but the results were not conclusive. Further studies should elucidate the role of SPase I in the exportation of proteins in M. hyopneumoniae and the putative application of MhSPase I as an antigen for vaccination and diagnosis.

Genomas reduzidos de bactérias apresentam-se como complexos sistemas evolutivos, evidenciando diferentes propriedades genômicas de acordo com o nicho ocupado por cada organismo. Em bactérias simbiontes, genomas reduzidos apresentam uma grande estabilidade em relação a rearranjos e taxas mutacionais em comparação com genomas reduzidos de bactérias parasitas. Dentre as espécies parasitas com genoma reduzido, Mycoplasma hyopneumoniae distingue-se por apresentar, em diferentes cepas, genomas com características específicas dentro da classe Mollicutes, incluindo maior taxa mutacional, e freqüência de rearranjos. Através do desenvolvimento de um método quantitativo para avaliar a preferência de disposição preferencial de genes nas fitas senso e anti-senso de genomas de procariotos, foi possível avaliar comparativamente a estrutura genômica de espécies bacterianas em 8 filos de procariotos. Os resultados dessa análise indicam que dentre os genomas analisados as espécies de Mollicutes do grupo hominis são as que possuem a maior desorganização estrutural em relação à colocação preferencial de genes nas fita senso e anti-senso, enquanto que as espécies do grupo pneumoniae apresentam valores intermediários, o que se correlaciona com a maior sintenia observada entre genomas nesse grupo. Uma análise em grande escala de mutações sinônimas e não-sinônimas em 7 grupos de genomas reduzidos indica a ocorrência de evolução positiva em uma série de genes possivelmente relacionados a patogenicidade. Com base em dados comparativos de rearranjos, presença de recombinação, transferência horizontal e elevadas taxas de mutações sinônimas sobre não-sinônimas, um novo modelo de evolução de genomas reduzidos de parasitas foi proposto. No modelo, sugere-se que, ao contrário dos genomas de bactérias simbiontes, a redução genômica em bactérias parasitas caracteriza-se por um processo altamente turbulento, no qual a constante geração de variabilidade é um ponto crítico para o sucesso da estratégia de colonização do hospedeiro. / Reduced genomes present an interesting evolutionary system, showing different genomic properties accordingly their lifestyle as parasites or symbionts. In symbiont bacteria, reduced genomes present a great stability regarding rearrangements and mutational rates comparing with reduced genomes from parasite bacteria. Among these species, the Mycoplasma hyopneumoniae genome distinguish itself by presenting specific characteristics inside the Mollicutes class, including higher mutational and rearrangements rates. Through the development of a quantitative method of gene strand bias, was possible a comparative analysis of 8 bacterial phyla. The results of such analysis indicated that genomes of Mollicutes bacteria from the hominis group possess the most disordered genomes regarding gene position on the leading or lagging chromosome strand, while genomes from bacteria of the pneumoniae group have intermediary values, in agreement with the higher sinteny between the genomes in this group. A large-scale analysis of synonymous and non synonymous mutations in 7 groups of reduced genome bacteria determined positive evolution in several genes related to pathogenicity. Based in comparative data from rearrangements, recombination, horizontal transfer and high synonymous over non-synonymous mutational rates, a new model of evolution for parasite species with reduced genomes is proposed. In this model is suggested that, in opposition with symbionts bacteria, genome reduction of parasite prokaryotes is characterized by a high turbulent process, where the constant variability generation is a critical point for the success of the host colonization.

A bactéria Mycoplasma hyopneumoniae é o agente etiológico da pneumonia micoplásmica suína (PMS) e tem sido descrita em diversos países como um dos patógenos mais comumente envolvidos em problemas respiratórios dos suínos, causando importantes perdas econômicas. Os métodos de uso corrente para a identificação de M. hyopneumoniae, sejam eles baseados em técnicas imunológicas, no cultivo e isolamento do agente etiológico ou em métodos moleculares, apresentam diversas limitações. Além disso, as vacinas para PMS oferecem apenas proteção parcial. A identificação e a caracterização imunológica e funcional de proteínas da bactéria, especialmente aquelas preferencial ou exclusivamente expressas em cepas patogênicas, pode trazer avanços importantes no conhecimento da biologia da bactéria e da interação entre patógeno e hospedeiro. Podem também, trazer melhorias para o imunodiagnóstico da PMS, em termos de aumento da especificidade e da sensibilidade dos testes utilizados, e melhorias no aspecto imunoprotetor das vacinas atualmente disponíveis. Com a disponibilização das seqüências do genoma das cepas 232, J e 7448 de M. hyopneumoniae foi possível à realização de uma análise comparativa das seqüências entre a linhagem não-patogênica (J) e os isolados patogênicos (232 e 7448), visando à identificação de genes que codificam proteínas determinantes de patogenicidade e/ou com potencial para utilização em imunodiagnóstico e/ou vacinação. Foram identificadas 118 seqüências codificadores de proteínas (CDSs), entre elas, estão, por exemplo, componentes de membrana com variações evidentes entre as linhagens e prováveis fatores de virulência. Nesta análise, foi também feita a identificação preliminar de 22 repetições nucleotídicas variáveis em tandem (VNTRs) em 12 CDSs correspondentes a lipoproteínas, antígenos, adesinas e outros fatores de virulência das cepas J, 7448 e 232. A análise destas VNTRs no genoma de M. hyopneumoniae foi estendida de modo a incluir duas outras cepas de M. hyopneumoniae (7422 e PMS). O grau de variabilidade entre cepas, o possível significado biológico destas variações e seu potencial para ser utilizado como base em um ensaio de PCR foram investigados. As VNTRs identificadas codificam para proteínas com variações no número de repetições de aminoácidos (VNTARs) que podem determinar variações estruturais, físico-químicas e antigênicas nas proteínas correspondentes, previstas in silico. Um PCR baseado nestas VNTRs foi proposto para identificação de cepas de M. hyopneumoniae a campo. Além disso, como parte de uma estratégia para a produção de reagentes imunodiagnósticos da PMS, clones das CDS p36 e NrdF de M. hyopneumoniae foram expressos e suas proteínas recombinantes purificadas. Dentre os dois soros policlonais monoespecíficos produzidos em coelhos, o soro anti-p36 apresentou uma menor reação inespecífica em ensaios de imuno-histoquímica do que o soro controle utilizado. As proteínas recombinantes purificadas, os anti-soros produzidos, juntamente com novos antígenos, dentre os possíveis identificados neste trabalho, além do VNTR-PCR proposto, poderão ser de valia para o monitoramento sanitário de rebanhos suínos quanto à presença assintomática de M. hyopneumoniae e a identificação mais precisa deste patógeno. / Mycoplasma hyopneumoniae is the etiologic agent of mycoplasmal pneumonia of swines (MPS) and it is one of the most commonly found pathogens in respiratory tract of swines worldwide, causing important economic losses. The diagnostic methods currently available for M. hyopneumoniae identification are based on immunological techniques, culture and isolation of the etiologic agent or molecular methods, all of them presenting peculiar limitations. Regarding control methods, the vaccines currently available for MPS offer only partial protection. The identification and the immunological and functional characterization of mycoplasmal proteins, especially those preferentially expressed in pathogenic strains, can help in the understanding of this bacterium’s biology as well as its host-pathogen interaction. Another important outcome of such studies would be increasing the specificity and sensitivity of the immunodiagnostic tests for MPS and improvements in the immune protection of currently available vaccines. The availability of the complete genome sequences of M. hyopneumoniae strains 232, J and 7448 became feasible a comparative analysis between the non-pathogenic strain (J) and the pathogenic ones (232 and 7448), focusing at the identification of gene products related to pathogenicity and/or presenting a potential for use in immunodiagnostic and/or vaccination. In this work we report the identification of 118 CDSs encoding putative virulence factors, which were based on specific criteria including predicted cell surface location, variations between strains, previous functional studies showing antigenicity or possible involvement in host-pathogen interaction. Using this analysis it was possible to identify 22 variable number of tandem nucleotides repeats (VNTRs) in 12 CDSs corresponding to lipoproteins, antigens, adhesins and other virulence factors of strains J, 7448 and 232. The analysis of these VNTRs from M. hyopneumoniae genome was further extended, including two others M. hyopneumoniae strains (7422 and PMS). The degree of variability between strains, the possible biological meaning of these variations and their potential to be used as VNTR-based PCR had been investigated. The identified VNTRs codes for proteins with variations in the number of amino acid repeats (VNTARs) that determine structural, physicochemical and antigenic variations in the corresponding proteins, as predicted in silico. As part of a strategy for the production of immunodiagnostic reagents for MPS, recombinant clones of p36 and NrdF CDSs were expressed, the correspondent proteins purified and polyclonal sera were produced in rabbits. The anti-p36 protein sera presented a low background in an immunohistochemistry assay when compared to the control sera. In conclusion, taken together the recombinant proteins and anti-sera that were produced, the new putative antigens that were identified and the development of a VNTR-PCR, could be of value for the sanitary monitoring of swine herds, specialy for the identification of asymptomatic carriers of M. hyopneumoniae and in the establishment of more efficient, specific and sensitive MPS diagnostic methods.