Secondary metabolite production in explantate cultures of St. John's Wort Šárka Křížová Diploma thesis Charles University in Prague, Faculty of Pharmacy in Hradec Králové, Pharmacy Key words: St. John's Wort, elicitation, flavonoids, hydrogen peroxide, glutathion, neutral red. The goal of the diploma thesis was to influence the production of secondary metabolites (flavonoids) in explantate cultures of St. John's Wort. Method of elicitation was used. This method is based on adding of an elicitor (stressor) to the tissue culture. Suspensional and callus cultures of Hypericum Perforatum L. were used for experiments with potential elicitors: hydrogen peroxide, combination of hydrogen peroxide and Mg-ATP, glutathion and cellular pigment neutral red. Their effect to the production of flavonoids was evaluated after 4 and 24 hours. Cultures were cultivated on Murashige and Skoog medium with the addition of a growth hormone BAP and a growth stimulator α-NAO. HPLC method was used for analysis of the samples. Hydrogen peroxide raised the production of flavonoids, especially in suspensional cultures, in callus cultures the highest influence had glutathion (reduced form) and neutral red. The highest production of flavonoids was reached after 24 hours by addition of hydrogen peroxide in concentration 100 mg/l,...

Die Anwendung von Birkenblättern (Betulae folium) erfolgt zur Durchspülung der Harnwege. In der vorliegenden Arbeit wurde die Wirkungsweise der Birkenblätter auf verschiedenen Ebenen der Phytopharmakaforschung untersucht. Zunächst wurde in-vitro die Beeinflussung der Metallopeptidasen Neutrale Endopeptidase (NEP, EC 3.4.24.11), Angiotensin-Converting-Enzym (ACE, EC 3.4.15.1) und Leucin-Aminopeptidase (LAP, EC 3.4.11.2) durch Birkenblätterextrakte, -fraktionen und reine Naturstoffe untersucht. Die Auftrennung eines Methanol- und eines Ethylacetatextraktes führte nicht zur Gewinnung einzelner, für die Gesamtwirkungen der Extrakte verantwortlicher Fraktionen bzw. Komponenten. Die Eigenschaft der Flavonoide als wirksamkeitsmitbestimmende Inhaltsstoffe konnte jedoch bestätigt werden. Ein systematisches Screening von Flavonoiden ergab u.a., dass das Ausmaß der Enzymhemmung von der Anzahl der freien phenolischen OH-Funktionen bestimmt wurde und dass Flavonoidaglyka stärker die Enzyme hemmten, als die im Pflanzenmaterial vorliegenden Glykoside (IC50 NEP: Myricetin 42 Mikromol/L, Quercetin 192 Mikromol/L). Die in der Birkenrinde vorkommenden Triterpene Betulinsäure und Betulinol wurden als starke Inhibitoren der LAP erkannt (IC50 LAP: 7,3 +/- 1,4 bzw. 8,8 +/- 1,78 Mikromol/L). In einem nächsten Abschnitt der Arbeit wurden die Absorptionseigenschaften von Hyperosid und Rutin mit einem In-vitro-Perfusionsmodell am isolierten Rattendünndarm untersucht. Sowohl Rutin als auch Hyperosid traten unverändert als Glykoside durch den Darm in das Akzeptorkompartiment über. Auch in Form eines Birkenblätterextraktes wurde Hyperosid am Rattendünndarm absorbiert, der Extrakt veränderte jedoch nicht die Absorptionsrate. Als Mechanismus wurde der passive Transport durch die Poren der Tight junctions der Dünndarmzellen angenommen. Abschließend wurde eine Pilotstudie (n=14) durchgeführt, in der das ausgeschiedene Harnvolumen nach einmaliger Einnahme eines Birkenblättertees im Vergleich zu einer entsprechenden Menge Leitungswasser bestimmt wurde. Bei 50 % der Probanden wurde innerhalb der vierstündigen Testphase eine Zunahme der Harnproduktion beobachtet, bei den anderen 50 % stellte sich eine gegensätzliche Reaktion auf Tee und Placebo ein. Eine signifikante Erhöhung der Harnproduktion konnte somit, unter dem angegebenen Studiendesign, nicht nachgewiesen werden. / Irrigation of the urinary tract is the therapeutic indication for Birch leaf (Betulae folium). In the present thesis, effects and efficacy of Birch leaves were investigated in various fields of medicinal plant research. The effects of Birch leaf extracts, their fractions, and pure natural compounds on the metallopeptidases - Neutral Endopeptidase (NEP, EC 3.4.24.11), Angiotensin Converting Enzyme (ACE, EC 3.4.15.1), and Leucine Aminopeptidase (LAP, EC 3.4.11.2) - were investigated in vitro. Phytochemical separation of extracts obtained by methanol and ethyl acetate did not result in more active fractions compared to those of the whole extracts. The ability of flavonoids to contribute to the efficacy reached by Birch leaf extracts, could be confirmed. A systematic screening could show that the inhibitory potency of flavonoids is dependent on the number of phenolic hydroxyl functions in their chemical structure. Aglycones of flavonoids were more active than their corresponding glycosides occurring in the plant material (IC50 NEP: myricetin 42 mikromol/L, quercetin 192 mikromol/L). Betulinic acid and betulinol, triterpenes of the bark of Betula, inhibited LAP strongly by reaching an IC50 of 7,3 +/- 1,4 mikromol/L and 8,8 +/- 1,78 mikromol/L, respectively. Furthermore, this thesis showed the absorption profiles of hyperoside and rutin in an isolated small intestine model of the rat. Both glycosides were detected in the acceptor compartment without being metabolised. Administration of hyperoside by a Birch leaf extract did not influence the absorption rate. A passive transport through the pores of the tight junctions, localized between the intestinal cells, was considered to be the mechanism of absorption of the flavonol glycosides. Finally, a human pilot study (n=14) was carried out. The excreted urinary volume was determined after a single intake of a Birch leaf infusion or tap water. An increased urine output after 4 hours of the test period was found in 50% of the volunteers. In the contrary, an opposite effect was determined in 50% of the volunteers after administration of the herbal infusion and of a placebo solution. Thus, no significant increase of urine volume could be observed under these test conditions.