A NADPH oxidase participa da secreção de insulina estimulada pela glicose e da produção de superóxido nas ilhotas pancreáticas. Nesse estudo, avaliamos o efeito do ácido palmítico na produção de superóxido e secreção de insulina por ilhotas pancreáticas de ratas e linhagem INS-1E. O palmitato aumentou a produção de superóxido por mecanismo dependente da ativação da PKC e da NADPH oxidase e da oxidação do ácido graxo. O ácido graxo causou a translocação da p47PHOX para a membrana plasmática, processo indicativo da ativação do complexo enzimático. A exposição de ilhotas ao palmitato causou o aumento do conteúdo proteico da p47PHOX e do RNA mensageiro da p22PHOX, gp91PHOX, p47PHOX, pró-insulina e do GPR40. A estimulação da secreção de insulina pelo ácido graxo na presença de alta glicose foi reduzida através do inibidor da NADPH oxidase e também pela inibição da expressão do GPR40 por RNA de interferência. A atividade da NADPH oxidase e a sinalização via GPR40 são mecanismos envolvidos no controle da secreção de insulina estimulada pelo palmitato. / The NADPH oxidase complex is involved in the glucose-stimulated insulin secretion and the superoxide production in pancreatic islets. In this study, we examined the effect of palmitic acid on superoxide production and insulin secretion by rat pancreatic islets and INS-1E cells. Palmitate increased superoxide production in a process dependent on the activation of PKC, NADPH oxidase and fatty acid oxidation. In fact, palmitate caused p47PHOX translocation to the plasma membrane. Exposure to palmitate for 1 h up-regulated the protein content of p47PHOX and the mRNA levels of p22PHOX, gp91PHOX, p47PHOX, proinsulin and the GPR40. Fatty acid stimulation of insulin secretion in the presence of a high glucose concentration was reduced by the inhibition of NADPH oxidase activity and by the inhibition of GPR40 expression by a small interference RNA. In conclusion, NADPH oxidase is an important source of palmitate-induced superoxide production in beta cells. The NADPH oxidase activity and GPR40 signaling are involved in the control of insulin secretion by palmitate.

A crescente incidência de disfunções metabólicas, como resistência à insulina e diabetes mellitus tipo 2 (T2DM), está correlacionada com a elevação da ocorrência de obesidade e sobrepeso. Em busca da melhora da saúde e de um corpo ideal segundo os padrões estéticos propagados atualmente, um número cada vez maior de indivíduos adere às dietas da moda que prometem rápida redução do peso corporal, ao invés de adotar uma alimentação balanceada e a prática regular de exercícios físicos. Uma dieta bastante divulgada e até recomendada por profissionais da saúde é o jejum intermitente (JI), que consiste em alternar períodos de jejum de até 24 horas com períodos de ingestão alimentar. Diversos estudos experimentais têm relatado alterações metabólicas em consequência do JI, como modificações da glicemia e da tolerância à glicose, porém, os resultados encontrados na literatura são conflitantes e, além disso, o impacto do jejum intermitente, em longo prazo, sobre as ilhotas pancreáticas ainda não foi devidamente elucidado. Desta forma, o presente estudo teve como objetivo caracterizar os impactos de doze semanas de JI em ratas Wistar. Para tal, ratas Wistar com 30 dias de idade foram distribuídas aleatoriamente em dois grupos: controle, com livre acesso à ração balanceada; e jejum intermitente, submetido a 24 horas de jejum intercalado com 24 horas de livre acesso à ração balanceada. Foi observado que os animais submetidos ao JI, apresentaram menor ganho de peso corporal, redução do comprimento da tíbia e da distância naso-anal, e alteração da composição corporal, incluindo diminuição da massa muscular e aumento do tecido adiposo. Em média, o consumo de ração do grupo JI foi menor, porém, no dia que era disponibilizado alimento, os animais apresentaram hiperfagia o que resultou em grande aumento das dimensões do estômago. O jejum intermitente reduziu os valores plasmáticos do colesterol total, triglicérides, LDL, HDL e glicemia, e aumentou a concentração basal da insulina plasmática, bem como a secreção da insulina após o estímulo com glicose. Foi observada redução significativa da massa de ilhotas pancreáticas e aumento da porcentagem de células dispersas de ilhotas em apoptose. Ainda nas células dispersas de ilhotas pancreáticas, houve aumento do conteúdo de espécies reativas de oxigênio mitocondrial e total, e do peróxido de hidrogênio (H2O2), além de aumento da expressão do sistema antioxidante. Assim, nossos dados sugerem que esse protocolo estudado de 24 horas de jejum intercalados com 24 horas de alimentação à vontade não seja saudável em longo prazo. Mais estudos em longo prazo são necessários para investigar qual seria o melhor protocolo de jejum intermitente de forma a reduzir os efeitos colaterais e melhorar a saúde, para então o JI ser considerado uma boa alternativa para perda e manutenção do peso. / The increasing incidence of metabolic dysfunctions, such as insulin resistance and type 2 diabetes mellitus (T2DM), is correlated with increased occurrence of obesity and overweight. In pursuit of improved health and an ideal body according to today\'s aesthetic standards, an increasing number of individuals adhere to fad diets that promise a rapid reduction of body weight, instead of adopting a balanced diet and regular practice of physical exercises. A well-publicized diet and even recommended by health professionals is intermittent fasting (IF), which consists of alternating fasting periods of up to 24 hours with periods of food intake. Several experimental studies have reported metabolic changes as a consequence of IF, such as changes in glucose and glucose tolerance, but the results found in the literature are conflicting and, in addition, the impact of intermittent fasting in the long term on pancreatic islets has not yet been properly elucidated. Thus, the present study aimed to characterize the effects of twelve-week IF on Wistar rats. For this, 30-day-old Wistar rats were randomly assigned to two groups: control, with free access to balanced chow; and intermittent fasting, subjected to 24-hour fast intercalated with 24 hours of free access to the balanced chow. It was observed that the animals submitted to IF presented lower body weight gain, reduced tibia length and naso-anal distance, and altered body composition, including decreased muscle mass and increased adipose tissue. On average, the dietary intake of the IF group was lower, but on the day that food was available, the animals presented hyperphagia which resulted in a large increase in the stomach size. Intermittent fasting reduced plasma levels of total cholesterol, triglycerides, LDL, HDL, and glycaemia, and increased basal plasmatic insulin level, as well as insulin secretion after stimulation with glucose. We observed significant reduction in pancreatic islet mass and increase in percentage of islet-dispersed cells in apoptosis. Still in islet-dispersed cells, there was an increase in mitochondrial and total reactive oxygen species content, and of hydrogen peroxide (H2O2), in addition to an increase in expression of antioxidant system. Thus, our data suggest that this protocol of 24-hour fasting intercalated with 24-hour feed at will is not healthy in the long run. More long-term studies are needed to investigate the best intermittent fasting protocol in order to reduce side effects and improve health, so IF be considered a good alternative for weight loss and maintenance.

O diabetes mellitus tipo 1 é uma doença autoimune causada pela destruição das células β produtoras de insulina, presentes nas ilhotas pancreáticas, por células autorreativas do sistema imune. A opção de tratamento mais utilizada são injeções diárias de insulina exógena, o que configura um tratamento não curativo. Para alcançar a independência de insulina, alternativas como o transplante de ilhotas vêm sendo estudadas. Entretanto, a disponibilidade de pâncreas de doadores cadavéricos para o isolamento destas ilhotas é pequena e os métodos de isolamento, pouco eficazes, sendo necessários de 2 a 4 doadores para atingir o número adequado de ilhotas. Além disso, o transplante apresenta problemas relacionados à enxertia, devidos principalmente à baixa vascularização, o que leva à morte de células β nos primeiros dias pós-transplante. Desta forma, estudos explorando alternativas que aumentem a sobrevivência e a funcionalidade dos transplantes e diminuam o número de ilhotas exigido por receptor fazem-se muito necessários. As células-tronco mesenquimais apresentam propriedades interessantes para aplicação em terapia celular. Entre elas, destaca-se o efeito parácrino, que exerce diversas funções benéficas, como o aumento da vascularização, nos locais onde estas células estão presentes. Sendo assim, este trabalho explorou o co-transplante de ilhotas pancreáticas com células-tronco mesenquimais derivadas de tecido adiposo, para o tratamento do diabetes mellitus em modelo murino. Os resultados mostraram que a presença destas células no grupo que recebeu o co-transplante não aumentou a taxa de cura, em relação ao grupo que recebeu somente ilhotas. No entanto, o fenômeno de reversão do diabetes foi antecipado no grupo co-transplantado, o que sugere um possível efeito angiogênico das células-tronco adiposo-derivadas presentes neste grupo. Desta forma, conclui-se que estas células podem exercer atividades benéficas, quando co-transplantadas com ilhotas pancreáticas, para o tratamento do diabetes. / Type 1 diabetes mellitus is an autoimmune disease caused by destruction of insulin-producing β cells, present in pancreatic islets, by auto-reactive cells of the immune system. The most widely used treatment option are daily injections of insulin, which configures a non-curative treatment. To achieve insulin independence, alternatives such as islet transplantation have been studied. However, the availability of pancreas from cadaveric donors for the isolation of these islets is poor and the methods for isolation, ineffective, requiring 2 to 4 donors to achieve the appropriate number of islets. In addition, transplantation presents problems related to engraftment, mainly due to poor vascularization, which leads to β cell death in the first days after transplantation. Thus, studies exploring alternatives that increase the survival and function of transplants and reduce the number of islets required by the recipient are very necessary. Mesenchymal stem cells have interesting properties for application in cell therapy. Among them is the paracrine effect, which has several beneficial functions, such as promoting vascularization in the tissues where these cells are present. Thus, the present study explored the co-transplantation of pancreatic islets with mesenchymal stem cells derived from adipose tissue for the treatment of diabetes mellitus in mice. The results showed that the presence of these cells in the group that received co-transplantation did not increase the cure rate, compared to the group that received islets alone. However, the phenomenon of diabetes reversion was anticipated in co-transplanted animals, which suggests a possible angiogenic effect of adipose-derived stem cells present in this group. Thus, we conclude that these cells may exert beneficial functions when co-transplanted with pancreatic islets for the treatment of diabetes.

O transplante de ilhotas pancreáticas restabelece a secreção de insulina em pacientes diabéticos tipo 1 lábil. A despeito dos avanços da técnica de isolamento de ilhotas, a inabilidade de se obter um número suficiente de células de um único doador persiste como um obstáculo para o sucesso desse transplante. A identificação dos fatores relacionados com o dano das ilhotas pancreáticas durante todo o procedimento do transplante tem sido buscada na tentativa de desenvolver terapias capazes de minimizar a perda de células e otimizar a enxertia das ilhotas transplantadas, reduzindo, assim, a necessidade de múltiplos doadores para o alcance da independência de insulina. A morte encefálica (ME) está associada a uma inflamação sistêmica que produz profundas alterações fisiológicas na condição hemodinâmica do doador, antes mesmo do início do processo de retirada dos órgãos. Essa característica única do doador cadavérico influencia negativamente a função dos órgãos pós-transplante, o que torna os cuidados com o doador uma peça chave no cenário dos transplantes de órgãos. Contudo, o uso de protocolos com terapias específicas, como a reposição de hormônios tireoidiano e suprarrenal, tem demonstrado eficácia muito limitada em melhorar os desfechos de órgãos transplantados. Os resultados desta pesquisa demonstram que marcadores inflamatórios estão aumentados no estado de ME. A precipitação da ME é seguida de um aumento das concentrações de fator de necrose tumoral-α (TNF-α) e interleucina-6 (IL-6) no sangue e de TNF-α no tecido pancreático, mas não de fator tecidual (FT), cuja expressão já conhecida em ilhotas isoladas provavelmente se deva a fatores de estresse relacionados ao isolamento das células. Esse aumento de TNF-α pode explicar, pelo menos em parte, os melhores desfechos alcançados por protocolos de transplante de ilhotas que incluem o uso de receptores solúveis do TNF-α. Em conclusão, a ME está associada a um aumento da expressão de TNF-α no sangue e no tecido pancreático humano. Portanto, o uso de terapias anti-inflamatórias dirigidas ao doador de múltiplos órgãos pode tornar-se uma estratégia promissora para melhorar os resultados dos transplantes de ilhotas.

O diabetes mellitus tipo 1 é uma doença autoimune causada pela destruição das células β produtoras de insulina, presentes nas ilhotas pancreáticas, por células autorreativas do sistema imune. A opção de tratamento mais utilizada são injeções diárias de insulina exógena, o que configura um tratamento não curativo. Para alcançar a independência de insulina, alternativas como o transplante de ilhotas vêm sendo estudadas. Entretanto, a disponibilidade de pâncreas de doadores cadavéricos para o isolamento destas ilhotas é pequena e os métodos de isolamento, pouco eficazes, sendo necessários de 2 a 4 doadores para atingir o número adequado de ilhotas. Além disso, o transplante apresenta problemas relacionados à enxertia, devidos principalmente à baixa vascularização, o que leva à morte de células β nos primeiros dias pós-transplante. Desta forma, estudos explorando alternativas que aumentem a sobrevivência e a funcionalidade dos transplantes e diminuam o número de ilhotas exigido por receptor fazem-se muito necessários. As células-tronco mesenquimais apresentam propriedades interessantes para aplicação em terapia celular. Entre elas, destaca-se o efeito parácrino, que exerce diversas funções benéficas, como o aumento da vascularização, nos locais onde estas células estão presentes. Sendo assim, este trabalho explorou o co-transplante de ilhotas pancreáticas com células-tronco mesenquimais derivadas de tecido adiposo, para o tratamento do diabetes mellitus em modelo murino. Os resultados mostraram que a presença destas células no grupo que recebeu o co-transplante não aumentou a taxa de cura, em relação ao grupo que recebeu somente ilhotas. No entanto, o fenômeno de reversão do diabetes foi antecipado no grupo co-transplantado, o que sugere um possível efeito angiogênico das células-tronco adiposo-derivadas presentes neste grupo. Desta forma, conclui-se que estas células podem exercer atividades benéficas, quando co-transplantadas com ilhotas pancreáticas, para o tratamento do diabetes. / Type 1 diabetes mellitus is an autoimmune disease caused by destruction of insulin-producing β cells, present in pancreatic islets, by auto-reactive cells of the immune system. The most widely used treatment option are daily injections of insulin, which configures a non-curative treatment. To achieve insulin independence, alternatives such as islet transplantation have been studied. However, the availability of pancreas from cadaveric donors for the isolation of these islets is poor and the methods for isolation, ineffective, requiring 2 to 4 donors to achieve the appropriate number of islets. In addition, transplantation presents problems related to engraftment, mainly due to poor vascularization, which leads to β cell death in the first days after transplantation. Thus, studies exploring alternatives that increase the survival and function of transplants and reduce the number of islets required by the recipient are very necessary. Mesenchymal stem cells have interesting properties for application in cell therapy. Among them is the paracrine effect, which has several beneficial functions, such as promoting vascularization in the tissues where these cells are present. Thus, the present study explored the co-transplantation of pancreatic islets with mesenchymal stem cells derived from adipose tissue for the treatment of diabetes mellitus in mice. The results showed that the presence of these cells in the group that received co-transplantation did not increase the cure rate, compared to the group that received islets alone. However, the phenomenon of diabetes reversion was anticipated in co-transplanted animals, which suggests a possible angiogenic effect of adipose-derived stem cells present in this group. Thus, we conclude that these cells may exert beneficial functions when co-transplanted with pancreatic islets for the treatment of diabetes.

O transplante de ilhotas pancreáticas restabelece a secreção de insulina em pacientes diabéticos tipo 1 lábil. A despeito dos avanços da técnica de isolamento de ilhotas, a inabilidade de se obter um número suficiente de células de um único doador persiste como um obstáculo para o sucesso desse transplante. A identificação dos fatores relacionados com o dano das ilhotas pancreáticas durante todo o procedimento do transplante tem sido buscada na tentativa de desenvolver terapias capazes de minimizar a perda de células e otimizar a enxertia das ilhotas transplantadas, reduzindo, assim, a necessidade de múltiplos doadores para o alcance da independência de insulina. A morte encefálica (ME) está associada a uma inflamação sistêmica que produz profundas alterações fisiológicas na condição hemodinâmica do doador, antes mesmo do início do processo de retirada dos órgãos. Essa característica única do doador cadavérico influencia negativamente a função dos órgãos pós-transplante, o que torna os cuidados com o doador uma peça chave no cenário dos transplantes de órgãos. Contudo, o uso de protocolos com terapias específicas, como a reposição de hormônios tireoidiano e suprarrenal, tem demonstrado eficácia muito limitada em melhorar os desfechos de órgãos transplantados. Os resultados desta pesquisa demonstram que marcadores inflamatórios estão aumentados no estado de ME. A precipitação da ME é seguida de um aumento das concentrações de fator de necrose tumoral-α (TNF-α) e interleucina-6 (IL-6) no sangue e de TNF-α no tecido pancreático, mas não de fator tecidual (FT), cuja expressão já conhecida em ilhotas isoladas provavelmente se deva a fatores de estresse relacionados ao isolamento das células. Esse aumento de TNF-α pode explicar, pelo menos em parte, os melhores desfechos alcançados por protocolos de transplante de ilhotas que incluem o uso de receptores solúveis do TNF-α. Em conclusão, a ME está associada a um aumento da expressão de TNF-α no sangue e no tecido pancreático humano. Portanto, o uso de terapias anti-inflamatórias dirigidas ao doador de múltiplos órgãos pode tornar-se uma estratégia promissora para melhorar os resultados dos transplantes de ilhotas.

Acredita-se que a diminuição progressiva da massa de células observada durante a evolução do diabetes mellitus tipo 2 (DM 2) ocorra por apoptose deste tipo celular. As tiazolidinedionas (TZDs), uma classe de medicamentos utilizada no tratamento do DM 2, atuam como ligantes dos receptores ativados por proliferadores de peroxissomos (PPAR) e e promovem diminuição da resistência periférica à insulina. Embora existam estudos controversos, tem se especulado que as TZDs possam exercer efeitos diretos sobre as células pancreáticas, prevenindo a perda por apoptose e melhorando a sua viabilidade. O objetivo deste estudo foi avaliar os efeitos diretos da Pioglitazona (PIO) na concentração de 10 M sobre a viabilidade funcional e o índice de apoptose de ilhotas pancreáticas isoladas de ratos Wistar expostas a concentrações fisiológica (5,6 mM) e suprafisiológica (23 mM) de glicose durante 24, 48 e 72 horas. A viabilidade funcional foi avaliada pela análise da secreção de insulina estimulada por glicose e do conteúdo total de insulina nas ilhotas. O índice de apoptose foi avaliado pela medida da fragmentação do DNA, da expressão do RNAm dos genes Bcl2 (anti-apoptótico) e Bax (pró-apoptótico) e da atividade proteolítica da caspase-3 em ilhotas tratadas e não tratadas com a PIO. Em 5,6 mM de glicose, não se observou efeito significativo sobre a secreção de insulina, mas a avaliação do conteúdo total de insulina evidenciou uma diminuição transitória nas ilhotas tratadas com PIO por 24 horas, seguida por um aumento no conteúdo de insulina quando as ilhotas foram cultivadas por 48 e 72 horas em presença da droga. Em relação à avaliação da apoptose, observou-se uma diminuição na expressão do RNAm do gene Bax nas ilhotas tratadas com PIO por 24 horas, entretanto, após 48 e 72 horas, houve um aumento da expressão do RNAm deste gene nas ilhotas tratadas com a droga. Não foram observadas diferenças estatisticamente significativas na expressão do RNAm do gene Bcl2 em nenhum dos tempos estudados e a avaliação da apoptose determinada pela medida da fragmentação do DNA somente demonstrou uma diminuição do índice de apoptose após 48 horas de tratamento com a PIO. Em 23 mM de glicose, a PIO promoveu um aumento transitório na secreção de insulina estimulada por glicose e no conteúdo total de insulina (após 48 horas), no entanto, após 72 horas, observou-se diminuição significativa no conteúdo total de insulina. Em relação à apoptose, o tratamento com PIO determinou um aumento do índice de apoptose medido pela fragmentação do DNA e da atividade proteolítica da caspase-3 após 48 e 72 horas e uma diminuição da expressão do RNAm do gene Bcl2 nos tempos 24 e 48 horas. Os resultados do presente estudo sugerem que os efeitos diretos da PIO sobre as ilhotas pancreáticas murídeas em cultura variam de acordo com a concentração de glicose a qual as ilhotas estão expostas: em concentração fisiológica de glicose, a PIO parece exercer efeitos diretos benéficos, enquanto em concentração suprafisiológica de glicose, ela exerce efeitos diretos deletérios sobre a viabilidade funcional e o índice de apoptose de ilhotas pancreáticas murídeas em cultura. / The progressive decrease in -cell mass observed during the evolution of type 2 diabetes (T2DM) is believed to occur due to cell apoptosis. Thiazolidinediones (TZDs), a class of agents used for the treatment T2DM, act as ligands of the peroxisome proliferator-activated receptor (PPAR) and and decrease peripheral insulin resistance. Although still controversial, some studies have shown a direct effect of TZDs on pancreatic -cell, preventing cell loss due to apoptosis and improving their viability. The objective of this study was to evaluate the direct effects of 10 M Pioglitazone (PIO) on functional viability and apoptosis rate of islets isolated from Wistar rats exposed to physiological (5.6 mM) and supraphysiological (23 mM) glucose concentrations during 24, 48 and 72 hours. The functional viability was evaluated by the analysis of insulin secretion after glucose challenge and of islet total insulin content. Apoptosis rate was evaluated by measurement of DNA fragmentation, of Bcl2 (antiapoptotic) and Bax (proapoptotic) mRNA expression and of proteolytic activity of caspase-3 in pancreatic islets treated or not with PIO. At 5.6 mM glucose concentration, no significant effects in insulin secretion were observed, while a transitory decrease (after 24 hours) followed by an increase in total insulin content was observed in islets treated with PIO for 48 and 72 hours. Regarding apoptosis, a lower expression of Bax mRNA was detected in islets treated with PIO for 24 hours, followed, however, by an increase in the expression of this gene after 48 and 72 hours of drug exposition. PIO treatment did not promote significant changes in Bcl2 mRNA expression, while decreased the apoptosis rate measured by DNA fragmentation only after 48 hours of exposition. At 23 mM glucose concentration, PIO treatment elicited a transitory increase in insulin secretion after glucose challenge and in islet total insulin content after 48 hours followed by a decrease in the islet total insulin content after 72 hours. Concerning apoptosis, PIO treatment determined an increase in the apoptose rate measured by DNA fragmentation and by proteolytic activity of caspase-3 after 48 and 72 hours and a decrease in Bcl2 mRNA expression after 24 and 48 hours. These findings suggest that the direct effects of PIO on pancreatic islets depend on glucose concentration to which they are exposed: while under physiological glucose concentration the direct effects seem to be beneficial, under supraphysiological glucose concentration, PIO exerts direct deleterious effects on the functional viability and on the apoptosis rate of murine pancreatic islets.

As complicações relacionadas ao diabetes mellitus estão intimamente ligadas à hiperglicemia. Os pacientes que evoluem com grande instabilidade metabólica e progressão das complicações microvasculares apesar do tratamento intensivo com insulina são candidatos ao transplante de pâncreas. Neste contexto, o transplante de ilhotas pancreáticas surge como alternativa por ser menos invasivo e menos imunogênico. No entanto, o processo de digestão do pâncreas e isolamento das ilhotas pancreáticas expõe as células endócrinas a diversos estímulos nocivos, que resultam em diminuição da viabilidade das células isoladas e menor chance de sucesso após o transplante. A geração de espécies reativas de oxigênio (ERO) e o consumo das defesas anti-oxidantes durante o processo de digestão do pâncreas pode contribuir para a perda da viabilidade das ilhotas isoladas. O objetivo deste estudo foi avaliar o impacto da suplementação com glutationa etil mono-éster (GEE), um éster de melhor biodisponibilidade da glutationa (um importante anti-oxidante endógeno) nos resultados do isolamento e do transplante de ilhotas pancreáticas em um modelo animal. GEE foi adicionada na concentração de 10 mM na solução de colagenase durante o isolamento das ilhotas de rato. Após o isolamento, foram realizados estudos in vitro para avaliar a presença de ERO com o ensaio carboxi-H2DCFDA e a viabilidade das ilhotas isoladas com os ensaios JC-1 (integridade mitocondrial) e Sytogreen/brometo de etídio (integridade da membrana celular); viabilidade das células beta-pancreáticas por citometria de fluxo para avaliação de necrose e apoptose, TUNEL para a avaliação do índice de apoptose e secreção de insulina estimulada por glicose. Realizamos também estudos in vivo, com o transplante das ilhotas na cápsula renal de camundongos diabéticos, seguimento dos animais por 30 dias após o transplante e recuperação do enxerto para análise histológica. Quatro grupos de animais foram avaliados: 1) Animais transplantados com número suficiente de ilhotas para reverter o diabetes (500) não isoladas com GEE; 2) Animais transplantados com número suficiente de ilhotas (500) isoladas em presença de GEE; 3) Animais transplantados com número insuficiente de ilhotas (150) não isoladas com GEE e 4) Animais transplantados com número insuficiente de ilhotas (150) isoladas em presença de GEE. A suplementação com GEE na concentração de 10 mM durante o isolamento das ilhotas diminuiu a formação de ERO (Controle 57,0 ± 4,3% versus GEE 47,0 ± 3,9%, p = 0,0034) e aumentou a viabilidade das ilhotas, conforme demonstrado pelo ensaio Sytogreen/brometo de etídio (Controle 70,6 ± 3,4% versus GEE 83,6 ± 4,8%, p= 0,0010) e pela diminuição na porcentagem de células TUNEL-positivas (Controle de 39,2 ± 5,0% versus GEE 29,1 ± 1,9%, p= 0,042) no grupo tratado. O estudo de viabilidade por citometria de fluxo também mostrou um número maior de células beta pancreáticas viáveis no grupo tratado (Controle 21,4 ± 3,4% versus GEE 33,7 ± 3,9%, p= 0,0156). A manutenção da integridade funcional das ilhotas teve impacto nos resultados dos transplantes, com menor índice de célula TUNEL-positivas (Controle 23,3 ± 2,6% versus GEE 8,3 ± 0,8%, p < 0,0001) nos enxertos recuperados após as primeiras 24 horas do transplante e maior porcentagem de animais normoglicêmicos (Controle 30% versus GEE 65,2%, p = 0,004) após transplante de um número marginal de 150 ilhotas na cápsula renal após seguimento de 30 dias. Em conclusão, estes dados corroboram que a formação de ERO é uma causa relevante de dano celular durante o isolamento de ilhotas pancreáticas e sugerem que o uso do compostos anti-oxidante GEE pode ser uma estratégia para melhorar os resultados dos transplantes de ilhotas / The vascular complications related to Diabetes Mellitus are closely linked to hyperglycemia. Patients who develop metabolic instability and progression of microvascular complications despite intensive insulin therapy are candidates to pancreas transplantation. Pancreatic islet transplant is an alternative approach since it is less immunogenic and minimally invasive. However, the success of pancreatic islet transplantation still faces many challenges, mainly related to cell damage during the islet isolation process and early post-transplant period. The increase in reactive oxygen species (ROS) generation and the consumption of antioxidant defenses might be factors related to these injuries. The aim of the present study was to evaluate whether supplementation with glutathione-ethyl-ester (GEE), a compound with higher bioavailability than glutathione (an important endogenous antioxidant), could improve islet viability and efficacy in a marginal islet transplantation model in rodents. GEE was added to a final concentration of 10 mM in collagenase solution during islet isolation. After isolation, in vitro studies were conducted to evaluate the presence of ROS using carboxy-H2DCFDA assay and the viability of isolated islets with JC-1 assay (mitochondrial integrity), Sytogreen/ethidium bromide assay (cellular membrane integrity), fractional beta cell viability assay by flow cytometry, TUNEL assay for apoptosis evaluation and glucose-stimulated insulin secretion. We also performed in vivo studies with islet transplantation under the kidney capsule of diabetic mice, 30 days follow-up after transplantation and recovery of the graft for histological analysis. Four experimental groups were evaluated: 1) animals transplanted with 500 islets, a number considered sufficient to promote diabetes reversion, not isolated in presence of GEE; 2) animals transplanted with 500 islets isolated in presence of GEE; 3) animals transplanted with 150 islets, a number considered insufficient to promote diabetes reversion, not isolated in presence of GEE and 4) animals transplanted with 150 islets isolated in presence of GEE. The addition of GEE at 10 mM concentration during islet isolation was able to decrease ROS content in isolated islets (Control 57.0 ± 4.3% versus GEE 47.0 ± 3.9%, p = 0.0034) and increase islet viability, as demonstrated by the Sytogreen/ethidium bromide assay (Control 70.6 ± 3.4% versus GEE 83.6 ± 4.8%, p = 0.0010) as well as by the reduction in TUNEL-positive cells (Control 39.2 ± 5.0% versus GEE 29.1 ± 1.9%, p = 0.042) in the treated group. The fractional beta-cell viability also showed an improvement in the treated group (Control 21.4 ± 3.4% versus GEE 33.7 ± 3.9%, p = 0.0156). The improved cell viability observed in vitro was translated into better outcomes in vivo, since supplementation of GEE during the isolation process resulted in a significantly lower rate of TUNEL-positive cells (Control 23,3 ± 2,6% versus GEE 8,3 ± 0,8%, p < 0,0001) in the islet grafts recovered after 24h of transplantation and in a higher percentage of normoglycemia (Control 30% versus GEE 65,2%, p = 0,004) after 30 days of follow-up in animals transplanted with the marginal islet mass (150 islets). In conclusion, the current data corroborate that ROS production is a relevant cause of cellular damage during islet isolation and suggest that the use of GEE might be a strategy to improve islet transplantation outcomes

O transplante de ilhotas pancreáticas restabelece a secreção de insulina em pacientes diabéticos tipo 1 lábil. A despeito dos avanços da técnica de isolamento de ilhotas, a inabilidade de se obter um número suficiente de células de um único doador persiste como um obstáculo para o sucesso desse transplante. A identificação dos fatores relacionados com o dano das ilhotas pancreáticas durante todo o procedimento do transplante tem sido buscada na tentativa de desenvolver terapias capazes de minimizar a perda de células e otimizar a enxertia das ilhotas transplantadas, reduzindo, assim, a necessidade de múltiplos doadores para o alcance da independência de insulina. A morte encefálica (ME) está associada a uma inflamação sistêmica que produz profundas alterações fisiológicas na condição hemodinâmica do doador, antes mesmo do início do processo de retirada dos órgãos. Essa característica única do doador cadavérico influencia negativamente a função dos órgãos pós-transplante, o que torna os cuidados com o doador uma peça chave no cenário dos transplantes de órgãos. Contudo, o uso de protocolos com terapias específicas, como a reposição de hormônios tireoidiano e suprarrenal, tem demonstrado eficácia muito limitada em melhorar os desfechos de órgãos transplantados. Os resultados desta pesquisa demonstram que marcadores inflamatórios estão aumentados no estado de ME. A precipitação da ME é seguida de um aumento das concentrações de fator de necrose tumoral-α (TNF-α) e interleucina-6 (IL-6) no sangue e de TNF-α no tecido pancreático, mas não de fator tecidual (FT), cuja expressão já conhecida em ilhotas isoladas provavelmente se deva a fatores de estresse relacionados ao isolamento das células. Esse aumento de TNF-α pode explicar, pelo menos em parte, os melhores desfechos alcançados por protocolos de transplante de ilhotas que incluem o uso de receptores solúveis do TNF-α. Em conclusão, a ME está associada a um aumento da expressão de TNF-α no sangue e no tecido pancreático humano. Portanto, o uso de terapias anti-inflamatórias dirigidas ao doador de múltiplos órgãos pode tornar-se uma estratégia promissora para melhorar os resultados dos transplantes de ilhotas.

A suplementação dietética com AGCM induz resistência à insulina, redução de peso ponderal e aumento da adiposidade em ratos Wistar. Adipócitos isolados apresentam reduzidas captação de glicose estimulada por insulina e atividade/fosforilação da proteína AMPK. A expressão protéica do IR no tecido hepático está aumentada em animais tratados com AGCM com redução do grau de fosforilação, enquanto que o grau de fosforilação da proteína AKT permaneceu semelhante entre os grupos. Ilhotas pancreáticas isoladas apresentam redução na secreção de insulina quando incubadas com altas concentrações de glicose, diminuição do conteúdo total de insulina, hipersensibilidade a leucina e/ou arginina e aumento do percentual de morte celular com diminuída expressão da proteína AKT_1 . Desta forma, utilização em longo prazo dessa estratégia nutricional pode interferir no crescimento normal do indivíduo, na sensibilidade à insulina e possívelmente, desenvolvimento e instalação do diabetes. _______________________________________________________________________________________ ABSTRACT: The introduction of MCFA into diet induces insulin resistance, reduced body weight gain, and increased adiposity in Wistar rats. Isolated adipocytes have reduced insulin induced glucose uptake and phosphorylation/activation of AMPK protein. The insulin receptor protein expression is increased in liver of MCFA fed rats accompanied by reduced tyrosine phosphorylation, with similar AKT serine phosphorylation. Isolated pancreatic islets had reduced glucose stimulated insulin secretion due to high glucose exposure and reduced insulin content; higher insulin secretion induced by leucine and arginine, and increased apoptosis with reduced AKT protein level. In these regard, the chronic ingestion of MCFA may interfere with normal body growth, with the insulin sensitivity and may participate with the development of diabetes.