Univ., Diss., 2009--Marburg. / Teilw. publ. in: Journal of immunology, 182.2009,8. S. 4705-4712.

Thesis (doctoral)--University of Amsterdam, 1981. / Includes bibliographical references.

München, Techn. Univ., Diss., 2004.

Proefschrift Universiteit Maastricht. / Met lit. opg. - Met samenvatting in het Nederlands.

Proefschrift Universiteit Maastricht. / Met lit. opg. - Met een samenvatting in het Nederlands.

La plupart des lymphocytes T régulateurs CD4+ Foxp3+ (Tregs) sont générés dans le thymus. Plusieurs études suggèrent fortement que le développement des Tregs est dû à la forte affinité de leur TCR pour le soi (complexes « peptide du soi-CMH II ») présenté dans le thymus. Après avoir migré à la périphérie, les Tregs continuent d’interagir avec le soi et l’expression de Foxp3 est considérée comme nécessaire et suffisante pour maintenir le programme de transcription nécessaire aux fonctions suppressives de ces cellules en périphérie. En utilisant deux models expérimentaux chez la souris, notre étude démontre l’importance des interactions continues avec le soi pour maintenir les capacités suppressives des Tregs à la périphérie. L’absence d’interactions avec le soi aboutit rapidement à une altération du phénotype des Tregs, de leur capacité à produire certaines cytokines et modifie également leur signature transcriptionnelle. De façon intéressante, nous avons observé que l’absence d’interaction avec le soi n’affecte pas le niveau d’expression de Foxp3 mais que la reconnaissance du soi induit une signature transcriptionnelle unique et des caractéristiques fonctionnelles qui ne sont pas liées à Foxp3. Dans une seconde étude, nous avons mis en évidence que, chez la souris jeune adulte, l’expression de Ly-6C permet d’identifier deux sous-populations de Tregs distinctes présentant des différences phénotypiques et fonctionnelles. En particulier, nous avons observé que les Tregs Ly-6C- présentent un phénotype plus activé et régulateur que leurs homologues Ly-6C+ et que seules les premières sont fonctionnelles in vitro et in vivo. Nous avons également montré un lien étroit entre expression de Ly-6C et autoréactivité, les Tregs Ly-6C- recevant plus de signaux du TCR que les Tregs Ly-6C+. Finalement, nous avons observé que seuls les Tregs Ly-6C- se maintiennent à la périphérie avec le temps, suggérant l’existence d’une sélection périphérique permettant la survie préférentielle des Tregs les plus fonctionnels. Au cours de ma thèse, nous avons ainsi pu démontrer que les interactions avec le soi étaient indispensables et nécessaires pour la fonctionnalité, le phénotype et l’homéostasie des Tregs. / Most regulatory T cells CD4 + Foxp3 + ( Tregs ) are generated in the thymus. Several studies strongly suggest that the development of Tregs is due to the high affinity of their TCR for itself (complex " self peptide - MHC II ') shown in the thymus . After migrating to the periphery, Tregs continue to interact with the self and the expression of Foxp3 is considered necessary and sufficient to maintain the transcriptional program required for suppressive function of these cells in the periphery. Using two experimental models in mice, our study demonstrates the importance of ongoing interactions with itself to keep the suppressive capacity of Tregs in the periphery. The lack of interaction with the so quickly leads to an altered phenotype of Tregs , their ability to produce cytokines and also changes their transcriptional signature. Interestingly , we observed that the lack of interaction with the so does not affect the expression level of Foxp3 but self-recognition induces a unique transcriptional signature and functional characteristics that are not related to Foxp3 . In a second study, we demonstrated that in young adult mice , the expression of Ly- 6C identifies two distinct subpopulations of Tregs with phenotypic and functional differences . In particular, we observed that Tregs Ly- 6C- have a more activated phenotype and control than their counterparts Ly- 6C + and only the former are functional in vitro and in vivo. We have also shown a strong link between expression of Ly- 6C and autoreactivity , Tregs Ly- 6C- receiving over TCR signals that Ly -6C + Tregs . Finally , we observed that only Tregs Ly- 6C- remain at the periphery over time , suggesting the existence of a selection device for the preferential survival of the most functional Tregs . During my thesis, we were able to demonstrate that interactions with the self were essential and necessary for the functionality, phenotype and homeostasis of Tregs.

Les cellules dendritiques (DC) sont spécialisées dans la capture, l’apprêtement et la présentation des antigènes. Elles ont développé une voie spécifique de présentation, la présentation croisée, leur permettant d’internaliser des antigènes exogènes, de les digérer et de les associer aux molécules du CMH de classe I afin de les présenter aux lymphocytes T CD8+. La présentation croisée est essentielle à la présentation d’antigènes qui ne sont pas synthétisés directement dans les DC (antigènes du soi, de tumeurs, de microorganismes n’infectant pas les DC) et donc à l’établissement de réponses T CD8+ anti‐infectieuses ou anti-tumorales. Son étude est donc primordiale pour la vaccination et pour l’immunothérapie mettant en jeu une présentation par les DC. Notre équipe a montré qu’à l’instar des cellules apoptotiques, les cellules vivantes sont une source d’antigènes efficace pour la présentation croisée par les DC in vitro et in vivo. Elle a ainsi montré que l’immunisation de souris avec des DC ayant capturé du matériel provenant de cellules vivantes permettait de protéger efficacement contre une tumeur dérivée de cellules de mélanome (B16) dans un protocole de type prophylactique. Durant ma thèse, j’ai pu montrer que cette immunisation était également très efficace dans un protocole de type thérapeutique. De façon surprenante, la protection et la réponse T CD8+ obtenues en utilisant des cellules vivantes comme source d’antigènes sont meilleures que celles obtenues avec des cellules apoptotiques. Les DC cultivées avec des cellules donneuses d’antigènes, vivantes ou apoptotiques, expriment des niveaux équivalents de molécules de costimulation. En revanche, les DC cultivées avec des cellules apoptotiques sécrètent plus d’IL--‐10, leur conférant un phénotype plus tolérogène. De plus, nous avons également montré que les antigènes tumoraux étaient mieux préservés au sein des cellules vivantes que des cellules apoptotiques, et que la quantité de complexes CMH--‐I/peptide à la surface des DC après culture avec des cellules vivantes était plus importante qu’après culture avec des cellules apoptotiques. Dans une seconde partie de ma thèse, je me suis attachée à caractériser les récepteurs et mécanismes impliqués dans le transfert d’antigènes provenant de cellules vivantes aux DC. J’ai pu montrer que ce transfert ne dépend ni de la sécrétion d’exosomes, ni du « cross-dressing ». En revanche, il est initié après un contact étroit avec les DC qui semble dépendre au moins en partie des récepteurs de type scavenger (SR) et de la calréticuline. Les images obtenues en microscopie suggèrent le passage de molécules de grande taille au sein d’une structure qui pourrait s’apparenter aux jonctions annulaires (Annular Gap Junctions). En effet, nous observons le passage de connexine 43 (Cx3) et de matériel cellulaire sous une conformation native (protéine GFP de 70kDa) provenant de la cellule vivante et colocalisant partiellement avec le marqueur d’endosomes précoces EEA-1 dans la DC. Cependant, l’utilisation de shRNA spécifique de la Cx43 indique que la présentation croisée ne nécessite pas son expression. Nos résultats suggèrent donc l’existence d’un mécanisme de communication intercellulaire permettant le passage d’antigènes de grande taille, qui pourraient ensuite être apprêtés par la DC. / Dendritic cells (DC) are specialized in the capture, processing and antigen presentation. They have developed a special antigen presentation mechanism, known as cross-presentation, allowing them to internalize exogenous antigens, to digest and associate them to MHC class I molecules for presentation to CD8+ T lymphocytes. The cross-presentation is essential to the presentation of antigens that are not directly synthesized by the DC (self antigens, tumor antigens, microorganisms that don’t infect DC) and therefore to establish anti-infectious or anti-tumoral CD8+ T cell responses. His study is therefore essential for vaccination and immunotherapy involving a presentation by the DC. Our team showed that, like apoptotic cells, living cells are an efficient antigen source for cross-presentation by DC in vitro and in vivo. We have shown that immunization of mice with DCs that have captured material from living cells could protect effectively against a B16 melanoma challenge in a prophylactic model. During my PhD, I have shown that immunization was also very effective in a therapeutic model. Surprisingly, the protection and the CD8+ T cell response obtained using living cells as antigen source, are better than those obtained with apoptotic cells. DCs cultured with live or apoptotic antigen donor cells, expressed equivalent levels of costimulatory molecules. In contrast, DCs cultured with apoptotic cells secrete more IL- 10, giving them a tolerogenic phenotype. Furthermore, we have also shown that tumor antigens were better preserved within living cells than apoptotic cells, and the amount of MHC-I/peptide complexes at the surface of DC after culture with living cells was greater than after culture with apoptotic cells. In a second part of my thesis, I tried to characterize the receptors and mechanisms involved in the transfer of antigen from living cells to DCs. I have shown that this transfer is not dependent on exosomes transfer, nor on "cross-dressing". However, it is initiated after a close contact with the DC that seems to depend at least in part in scavenger receptors (SR) and calreticulin. The microscopy images obtained suggest the passage of large molecules in a structure, which may be similar to annular junctions (Annular Gap Junctions). Indeed, we observe the passage of connexin 43 (Cx3) and cellular material in a native conformation (GFP 70 kDa protein) from the living cell that partially colocalize with the early endosome marker EEA-1 in DCs. However, the use of an shRNA specific for Cx43 indicates that the cross-presentation does not require its expression. Our results suggest the existence of a mechanism of intercellular communication allowing the passage of large antigen, which could then be processed by DCs.

Le corps humain est quotidiennement exposé à de nombreux micro-organismes et le système immunitaire est responsable du maintien de son intégrité. Suite à une infection, le système immunitaire inné déclenche une réponse rapide, non spécifique à l’agent pathogène, et amorce le système immunitaire adaptatif qui lui permet de contenir et d’éliminer spécifiquement le pathogène. Tous les virus et de nombreuses bactéries entrent dans le cytosol des cellules hôtes et commencent à se répliquer. Bien que les acides nucléiques possèdent une structure universelle, l’ADN du soi est présent dans les noyaux et les mitochondries. L’accumulation d’ADN dans le cytosol va déclencher une puissante réponse antivirale innée. Celle-ci a lieu après l’activation de la voie de signalisation cGAS-STING qui conduit à la production de d’interféron de type I et de cytokines pro-inflammatoires dues respectivement à l’activation des facteurs de transcription IRF-3 et NF-kB. De récentes découvertes ont montré que le VIH-1 échappe efficacement à l’infection et à la détection par les cellules dendritiques myéloïdes (DCs) dans le cytosol, tandis que l’ADN du VIH-2 est détectée via la voie cGAS-STING dans les DCs, induisant leur maturation. La maturation des DCs par la détection de VIH-2 induit potentiellement des réponses immunes adaptatives et pourrait contribuer au contrôle antiviral des patients infectés par VIH-2. Toutefois, comment la détection immunitaire du VIH-2 par les DCs module la susceptibilité des lymphocytes T CD4 naïfs à l’infection par VIH et leur profil effecteur auxiliaire n’est toujours pas connus. Pour répondre à ces questions, nous avons développé un modèle in-vitro de lymphocytes T CD4+ naïfs co-cultivés avec des cellules dendritiques préalablement exposées à VIH-1 ou VIH-2, ou d’autres stimuli de contrôle. Nous avons montré que la détection de VIH-2 par les cellules dendritiques conduisait à l’acquisition partielle d’une résistance à l’infection dans les lymphocytes CD4+ naïfs. Cette résistance est liée à l’induction de gènes stimulés par l’interféron. Nous avons montré que le profil TVIH-2 est caractérisé par la production d’IFNγ rappelant le profil des lymphocytes T auxiliaires de type 1 (Th1). Nous avons généré les profils d’expression géniques correspondant par micropuces. Nous avons réalisé une analyse exploratoire sur les différences d’expression des gènes à partir des micropuces et nous avons produit une liste de gènes candidats comme facteurs de résistance dans les lymphocytes T CD4+. Bien que le rôle de STING dans l’immunité innée et les voies de signalisation ait été largement décrit, son implication dans l’immunité adaptative reste inconnue. Dans de précédentes études, une nouvelle mutation de gain de fonction a été identifiée dans le gène codant pour STING dans une famille caucasienne non-consanguine. Le mutant constitutivement actif STING-V155M, est localisé de façon permanente dans l’appareil de Golgi et active la voie STING-TBK1-IRF3. Les patients porteurs de cette mutation présentent une signature IFN de type 1 dans leur sérum. L’analyse des paramètres cliniques de ces patients montre une diminution de leurs lymphocytes T mémoires et une augmentation de leur fraction des lymphocytes T naïfs par rapport aux sujets contrôles. Pour évaluer l’activité de STING dans les lymphocytes, nous avons développé un modèle in vitro de lymphocytes T CD4+ transduits avec STING WT ou d’autres mutants de STING. Nous avons démontré que STING induit une activité antiproliférative des lymphocytes T CD4+. Cette activité est indépendante du recrutement de TBK1, IRF3 et de l’action de l’IFN de type I, mais il active les DCs. En outre, cet effet antiprolifératif des cellules par STING est dépendant de sa localisation au Golgi et induit des erreurs lors de la mitose. En conclusion, nos découvertes révèlent l’activité intrinsèque antiproliférative d’un senseur innée dans des cellules appartenant au système immunitaire adaptatif. (...) / No abstract

Regulatory T cells (Treg) are a suppressive subset of helper T cells that controls immune responses using a variety of mechanisms. Despite initially being thought of as a homogenous population, Treg cells were recently found to adapt their function to their environment and acquire specialized phenotypes depending on their tissue of residence. The molecular mechanisms underlying this functional and tissular adaptation remain to be fully elucidated.In the course of this work, we studied the role of transcription factor c-Maf in the differentiation and the function of Treg cells. For this, we used a murine model invalidated for c-Maf specifically in Treg cells. Transcription factor c-Maf is preferentially expressed by intestinal Treg cells, particularly among the RORγt+ Treg subset, which controls immune responses directed towards the gut microbiota. We have shown that the differentiation of RORγt+ Treg cells results from the integration of multiple environmental signals, highlighting the plasticity of Treg specialization. Furthermore, we have shown that c-Maf is required for the differentiation of RORγt+ Treg cells as well as the expression of the anti-inflammatory cytokine IL-10 by intestinal Treg cells, thus endowing Treg cells with the ability to control homeostatic Th17 responses in the intestine. Mice deficient for c-Maf in Treg cells exhibit an exacerbated Th17 response and spontaneously develop colitis. However, c-Maf-deficient mice develop fewer polyps in a model of colitis-associated colon cancer. This suggests that c-Maf expression in Treg cells plays a beneficial role on intestinal homeostasis at steady state, but is detrimental in a tumoral context.Our results allow a better understanding of the mechanisms involved in the specialization of intestinal Treg cells. The knowledge of these mechanisms is crucial for the identification of new therapeutic targets in the context of inflammatory bowel disease and colon cancer. / Doctorat en Sciences / info:eu-repo/semantics/nonPublished

Cardiovascular disease and the acute consequence of myocardial infarc- tion remain one of the most important causes of morbidity and mortality in all western societies. While much progress has been made in mitigating the acute, life-threatening ischemia caused by infarction, heart failure of the damaged my- ocardium remains prevalent. There is mounting evidence for the role of T cells in the healing process after myocardial infarction, but relevant autoantigens, which might trigger and regulate adaptive immune involvement have not been discov- ered in patients. In this work, we discovered an autoantigenic epitope in the adrenergic receptor beta 1, which is highly expressed in the heart. This autoantigenic epitope causes a pro-inflammatory immune reaction in T cells isolated from pa- tients after myocardial infarction (MI) but not in control patients. This immune reaction was only observed in a subset of MI patients, which carry at least one allele of the HLA-DRB1*13 family. Interestingly, HLA-DRB1*13 was more com- monly expressed in patients in the MI group than in the control group. Taken together, our data suggests antigen-specific priming of T cells in MI patients, which leads to a pro-inflammatory phenotype. The primed T cells react to a cardiac derived autoantigen ex vivo and are likely to exhibit a similar phenotype in vivo. This immune phenotype was only observed in a certain sub- set of patients sharing a common HLA-allele, which was more commonly ex- pressed in MI patients, suggesting a possible role as a risk factor for cardiovas- cular disease. While our results are observational and do not have enough power to show strong clinical associations, our discoveries provide an essential tool to further our understanding of involvement of the immune system in cardiovascu- lar disease. We describe the first cardiac autoantigen in the clinical context of MI and provide an important basis for further translational and clinical research in cardiac autoimmunity. / Die koronare Herzerkrankung und die akute Konsequenz des Myokardin- farktes (MI) sind eine der häufigsten Ursachen von Morbidität und Mortalität in unserer westlichen Gesellschaft. Obwohl es große Fortschritte in der Behand- lung von akut lebensbedrohlichen ischämischen Ereignissen gab, bleibt die re- sultierende Herzinsuffizienz nach Infarkt ein häufiges klinisches Problem. Immer mehr Evidenz weist auf eine wichtige Rolle von T-Zellen im Heilungsprozess nach MI hin, aber relevante Autoantigene, die adaptive Immunantworten auslö- sen und regulieren könnten, wurden in Patienten mit MI noch nicht entdeckt. In dieser Arbeit beschreiben wir ein Epitop des Adrenergen Rezeptors Beta 1, der im Herz hoch exprimiert ist und als Autoantigen fungiert. Dieses Au- toantigen verursacht eine pro-inflammatorische Immunreaktion in T-Zellen, die von MI-Patienten isoliert wurden, aber nicht in Kontrollpatienten. Diese Immun- reaktion beobchten wir jedoch nur in einem Teil der Patienten, der ein Allel der Familie HLA-DRB1*13 trägt. Interessanterweise sind MI-Patienten häufiger Trä- ger eines solchen Allels als Kontroll-Patienten. Zusammenfassend legen unsere Ergebnisse nahe, dass T-Zellen in MI- Patienten antigen-spezifisch aktiviert werden und einen pro-inflammatorischen Phänotyp ausbilden. Die aktivierten T-Zellen reagieren ex vivo auf ein kardiales Autoantigen und entwickeln vermutlich in vivo einen ähnlichen Phänotyp. Dieser ist abhängig von einem HLA-Allel, welches in Infarkt-Patienten häufiger war als in der Kontrollgruppe, was eine mögliche Rolle als Risikofaktor für kardiovasku- läre Erkrankungen suggeriert. Unsere Ergebnisse stellen eine wichtige Grundlage dar, um unser Ver- ständnis des Immunsystems in kardiovaskulären Erkrankungen zu vertiefen. Wir beschreiben in dieser Arbeit das erste kardiale Autoantigen, das im klinischen Kontext des Myokardinfarktes entdeckt wurde und bieten somit eine wichtige Grundlage für weitere translationale und klinische Forschung in der Immunkar- diologie.