Les 161 recueils de masséter (161 gauche 36 droite) ont intéressé des patients lors du traitement chirurgical de leur malocclusion. Les 161 patients sont regroupés selon l'analyse céphalométrique de Delaire informatisée. L'étude des chaînes lourdes de myosine a été effectuée sur 28 échantillons par électrophorèse (SDS-PAGE) et western-blot. L'immunomarquage a été réalisé sur les 197 biopsies (côté gauche 161 et côté droit 36) et permet d'identifier 4 groupes de fibres du masséter humain (l, Hybride, II, NéoAtrial) selon leur pourcentage et leur surface moyenne. Nous avons réalisé des tests de Student apparié et de Wilcoxon pour comparer les résultats des 28 échantillons selon l'immunomarquage et l'électrophorèse, et les deux côtés pour les patients déviés ou non. Nous avons réalisé un test d'ANOVA entre chaque type de fibre et les groupes. Les résultats de l'électrophorèse et de l'immunomarquage sont identiques, validant la faible variabilité intrinsèque à l'échelle de la biopsie. La comparaison des patients déviés conclut à une différence significative du côté homolatéral à la déviation chez les patients déviés (pourcentage de fibres de type II p=0,0286). Le morphotype deepbite est associé à une élévation du pourcentage des fibres de type II (p=0,0073) et à une baisse de la surface moyenne des NéoAtriale (p=0,0401). Le morphotype classe II apparait associé à une augmentation du pourcentage de fibres hybrides (p=0,0419) et une baisse du pourcentage de fibres de type II (p=0,0234) par rapport à la classe Ill. La position absolue de la mandibule par rapport à la base du crâne est liée au pourcentage (p=0,0023) et la surface moyenne (p=0,0387) des fibres de type Hybride (augmentation dans les pro et rétro-mandibulie, baisse dans les normo-mandibulie) CONCLUSION La hauteur faciale et la latérodéviation sont liées au pourcentage de fibres de type II et à la surface moyenne des fibres NéoAtriales. La position sagittale de la mandibule est liée au pourcentage et la surface moyenne des fibres Hybrides, et au pourcentage de fibres de type II. / Masseter biopsies (161left, 36 right).were performed on 161 subjects undergoing surgical treatment of malocclusion. Patients were classified according to computer-assisted Delaire cephalometric analysis. The 36 patients with both side biopsies were separated into 2 groups: with or without lateral deviation. SDS-PAGE was performed on 28 biopsies to identify myosin heavy chain content. Immunostaining with myosin-isoform-specific antibodies was performed on 197 biopsies to identify 4 fiber types (l, Hybrid, II, NéoAtrial). For each fiber type, percent occupancy and mean area were calculated. Student and Wilcoxon tests were used to compare electrophoresis and immunostaining results from 28 cases, and fibre type compositions on the two sides in 36 patients. An ANOVA test was done to identify correlation between percent occupancy and mean area of each fiber type versus cephalometric classification for aIl 161 left samples. Electrophoresis and immunostaining analysis of slow and fast (lIa & IIx) myosin heavy chains gave equivalent results. Lateral deviation patients showed an increase of type II fiber occupancy (p=0,0286) on the same side as the deviation (short side). Deep bite is associated with an increase of type II fiber occupancy (p=0,0073) and decrease of NeoAtrial mean fiber area (p=0,0401). Class II is significantly associated with an increase in occupancy of hybrid fibers (p=0,0419) and decrease of type II (p=O,0234) as compared with Class Ill. Mandibular position in relation to the skull base trend is associated with an increase of percent occupancy (p=0,0023) and mean area (p=0,0387) of hybrid fibers in case both forward and backward position. CONCLUSION Facial vertical dimension and mandibular lateral deviation is significantly linked to type II fiber percentage occupancy and NeoAtrial mean fiber area. Saggital mandibular position is linked to mean fiber area and percent of hybrid fibers, and percent occupancy of type II fibers.

Thèse numérisée par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

La transplantation pulmonaire est depuis une vingtaine d’années une option thérapeutique valide pour une grande variété de pathologies pulmonaires au stade terminal. Malgré les progrès réalisés ces dernières années en matière de traitement immunosuppresseur, les rejets restent une cause majeure de la perte du greffon. Plusieurs études ont souligné l'importance du rejet aigu comme un facteur contributif important à l’évolution de la dysfonction chronique du greffon (ou CLAD) et, in fine, à la perte du greffon. Par conséquent, des outils diagnostiques fiables de rejet aigu s’imposent pour mieux prévenir le CLAD. Dans notre première étude, nous avons évalué les marqueurs tissulaires de rejet aigu humoral (RAH) pulmonaire. Nous avons montré ainsi que les lésions histologiques dont l’inflammation microvasculaire ne sont pas spécifiques et le marquage C4d est un marqueur utile pour confirmer le diagnostic de RAH. Dans un second temps, nous avons étudié en cytométrie de flux la polarisation des macrophages obtenus par lavage bronchiolo-alvéolaire (LBA) chez des patients transplantés avec et sans rejet. Nos résultats montrent les limites des marqueurs membranaires (HLA-DR et CD206) dans l’évaluation de l’état de polarisation des macrophages au cours des rejets. Ce travail montre l’intérêt des marqueurs tissulaires, en particulier le marquage C4d, dans le suivi des patients transplantés pulmonaires et souligne la nécessité d’identifier des marqueurs appropriés et utilisables en cytométrie de flux pour avancer sur l’état de polarisation des macrophages alvéolaires. / Lung transplantation is considered as a valid therapeutic option for patients with end-stage lung disease. Despite considerable progress in immunosuppressive therapy, allograft rejection remains a major cause of graft loss. Multiple studies have highlighted the importance of acute rejection as an important risk factor for the development of chronic lung allograft dysfunction (CLAD) leading to graft failure. Therefore, the improvement in the diagnosis of acute rejection represents a major challenge to prevent CLAD. In this study, we evaluated the tissue markers of acute antibody-mediated rejection (AMR) in lung transplantation. In our experience, the histopathologic findings including the microvascular inflammation in pulmonary AMR are not specific and C4d staining is a useful marker to confirm the diagnosis of AMR. Secondly, we investigated by flow cytometry the polarization of alveolar macrophage obtained by bronchoalveolar lavage (BAL) from lung transplant patients with and without acute rejection. Our results show the limits of surface markers (CD206 and HLA-DR) in the evaluation of alveolar macrophage polarization. This study shows the interest of tissue markers, especially the C4d staining, in monitoring of lung transplant patients and highlights the need to identify appropriate and available markers for future studies of alveolar macrophage polarization by flow cytometry.

La transition épithélio-mésenchymateuse (EMT) est un processus incontournable dans de nombreux contextes normaux et pathologiques, tels que gastrulation, organogenèse, fibroses et cancers. Cette transformation de cellule épithéliale en cellule mésenchymateuse est indissociable de l'acquisition de propriétés migratoires et est généralement associée à un changement de destin cellulaire. Différentes voies moléculaires sont impliquées selon le contexte de l'EMT concernée. Récemment, notre laboratoire a mis en évidence que la voie Notch cytoplasmique contrôle l'EMT des cellules de la lèvre dorso-médiale du somite (DML). Les crêtes neurales exprimant DLL1 activent « en passant » le récepteur NOTCH, liberant ainsi le domaine intra-cytoplasmique de NOTCH (NICD). Dans le cytoplasme, NICD inhibe la kinase GSK3ß, conduisant à la stabilisation de SNAIL, un gène maître de la transition épithélio-mésenchymateuse. Il en résulte une libération de la βcaténine des jonctions adhérentes qui, après translocation dans le noyau, active la transcription des gènes de la myogénèse (Myf5). Ainsi, l'activation de la voie Notch cytoplasmique permet une induction concomitante de l'EMT et de la myogénèse. La fonction cytoplasmique de Notch reste controversée et le mécanisme par lequel NICD inhibe GSK3ß reste obscur. Au cours de ma thèse j'ai cherché à élucider le mécanisme par lequel NICD inhibe l'activité kinase de GSK3ß. J'ai confirmé l'interaction de GSK3ß et de NICD en démontrant leur interaction via CoIP. Après avoir démontré l'implication de la sérine-thréonie kinase AKT dans la myogenèse des cellules de la DML, j'ai mis en évidence, via CoIP et électroporation, que l'inhibition GSK3ß par NICD est très certainement médiée par AKT, connue pour être impliquée dans l'EMT et inhiber GSK3ß par phosphorylation. En comparant le NICD1 de poulet et les 4 NICD de souris, j'ai montré que l'expression exogène de ces 5 molécules induit l'EMT et la différenciation myogénique de manière similaire. J'ai aussi montré que parmi des différents domaines de NICD, le domaine RAM, connu pour se lier à l'ADN (via RBPJ), est nécessaire et suffisant à l'inhibition de GSK3ß. Un second axe de ma thèse a été de tester l'implication de la voie Notch cytoplasmique dans d'autres contextes d'EMT. Pour ce faire, j'ai mis en évidence que cette voie est impliquée dans les autres lèvres du dermomyotome mais aussi dans les crêtes neurales qui délaminent du toit du tube neural. J'ai en particulier mis en évidence une co-activation des voies Wnt et Notch, une inhibition de la kinase GSK3ß par NICD cytoplasmique ainsi qu'une inhibition de la différenciation en présence d'une ß-caténine mutée, retenue à la membrane, ou en présence d'une molécule SNAIL2 dominant-négative. Le dernier axe de ma thèse a consisté à élucider le mécanisme de régulation de l'induction de l'EMT et de la myogenèse via l'activation de NICD. Il a été mis en évidence que toutes les cellules de la DML peuvent être activées via DLL1 et que la surexpression massive de NICD dans la DML provoque une différenciation massive et une déplétion du groupe de cellules progénitrices. Afin de déterminer si la régulation de cette initiation se fait avant ou après induction de NICD, j'ai créé un plasmide permettant de répondre à cette question et afin de visualiser son expression in vivo, j'ai initié une collaboration avec une équipe de l'ILM afin de créer un microscope vertical SPIM biphoton permettant l'observation d'embryon de poulets vivants [etc...] / The epithelio-mesenchymal transition (EMT) is a well-known mechanism by which epithelial cells lose their adherent connections and gain migratory properties, associated with a gain of a mesenchymal phenotype. This EMT is required in numerous processes as gastrulation, organogenesis, fibrosis and cancers. Various molecular pathways orchestrate the EMT depending on the EMT biological context. Recently, our laboratory highlighted the implication of the cytoplasmic Notch pathway in the dorso-medial lip (DML) EMT. In the DML tissue, theEMT is synchronized with differentiation pathways, to generate cells forming the primary myotome. Our laboratory showed that neural crests cells expressing DLL1 activate NOTCH receptor of the DML cells, via a “kiss and run” model. This leads to NOTCH cleavage, releasing an activated intra-cytoplasmic NOTCH domain (NICD). In the cytoplasm, NICD inhibits the GSK3ß kinase, leading to the stabilization of SNAIL and the free cytoplasmic ßcatenin. These molecules translocate into the nucleus and lead to the activation of MRF as Myf5 (ß-catenin) and to the repression of adherent genes (SNAIL). Therefore, Notch cytoplasmic pathway allows a synergized induction of both, the EMT and myogenic programs. This pathway remains controversial and the precise mechanism how NICD inhibits GSK3ß needs to be elucidated. Therefore, the aim of my thesis project was to clarify how NICD inhibits GSK3ß activity. First, I confirmed that NICD and GSK3ß physically interact by CoIP. Moreover, I demonstrated that the serin-threonin kinase AKT, known to inhibit GSK3ß by phosphorylation and also to mediate EMT in cancer, can physically interact with NICD in the cytoplasm. I have also shown that AKT mediates the induction of the myogenic program through the inhibitory phosphorylation of GSK3ß and that SNAIL is downstream of AKT. Together, these experiments indicate that AKT mediates, through phosphorylation, the cytoplasmic NICD inhibition of GSK3ß leading to myogenesis. A comparison of the chicken NICD1 and the 4 isoforms of mouse NICD highlighted that these 5 proteins induce EMT and myogenesis similarly. The dissection of the different conserved domains in the 5 different NICD proteins demonstrated that the RAM domain, known to activate transcription by binding to RBPJ, is necessary and sufficient for GSK3ß inhibition. A second axis of the thesis has been to test the involvment of the cytoplasmic Notch pathway in other EMT contexts. First, I highlighted that this pathway induces myogenesis, showing that NICD inhibits GSK3ß activity in the ventro-lateral lip. I further demonstrated that the cytoplasmic Notch pathway is implicated in the EMT and differentiation of the neural crests cells delaminating from the dorsal neural tube. Particularly, I have shown a co-activation of the Wnt and Notch pathway in premigratory and migratory neural crests. Moreover, I demonstrated a cytoplasmic inhibition of the kinase activity of GSK3ß by NICD, as well as the induction of the differentiation by cytoplasmic ß-catenin or SNAIL2. In a third axis of my thesis, I tried to clarify the regulatory mechanism involved in Notch activation. Previously it has been demonstrated that in all the DML cells Notch can be activated by an overexpression of DLL1 and that an ectopic expression of NICD in the DML cells induce a massive differentiation and depletion of the progenitor pool. To determine if the regulation of this initiation of the myogenic program occurs before or after Notch activation, I designed a plasmid to visualize Notch activation in vivo. In order to be able to follow the DLM cells and Notch activation in vivo, I initiated a collaboration with an ILM team to create a vertical SPIM biphoton microscope. In the future, this microscope will allow us to follow cells in living chicken embryos [etc...]

Les vésicules extracellulaires (VEs) sont des vésicules membranaires de taille majoritairement submicrométrique présentes dans les fluides biologiques et émises par les cellules en réponse à divers stimuli. Les VEs sont impliquées dans de nombreux phénomènes physiologiques mais également dans des pathologies telles que cancers ou maladies cardiovasculaires. Elles pourraient donc être utilisées comme biomarqueurs de ces pathologies. Bien que les VEs soient aujourd’hui largement étudiées, nos connaissances sur le sujet demeurent limitées. Ceci est principalement dû aux difficultés de caractérisation des VEs et à l’absence de standardisation de leurs méthodes d’étude et d’isolation. La première partie de mon travail de thèse a porté sur le développement d’une méthode de thiolation de protéines. Des anticorps ont été modifiés pour exposer des thiols et ont été conjugués à des nanoparticules d’or fonctionnalisées par des maléimides. Le couplage des anticorps thiolés aux nanoparticules d’or a été étudié de manière quantitative et des conditions de conjugaison optimales ont été déterminées par des approches biochimiques. La seconde partie de ce travail a concerné la caractérisation des VEs du plasma sanguin de sujets sains par microscopie électronique à transmission (MET). La morphologie, la taille et le phénotype des VEs ont été déterminés par cryo- MET combinée au marquage par des nanoparticules d’or conjuguées à des protéines. La quantification objective des VEs du plasma sanguin a été réalisée à l’aide d’une méthode originale de MET basée sur la sédimentation de VEs sur grille de MET. La troisième partie de cette étude a consisté à mettre au point une méthode d’isolation de VEs à l’aide de particules magnétiques conjuguées à de l’AnxA5. Des conditions permettant d’extraire la totalité des VEs exposant la phosphatidylsérine contenues dans un plasma sanguin ont été déterminées par cytométrie en flux (CF). Ce travail a permis d’apporter une caractérisation détaillée des VEs du plasma sanguin du sujet sain et peut servir de référence pour des études ultérieures concernant les VEs contenues dans des plasmas ou autres liquides biologiques pathologiques. / Extracellular vesicles (EVs) are submicrometric membrane vesicles found in body fluids and produced by cells in response to various stimuli. EVs are involved in numerous physiological processes but also in pathologies as cancers or cardiovascular diseases. Even if EVs are largely studied, our knowledge about them remains limited. This is mainly caused by the difficulties to characterize EVs and by the lack of standardized methods allowing their characterization. The first part of my PhD work focused on the development and optimization of a protein thiolation method. Antibodies modified to expose few thiols were conjugated to gold nanoparticles functionalized with maleimides. The binding of thiolated antibodies to gold nanoparticles was quantitatively studied and optimal conjugation conditions were determined using biochemical methods. The second part of my PhD work concerned the characterization of blood plasma EVs from healthy subjects using transmission electron microscopy (TEM). EVs morphology, size and phenotype were determined by cryo-TEM combined with labelling with protein-conjugated gold nanoparticles. The near-absolute quantification of blood plasma EVs was achieved using an original TEM method based on the direct sedimentation of EVs onto TEM grids. The third part of this study consisted in developing an EV isolation method using AnxA5-conjugated magnetic particles. Conditions allowing total extraction of blood plasma phosphatidylserine-exposing EVs were determined using flow cytometry (FC). This study presents a detailed characterization of blood plasma EVs from healthy subjects and can serve as a reference for future studies on EVs contained in pathological plasmas or other body fluids.