Magíster en Bioquímica área de Especialización en Bioquímica Clínica y Memoria para optar al Título de Bioquímico / La neumonía adquirida en la comunidad (NAC) es una inflamación del epitelio respiratorio que afecta mayormente a menores de 5 años y mayores de 75 años. En el mundo es la 3° causa de muerte con un 6,7% de mortalidad y en Chile representa el 20% de la mortalidad en la población general, constituyendo un problema de salud pública. En adultos los agentes etiológicos más frecuentes son bacterianos; sin embargo, en los últimos años se ha reconocido a los virus respiratorios como causa frecuente de NAC, siendo los más comunes el virus influenza (FLU), respiratorio sincicial (VRS), parainfluenza (PiV) y adenovirus (AdV). Los adultos presentan una menor excreción viral, por lo que se requieren técnicas de mayor sensibilidad. Existen diversos métodos para el diagnóstico, incluyendo la detección de antígenos por inmunofluorescencia (IF), de genoma por la reacción en cadena de la polimerasa con transcripción reversa (TR-RCP) en tiempo real y la más reciente Luminex®, de la cual existen pocas publicaciones que avalen su efectividad y no se dispone de información en nuestro país, a pesar de su gran potencialidad. En este trabajo se comparó la efectividad de las técnicas de IF, TR-RCP en tiempo real y Luminex®, en la detección de virus respiratorios, en muestras de adultos con NAC, analizando su rendimiento, complejidad de ejecución y costos de implementación. Se estudiaron 113 pacientes mayores de 18 años hospitalizados por NAC. De cada uno se registraron los antecedentes clínicos y se obtuvo una muestra respiratoria para detectar virus por IF clásica (FLU A/B, VRS, PiV 1-3, AdV con Sigma® y Metapneumovirus (MPVh) con Hybrid Diagnostics®) y rápida (Hybrid Diagnostics®); por TR-RCP en tiempo real con el sistema comercial multiplex para virus respiratorios (Sacace Biotechnologies®) y por Luminex® (xTAG® RVP). Se analizó el rendimiento de las técnicas con características demográficas y clínicas de los pacientes mediante las pruebas estadísticas: Z, t y de correlación de Pearson con un p< 0.05 como significativo. Se determinó la sensibilidad, especificidad, valores predictivos, coeficiente de concordancia Kappa (κ), la curva ROC y las áreas bajo la curva (AUC) con el programa estadístico GraphPad Prism®. El rendimiento de la RT-RCP (49,6%) y de Luminex® (53,1%) fue similar (p=0,6) y ambos fueron significativamente mayores que la IF clásica (2,7%) y rápida (0%) (p=0). Rinovirus (RVh, 31,8%) y FLU A/B (14,2%) fueron los agentes detectados con mayor frecuencia. Luminex® coincidió con la TR-RCP en todas las detecciones de VRS (4,4%) y MPVh (1,8%) y fue el único que detectó Coronavirus (CoVh, 1,8%). La IF clásica solo detectó 1 caso de VRS (1%) y 2 de FLU A/B (1,9%). Respecto a la TR-RCP, la sensibilidad, especificidad, coeficiente κ y la AUC de Luminex® fue 89,9%, 82,5%, 0,7 y 0,86 y de la IF clásica fue 11,5%, 100%, 0,2 y 0,53 respectivamente. Se estableció una relación inversamente proporcional entre la fluorescencia (MFI) de Luminex® y el Ct de la TR-RCP para las detecciones coincidentes del total de muestras y las de RVh (p<0,0001). No se encontraron diferencias significativas en los datos demográficos, clínicos y de evolución entre los pacientes con detección viral por Luminex® y por RT-RCP. Luminex® permitió estudiar simultáneamente un mayor número de virus y de muestras, pero su costo y tiempo de procesamiento son más altos que las otras técnicas. En conclusión, Luminex® posee una buena sensibilidad y especificidad para detectar virus respiratorios en adultos con NAC, en comparación a la TR-RCP, por lo que esta técnica es una opción apropiada para el diagnóstico viral de estos pacientes aunque su implementación en la rutina de un laboratorio puede estar dificultado por su aun alto costo. Por el contrario, la IF no debiera usarse en la detección de virus respiratorios en adultos / Community acquired pneumonia (CAP) is an inflammation of the respiratory epithelium. It affects mostly children younger than 5 and adults older than 75 years. It’s the third cause of death worldwide, with a 6.7% mortality rate and represents a 20% mortality in general population in Chile, becoming a public health problem. In adults, the most frequent etiologic agents are bacteria; but in the last few years, respiratory viruses were acknowledged as frequent causes of CAP; influenza virus (FLU), respiratory syncytial virus (RSV), parainfluenza virus (PiV) and adenovirus (AdV) being the most common. Adults present low viral excretion, for it is required techniques with great sensibility. There are various diagnostics methods, including antigen detection by immunofluorescence assay (IFA), genome detection by real time polymerase chain reaction with retrotranscription (RT-PCR) and the most novel Luminex®, of which are few papers that prove its effectivity and there is no information for our country, despite its great potential. In this work, the performance of IFA, real time RT-PCR and Luminex® was compared in the detection of respiratory viruses in adults with CAP, analyzing performance, execution complexity and mounting costs. 113 patients above 18 years hospitalized with CAP were enrolled. For each one, clinical data were registered and a respiratory sample was obtained for detecting respiratory viruses by classic IFA (FLU A/B, PiV 1-3, RSV, AdV, Sigma®; human Metapneumovirus (hMPV), Hybrid Diagnostics®), fast IFA (Hybrid Diagnostics®), multiplex real time RTPCR for respiratory virus (Sacace Biotechnologies®) and by Luminex® (xTAG® RVP). Performance of each technique and demographic and clinical data were analyzed by statistical tests: Z, t and Pearson correlation with a p<0.05 as significate. Sensitivity, specificity, predictive values, Kappa (κ) value, ROC curve and area under curve (AUC) were calculated using GraphPad Prism® statistical software. In respiratory virus detection, the performance of RT-PCR (49.6%) and Luminex® (53.1%) were similar (p=0.6) and both were significantly higher than classic (2.7%) and rapid IFA (0%) (p=0). Human rhinovirus (hRV, 31.8%) and FLU A/B (14.2%) were the most frequently detected agents. Luminex® presented the same detections as RT-PCR for RSV (4.4%) and hMPV (1.8%) and was the only one able to detect human coronavirus (hCoV, 1.8%). Classic IFA only detected 1 case of RSV (1%) and 2 of FLU A/B (1.9%). In comparison to the RT-PCR, sensibility, specificity, Kappa value and AUC obtained by Luminex® was 89.9%, 82.5%, 0.7 and 0.86 and the values obtained by classic IFA was 11.5%, 100%, 0.2 and 0.53. An inverse proportional relation was established between Luminex® fluorescence (MFI) and RT-PCR Ct values for coincident detection in all samples and for hRV detection (p<0.0001). There are no significant differences in demographic, clinical and disease evolution data between patients with viral detection by Luminex® or RT-PCR. Luminex® possesses the biggest sample processing capability and viral type detection, but is more expensive and has the biggest processing time lapse than the other techniques. Finally, Luminex® possesses a high sensibility and specificity for detecting respiratory viruses in adults with CAP in comparison to RT-PCR, showing that it is a good and appropriate option for viral diagnosis in these patients, although its implementation in a routine diagnostic laboratory could be difficult for its high costs. On the contrary, classic IFA had a low performance and should not be used in detecting respiratory viruses in adults / Fondecyt

La Ehrlichiosis es una enfermedad zoonótica emergente transmitida a los humanos a través de la picadura de garrapatas infectadas, de gran importancia en países tropicales y sub-tropicales. En el presente estudio se determinó la seropositividad contra Ehrlichia chaffeensis en propietarios de perros con antecedentes de ehrlichiosis mediante la prueba de inmunofluorescencia indirecta (IFI) y su asociación con el sexo, edad, exposición a garrapatas y nivel de contacto con los perros mediante la prueba de Chi cuadrado. Se evaluaron 95 personas sin distinción de sexo, edad o condición socio económica cuyos perros tenían historia de ehrlichiosis reciente, los cuales llenaron un cuestionario con datos clínicos y epidemiológicos de importancia. El estudio se realizo entre Enero del 2009 y Diciembre del 2010. Los resultados del total de personas consideradas en el presente estudio indicaron que el 31.6% (30/95) presentaron anticuerpos contra Ehrlichia chaffeensis. Las variables edad y exposición a garrapatas resultaron estadísticamente significantes (p<0.05), frente a la seropositividad contra Ehrlichia chaffeensis. De los pacientes seropositivos, el 80% son personas menores de 40 años (24/30), mientras que el 20% son personas de 40 años a más (6/30). Asimismo, de los pacientes seropositivos el 93.3% estuvieron expuestos a garrapatas (28/30) mientras que el 6.7% no estuvieron expuestos (2/30). Estos hallazgos confirman la exposición a Ehrlichia chaffeensis en propietarios de perros con antecedentes de ehrlichiosis en Lima Metropolitana, evidenciando asociación de los resultados con los factores de riesgo evaluados, tales como edad y exposición a garrapatas.

Se conoce ampliamente que la confiabilidad de una colonia de cría de ratones para un determinado experimento puede ser solamente demostrada mediante un comprensivo monitoreo del estado de salud de los animales antes y durante el experimento. En este trabajo se han desarrollado las técnicas de inmunofluorescencia indirecta (IFI) y enzimoinmunoensayo (ELISA) para la detección de anticuerpos contra el virus Sendai, virus de la hepatitis murina y el virus diminuto o minuto de ratón en las colonias de cría del ratón, considerados los agentes virales más prevalentes en las colonias SPF de ratones. Se estudió la cinética de replicación para cada virus mediante la cosecha de células y sobrenadantes respectivos, en diferentes días post inoculación (pi).Se obtuvo una Semilla Maestra y una Semilla de Trabajo para el virus Sendai mediante la inoculación del virus en huevos embrionados de pollo. La Semilla de Trabajo sin diluir y en diluciones factor de 10 se utilizó para inmunizar a los ratones con diferentes esquemas de inoculación. Los sueros y líquidos ascíticos presentaron títulos de anticuerpos específicos entre 64 y 256, por la inhibición de hemaglutinación (HAI) y IFI, mientras que los títulos por ELISA estuvieron entre 6400 y 204800, para las mismas muestras. Para el virus MHV la Semilla Maestra y la Semilla de Trabajo se obtuvo por inoculación del virus en monocapas de células L929. Diluciones factor 10 de la cepa viral MHV se utilizó para inmunizar a los ratones con diferentes esquemas de inoculación. Los sueros y líquidos ascíticos presentaron títulos de anticuerpos específicos entre 32 y 2048 por IFI, mientras que los títulos por ELISA estuvieron entre 3200 y 12800 para los sueros y entre 200 y 6400 para los líquidos ascíticos, para las mismas muestras. Para el virus MVM la Semilla Maestra y la Semilla de Trabajo se obtuvo por inoculación del virus en monocapas de células L929. Diluciones factor 10 de la cepa viral MVM y de la ST viral se utilizó para inmunizar a los ratones con diferentes esquemas de inoculación. Los sueros y líquidos ascíticos se presentaron títulos de anticuerpos específicos entre 32 y 128 por inmunofluorescencia indirecta (IFI), mientras que los títulos por ELISA estuvieron entre 1600 y 6400 para los sueros y entre 200 y 800 para los líquidos ascíticos, para las mismas muestras. El antígeno para la pruebas IFI consistió en células enteras, mientras que para las pruebas de ELISA fue células lisadas por sonicación. Para el virus Sendai ambos antígenos se obtuvieron por inoculación de 0,1 UHA de la ST en células LLCMK2 y se cosechó el día 7pi. Para el virus MHV se inoculó ~105 DICT 50 / mL y para el virus MVM ~10 6DICT 50 / mL, en células L929. Las células fueron procesadas el día 5 y 1 pi respectivamente. Nuestros estudios muestran que el desarrollo de las pruebas de IFI y ELISA, (complementadas con la prueba clásica de HAI para el caso del virus Sendai), comprenden una batería de pruebas innovadoras y confiables para la detección de anticuerpos contra los virus de Sendai, MHV y MVM en bioteros. Los resultados presentados revelan que las metodologías desarrolladas en nuestro laboratorio son herramientas eficaces para el control de la contaminación por los agentes virales estudiados en colonias de ratones libres de patógenos específicos. Los estudios presentados podrían considerarse como un punto de partida para el desarrollo de futuros avances en este campo del conocimiento. Palabras claves: ratones SPF, virus contaminantes de roedores , enzimo inmuno análisis (ELISA), inmunofluorescencia indirecta (IFI) / It is widely known that the reliability of a mouse breeding colony for a given experiment only can be demonstrated by a comprehensive health monitoring of the animals before and during the experiment. We recommend finding specific antibodies as indicators of virus circulation in the colony. In this work, we developed the techniques of indirect immunofluorescence (IFI) and enzyme immunoassay (ELISA) for the detection of antibodies to Sendai virus, MHV virus and MVM virus in mouse breeding colonies. It was studied the kinetics for each virus replication by harvesting cells and its respective supernatants at different days post inoculation (pi). It was generated both a master sample and a working sample by inoculation of Sendai virus in embryonated chicken eggs. The working sample undiluted and 10-fold serial dilutions were used to immunize mice following different schemes of inoculation. Serum and ascitic fluid samples were collected and showed titers of specific antibodies between 64 and 256, by hemaglutination inhibition (HAI) and IFI, whereas serum and ascitic fluid samples showed titers between 6400 and 204800, by ELISA. The master sample for MHV virus and Working sample was obtained by inoculation of the virus in L929 cell monolayers. The MHV virus 10- fold serial dilutions were used to immunize mice following different schemes of inoculation. Serum and ascitic fluids samples were collected and specific antibody titers between 32 and 2048 by IFI, while ELISA titers were between 3200 and 12800 for the serum and 200 to 6400 for ascitic fluids samples, for the same samples. The master sample for MVM virus and Working sample was obtained by inoculation of the virus in L929 cell monolayers. The working sample and 10-fold serial dilutions of MVM virus were used to immunize mice following different schemes of inoculation.Serum and ascitic fluids samples were collected and specific antibody titers between 32 and 128 by indirect IFI, while ELISA titers were between 1600 and 6400 for serum and 200 to 800 for ascites fluids samples, for same samples. The antigen for IFA tests consisted of whole cells, while for the ELISA was lysed cells by sonication. Sendai virus for both antigens was obtained on day 7pi in LLCMK2 cells by inoculation of 0.1 UHA of working sample. For MVM virus was inoculated ~10 6DICT 50 / mL and MHV was inoculated ~105 DICT 50 / mL. They were processed L929 cells and used on day 1 and 5pi respectively. Our results show that the development of specific IFI and ELISA, (complemented by the classical test of HAI for Sendai virus), comprise a battery of innovative and reliable tests for the detection of antibodies against Sendai virus, MHV virus and MVM virus in laboratory mice. These initial data reveal that both tests might be efficient tools for the monitoring of contamination by these viral agents in colonies of specific pathogen free mice. The studies presented could be considered as a starting point for the development of future advances in this field of knowledge. Keywords: specific pathogen free mice, rodent virus contaminantion, enzyme immunoassay (ELISA), immunoflurescence assay (IFI)

El éxito de la fecundación humana depende, entre otros eventos moleculares, de la capacidad de los espermatozoides para llevar a cabo de forma adecuada la capacitación. Este proceso implica una serie de cambios bioquímicos en los espermatozoides para favorecer su interacción con el gameto femenino. Aunque es posible capacitar las células in vitro, el tiempo óptimo para que un espermatozoide complete la capacitación en estas condiciones sigue siendo objeto de debate debido a la falta de biomarcadores de capacitación adecuados. Los estudios en esta área, se han centrado en aquellos receptores espermáticos implicados en la interacción entre gametos. En particular, el complejo molecular formado por la proteína de choque térmico A2 (HSPA2; del inglés heat shock protein A2), la molécula de adhesión a hialuronidasa 1 (SPAM1; del inglés sperm adhesion molecule 1) y la proteína arilsulfatasa A (ARSA; del inglés arylsulfatase A), ha sido estudiado por varios grupos de investigación debido a su participación en el reconocimiento del ovocito por parte del espermatozoide. Los estudios más relevantes sobre la ubicación de este complejo se basan en la evidencia de la colocalización de estas proteínas en la región periacrosomal de la cabeza espermática. Sin embargo,Esta premisa es controvertida, ya que otros autores han encontrado una asociación entre diferentes áreas de distribución de HSPA2 en la cabeza del espermatozoide y la fertilidad. A pesar del importante papel que desempeña este complejo proteico durante la unión del espermatozoide a la zona pelúcida del ovocito (ZP), aún no se ha ilustrado el grado de dependencia del tiempo de capacitación sobre la presencia y distribución de una topografía específica en la superficie espermática de estas proteínas. Con esta premisa, en la presente tesis evaluamos la influencia del tiempo de capacitación in vitro en la localización y distribución de HSPA2 y ARSA en la cabeza de espermatozoides humanos. De esta manera, y mediante microscopía de fluorescencia, se evaluó la presencia de HSPA2 y ARSA en donantes normozoospérmicos2 tanto antes como tras la capacitación in vitro durante una y cuatro horas. Además, se utilizó la microscopía electrónica de campo de alta resolución (FE-SEM; microscopía electrónica de barrido de emisión de campo; del inglés field emission scanning electron microscopy) para cuantificar la densidad de ARSA y la localización específica de esta proteína en los diferentes dominios de la membrana espermática antes y después de la capacitación in vitro durante una y cuatro horas. Con respecto al porcentaje de células positivas para HSPA2, no se observaron diferencias significativas entre las poblaciones analizadas antes y después de una hora de capacitación. No obstante, observamos un porcentaje significativamente mayor de células marcadas con HSPA2 tras cuatro horas de capacitación in vitro. A pesar de que no se pudo determinar un patrón de distribución de HSPA2 predominante en las células que fueron positivas antes de la capacitación, el patrón de distribución mayoritario después de la capacitación fue de fluorescencia en la banda ecuatorial y el acrosoma. Al estudiar la distribución de ARSA se observó un aumento significativo en el porcentaje de células positivas para esta proteína tras la capacitación, pero sin diferencias entre una y cuatro horas de incubación. Al igual que ocurría con HSPA2, el análisis mediante microscopía de fluorescencia no mostró un patrón mayoritario de distribución de ARSA en la subpoblación espermática previa a la capacitación, mientras que, tras este proceso las células presentaron de manera predominante un marcaje intenso en la región acrosomal. Por otra parte, el análisis mediante microscopía electrónica de barrido de emisión de campo mostró una agregación de ARSA en la región periacrosomal tras la capacitación. Nuestros resultados apuntan que el complejo formado por HSPA2, ARSA y SPAM1 requiere más de una hora de capacitación in vitro para distribuirse correctamente en la cabeza espermática. Además, el presente estudio proporciona evidencias sólidas de la utilidad de HSPA2 y ARSA como biomarcadores de capacitación, sugiriendo su uso como biomarcadores suplementarios al clásico análisis seminal previo a una técnica de reproducción artificial. / Este trabajo de investigación ha sido subvencionado por la Cátedra Human Fertility de la Universidad de Alicante y los proyectos de I+D+i ViGrob-186 y UAIND17-03.

Parallel detection of antibodies with different specificity has many potential applications in epidemiological research, vaccine development and in the diagnosis of allergies, autoimmune and infectious diseases. Although ELISA-based tests are suitable for this purpose, available assays can be time consuming and require large quantities of both sample and reagents thus limiting their application for mass screening. / Revisión por pares