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Avant d'être libéré dans la fente synaptique, le glutamate est accumulé dans les vésicules présynaptiques par les transporteurs vésiculaires du glutamate (VGLUTs). Il existe 3 types de VGLUTs. VGLUT3 possède une distribution anatomique et des fonctions atypiques. Au sein du système nerveux central, VGLUT3 est exprimé dans des neurones glutamatergiques mais aussi non glutamatergiques, dans lesquels il assure les fonctions de co-transmission ou de synergie vésiculaire. On le retrouve notamment dans certains neurones sérotoninergiques du raphé. Au sein de l'oreille interne, VGLUT3 est l'unique VGLUT décrit dans les cellules ciliées internes (CCI). La sérotonine joue un rôle essentiel dans le contrôle respiratoire néonatal. En étudiant la respiration de souriceaux n'exprimant plus le VGLUT3, nous avons démontré le rôle de VGLUT3 dans l'adaptation au stress hypoxique néonatal. Une mutation de VGLUT3 a été mise en évidence dans une surdité humaine très proche cliniquement de la presbyacousie et appelée DFNA25. En étudiant le phénotype auditif de souris exprimant cette mutation, nous avons prouvé l'implication de cette mutation dans l'atteinte des CCI à l'origine de la surdité DFNA25. L'étude des processus biochimiques mis en jeu nous a permis d'envisager un rôle indirect de VGLUT3 dans l'activation de la mort autophagique, via la protéine Becline 1 et une possible interaction au sein de la voie de la Culline 3. L'ensemble de ce travail nous a permis de mettre en évidence un rôle de VGLUT3 dans l'adaptation aux conditions extrêmes telles que le développement néonatal ou le processus de vieillissement. Il ouvre de nouvelles perspectives sur les diverses fonctions des VGLUTs. / Before its release into synaptic cleft, glutamate is accumulated in presynaptic vesicles by vesicular glutamate transporters (VGLUTs). There are 3 types of VGLUTs. VGLUT3 presents atypical functions and anatomical distribution. In the central nervous system, VGLUT3 is expressed in glutamatergic and non glutamatergic neurons, in which it performs the co-transmission and the vesicular synergy. Particularly, we can observe VGLUT3 in serotoninergic neurons of raphe. In the inner ear, VGLUT3 is the unique VGLUT described in the inner hair cells (IHCs). Serotonin plays a key role in the neonatal respiratory control. By exploring the respiration of VGLUT3 knock out mice pumps, we have demonstrated the role of VGLUT3 in the response to neonatal hypoxic stress. One VGLUT3 mutation has been described in a human deafness clinically very close to presbycusis, the DFNA25 deafness. By studying the auditory phenotype of mice expressing this VGLUT3 mutation, we have proved the implication of this mutation in the IHCs impairment at the origin of DFNA25 deafness. Biochemical analysis have helped us to consider an indirect role of VGLUT3 in the autophagic death. Beclin 1 and a possible interaction between VGLUT3 and the Cullin3 pathways could be implicated. All of our results allowed us to highlight a role of VGLUT3 in the adaptation to extreme conditions like neonatal development or aging process. They open new perspectives on the various functions of VGLUTs.

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L'encodage du signal acoustique en impulsions nerveuses se réalise au niveau des synapses à ruban des cellules ciliées internes (CCI) de la cochlée. Une dépolarisation déclenche l'exocytose des vésicules synaptiques suite à l'activation des canaux calciques CaV1.3 et à l'action d'un senseur calcique particulier, l'otoferline, une grande protéine se composant d'un domaine transmembranaire en C-terminal et de six domaines C2 (A-F) pouvant lier le Ca2+ et les phospholipides. Afin de caractériser le rôle de ces différents domaines C2, nous avons utilisé des vecteurs viraux (AAV) permettant l'expression de formes raccourcies de l'otoferline (mini-Otof) in vivo dans les CCI de souris dépourvues d'otoferline (Otof -/-). Nous montrons que les mini-Otof contenant les domaines C2-EF, C2-DEF ou C2-ACEF sont suffisantes pour restaurer l'exocytose rapide des CCI Otof -/-, sans toutefois restaurer l'audition car le recrutement des vésicules synaptiques reste altéré. Nous révélons pour la première fois la présence d'une endocytose ultra-rapide (t < 20 ms) dynamine- et otoferline-dépendante, une fonction certainement essentielle à l'homéostasie membranaire des CCI. L'expression des mini-Otof C2-EF et C2-DEF a également permis de restaurer partiellement la composante rapide de l'inactivation du courant calcique des CCI, celle-ci étant absente chez les souris Otof -/-. Cette inactivation rapide est réalisée par les isoformes courtes Cav1.3S qui ont leur partie C-terminale régulatrice tronquée, contrairement aux isoformes longues Cav1.3L dépourvues d'inactivation. Afin de différencier les rôles spécifiques de ces isoformes dans le cycle des vésicules synaptiques, nous avons utilisé la technologie CRISPR-Cas9, nous permettant d'éditer spécifiquement la partie C-terminale régulatrice des canaux Cav1.3L. Nos résultats montrent que les souris CRISPR-Cav1.3L présentent une surdité sévère expliquée au niveau des CCI par un défaut de recrutement vésiculaire aux zones actives, alors que les Cav1.3S inaltérés contrôlent la fusion rapide des vésicules synaptiques. / The precise encoding of acoustic signals into nerve impulses is achieved at the ribbon synapses of inner hair cells (IHC) of the cochlea. Exocytosis of synaptic vesicles by IHC is triggered by voltage-activation of Cav1.3 calcium channels and the action of a specific calcium sensor, otoferlin, a large protein with a single C-terminal transmembrane domain and six C2 (A-F) domains which binds Ca2+ and interacts with phospholipids. In order to characterize the function of the various otoferlin C2 domains, we used viral vectors (AAV) allowing the expression of shortened forms of otoferlin (mini-Otof), in vivo, in IHC from mice lacking otoferlin (Otof -/-). We show that mini-Otof containing C2-EF, C2-DEF or C2-ACEF domains are sufficient to restore fast synaptic vesicle exocytosis in Otof -/- IHC, but without restoring hearing because vesicular replenishment remains impaired. For the first time, we also uncover an ultra-fast endocytosis (t < 20 ms) dynamin- and otoferlin-dependant, a function that is certainly essential for a fast regulation of IHC membrane homeostasis. Furthermore, the expression of the mini-Otof C2-EF and C2-DEF also partially restored the fast component of the Ca2+ current inactivation in Otof -/- IHC. This rapid inactivation is carried out by Cav1.3S short isoforms which have a truncated C-terminal regulatory domain, unlike Cav1.3L long isoforms which display no inactivation. To characterize the specific role of these Cav1.3 isoforms, we used CRISPR-Cas9 technology, allowing a specific removal of the C-terminal regulatory part of the Cav1.3L channels in IHC. Our results show that CRSIPR- Cav1.3L mice display severe deafness explained at the IHC level by a defect in vesicular replenishment of the active zones, while Cav1.3S are sufficient to ensure fast and transient exocytosis of docked synaptic vesicles.

Avant sa libération, le glutamate est accumulé dans des vésicules synaptiques par trois transporteurs vésiculaires (VGLUT1-3). Les cellules ciliées internes (CCI) de la cochlée n'expriment que VGLUT3. Pour étudier son rôle dans la physiologie cochléaire, nous avons utilisé une lignée de souris dont le gène Slc17a8, qui code pour VGLUT3, a été invalidé par recombinaison homologue. Les mutants ne présentaient pas de réponse nerveuse à une stimulation sonore. Les mécanismes d'exocytose des CCI étaient normaux et leurs synapses normales en microscopie électronique. Des immunoblots montraient que le transporteur membranaire du glutamate GLAST, ainsi que les sous-unités GLUR2 et NR1 des récepteurs AMPA et NMDA étaient toujours exprimées. Enfin, des potentiels auditifs du tronc cérébral étaient enregistrés après une stimulation électrique au niveau de la fenêtre ronde. Toutefois, nos résultats indiquent des diminutions de ~50% des synapses afférentes et de ~40% des neurones auditifs primaires ainsi qu'une réduction importante des terminaisons efférentes latérales sous les CCI.SLC17A8 est responsable de la surdité de perception non syndromique dominante DFNA25. Nous avons identifié une mutation dans l'exon 5 conduisant au remplacement de l'Alanine211 en Valine. Cette Alanine est conservée dans les VGLUT3 de différentes espèces ainsi que dans les VGLUT1-3 humains, suggérant un rôle fonctionnel important pour cet acide aminé. Nous avons caractérisé les propriétés biochimiques de la mutation A211V en culture de cellules. Le transporteur muté était correctement adressé aux boutons présynaptiques. Cependant, la mutation pA211V entraîne un défaut d'expression important en partie expliqué par le fait que le codon codant la valine est un codon rare. De plus, les études du transport de glutamate ont montré que la forme mutée est hyperactive par rapport à la forme native. L'ensemble de ces résultats montre que la mutation entraine un phénotype cellulaire complexe. / Before its release, glutamate is accumulated into synaptic vesicles by three vesicular glutamate transporters (VGLUT1-3). Only VGLUT3 is expressed in the inner hair cells (IHCs) of the cochlea. To study its role in the hearing physiology, we used a mouse in which the Slc17a8 gene, which encodes VGLUT3, has been null-mutated. In this VGLUT3-/- mouse, no auditory nerve response to acoustic stimuli could be recorded. All the others cochlear potentials were normal. The genetic deletion of Slc17a8 in mice resulted in a profound deafness, without altering the IHCs synapse morphology and the synaptic vesicles turnover. Using western blot, we then observed that the glutamate-aspartate transporter GLAST and the GLUR2 and NR1 subunits of AMPA and NMDA receptors were always expressed. Finally, auditory brainstem responses could be elicited by electrical stimuli on the round window. However, VGLUT3-/- IHCs presented a ~50% loss of IHCs synapses and a ~40% loss of primary auditory neurons. The number of lateral olivocochlear synapses with primary auditory neurons dendrites was strongly reduced.The SLC17A8 gene is responsible for DFNA25, an autosomal dominant progressive, high-frequency nonsyndromic deafness. We identified a heterozygous non-synonymous missense mutation in exon 5, leading to the amino acid change p.A211V. The A211 residue is conserved in VGLUT3 across species and in all the human VGLUT subtypes (VGLUT1-3), suggesting an important functional role. We characterized the biochemical properties of the A211V mutation in cell culture. Our results suggest that the mutated VGLUT3 was correctly addressed at the presynaptic boutons. However, the pA211V mutation induced an expression decrease because the valine codon is a rare codon. Moreover, the glutamate uptake is increased with the mutated VGLUT3. All these results shows that this mutation involves a complex cellular phenotype.