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Isolement et caractérisation des saponines extraites de plantes de la famille des Asparagaceae, Amaryllidaceae et Caprifoliaceae, et évaluation de leurs activités cytotoxiques / Isolation and characterization of saponins extracted from plants of the Asparagaceae, Amaryllidaceae and Caprifoliaceae, and evaluation of their cytotoxic activities

Rezgui, Abdelmalek 15 December 2014 (has links)
Cette thèse s’inscrit dans le cadre de la thématique du laboratoire de Pharmacognosie de l’UFR Santé, au sein de l’Université de Bourgogne. Elle vise essentiellement la recherche de molécules d’origine végétale issue de la biodiversité tropicale dotées d’une activité antitumorale et immuno-modulatoire dont principalement les saponines. Ce sont des glycosides triterpéniques ou stéroïdiques connus pour leurs nombreuses propriétés pharmacologiques. L’étude de 4 espèces végétales appartenant à 3 familles à savoir Dracaena marginata L., Dracaena fragrans Ker Gawl (Asparagaceae), Allium flavum L. (Amaryllidaceae) et Weigela stelzneri (Caprifoliaceae),a conduit à l’isolement et à la caractérisation de 26 glycosides naturels. Il s’agit de 22 saponines stéroïdiques parmi lesquelles 6 sont de structure nouvelle ainsi que 4 saponines triterpéniques dont 3 nouvelles. Les structures ont été élucidées principalement par l’utilisation de la RMN 2D ainsi que la spectrométrie de masse. 10 des 26 molécules isolées ont été testées en vue d’évaluer leurs activités cytotoxiques sur deux lignées cellulaires cancéreuses (SW480 et EMT-6), et 3 pour l’étude de la modulation de la production d’une cytokine pro-inflammatoire, l’interleukine IL-1β sur cellules PBMC stimulées par le LPS. Nos résultats montrent que 6 d’entre elles possèdent une activité cytotoxique modérée sur les deux lignées cancéreuses. En revanche, deux saponines triterpéniques de type oléanane exercent les plus fortes cytotoxicités sur les deux lignées cancéreuses comparées à celles des références internes (Etoposide et Methotrexate). De plus elles révèlent un important effet de modulation de la production de l’interleukine IL-1β sur cellules PBMC et de ce fait, un fort potentiel anti-inflammatoire. Des relations structure/activité ont été ainsi proposées. / This thesis was carried out in the Laboratory of Pharmacognosy, in health department of the University of Burgundy. The principal theme of this Laboratory is the research of natural compounds from tropical biodiversity, mainly saponins with antitumoral and immunomodulatory activities. These molecules are triterpenic or steroidic glycosides, well known for their various pharmacological activities. The study of 4 species belonging to 3 different families: Dracaena marginata L., Dracaena fragrans Ker Gawl (Asparagaceae), Allium flavum L. (Amaryllidaceae) et Weigela stelzneri (Caprifoliaceae), led to the isolation and characterization of 26 natural glycosides. Among them, 22 were steroidic saponins with 6 new structures and 4 were triterpenic saponins with 3 new structures. The spectral analysis was achieved using mainly 2D NMR and mass spectrometry. The cytotoxic activities of 10 isolated compounds were evaluated on 2 strains cancer cells (SW480 and EMT-6), and 3 compounds for studying the modulatory effect of the production of pro-inflammatory cytokine, interleukin IL-1β on PBMCs stimulated with LPS. Our results show that six of them have moderate cytotoxic activity on both cancer cell lines. However, two oleanane-type triterpene saponins exert the strongest cytotoxicity on both cancer cell lines compared to internal references (Etoposide and Methotrexate). Moreover they show a significant effect of modulating the production of interleukin IL-1β on PBMCs and thereby a strong anti-inflammatory potential. Structure / activity relationships have been proposed.
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Studies on IL-18 in HIV infection : effects of the cytokine on intestinal integrity, and platelets as a new source of the cytokine

Allam, Ossama 03 1900 (has links)
L'interleukine IL-18 (IL-18), un membre de la famille de l’IL-1, est une cytokine pro-inflammatoire multifonctionnelle. Elle est produite par les monocytes, les macrophages, les cellules dendritiques, les cellules épithéliales, les kératinocytes et le cortex surrénal dans le corps humain. Cette cytokine est d'abord produite comme une protéine précurseure inactive, qui est par la suite clivée en une forme mature par la caspase-1 activée. La caspase, en elle-même, existe comme précurseur inactif dans les cellules humaines et requiert l'assemblage d'inflammasomes pour son activation. L'IL-18 pour joue un rôle clé dans la médiation des conditions inflammatoires. Notre laboratoire et d'autres ont montré que l'infection par le VIH est accompagnée d'une augmentation des taux circulants d'IL-18 avec une diminution des niveaux de son antagoniste, l'interleukine-18 binding protein (IL-18BP). Dans cette thèse, nous démontrons pour que l'IL-18 est également produite et sécrétée par les plaquettes humaines lors de leur activation. Les plaquettes contiennent des composants de l'inflammasome. Ils assemblent et activent la caspase-1, qui ensuite traite le précurseur de l'IL-18 dans sa forme mature au cours du processus d'activation des plaquettes. La cytokine est synthétisée de novo lors de l'activation des plaquettes. Contrairement à l'IL-18, les plaquettes expriment constitutivement l’IL-18BP, et la libèrent de manière constitutive, ainsi que lors de l'activation. L'IL-18 et l'IL-18BP sont colocalisés avec CD63, un marqueur pour les granules α des plaquettes. L'IL-18 libéré des plaquettes constitue la source principale de cette cytokine dans la circulation humaine chez les individus sains. Nous avons identifié des concentrations faibles de cette cytokine dans les lysats de plaquettes chez les individus infectés par le VIH par rapport à ceux en santé. D'autre part, les concentrations ont été augmentées dans le sérum et le plasma pauvre en plaquettes chez les individus infectés. Des résultats similaires ont été obtenus avec l'IL-18BP dans les lysats de plaquettes d'individus sains et infectés par le VIH. Cependant, des quantités plus faibles de cet antagoniste ont été trouvées dans le sérum et le plasma pauvre en plaquettes d'individus infectés par le VIH par rapport à ceux en santé. Nos résultats ont des implications importantes pour les maladies inflammatoires chroniques dans laquelle une activité accrue de l'IL-18 joue un rôle pathogène. Le VIH est également accompagné par une inflammation intestinale et une diminution de l'intégrité intestinale, mesurée par la réparation de la muqueuse, la régénération et la perméabilité. Cependant, on en sait peu sur la relation entre le niveau élevé de l'IL-18 associé à l'infection au VIH et la perméabilité intestinale: ceci n'a jamais été étudié. Dans cette thèse, nous démontrons le rôle du virus et sa protéine Tat à augmenter la production d'IL-18 chez deux lignées de cellules épithéliales intestinales (HT29 et Caco2) ainsi qu'une diminution de l'IL-18BP. L'IL-18 induit une hyperperméabilité de la barrière épithéliale en perturbant à la fois les jonctions serrées et adhérentes, et ce, en modulant l'expression et la distribution de l'occludine, de claudine-2 et de la bêta-caténine. Une désorganisation de l'actine F a également été observée dans les cellules lors de l'incubation avec l'IL-18. Les mêmes observations ont été faites avec la protéine Tat du VIH-1. Après une incubation prolongée, l'IL-18 a causé la mort des cellules intestinales et induit l'apoptose par l'activation de la caspase-1 et la caspase-3. Fait intéressant, les taux plasmatiques de lipopolysaccharides chez trois catégories différentes de patients au VIH (ART-naïf, ART-traitée et contrôleurs élite) sont en corrélation avec les niveaux plasmatiques de l'IL-18. Enfin, nous avons étudié la voie de signalisation à travers laquelle l'IL-18 induit une perméabilité intestinale accrue. En bref, nos études identifient les plaquettes comme une source importante d'IL-18, et leur activation lors d'une infection à VIH contribue à des concentrations accrues de cette cytokine. Le virus entraine également l'augmentation de la production de cytokines par les cellules épithéliales intestinales. L'activité biologique accrue de ces cytokines contribue à la pathogenèse du sida en augmentant la perméabilité intestinale et en causant la mort des cellules intestinales. L'IL-18 pourrait servir de cible moléculaire pour retarder la progression du sida et réduire l'inflammation chronique dans un stade précoce d'une infection à VIH. / Interleukin IL-18 (IL-18), a member of the IL-1 family, is a multifunctional pro-inflammatory cytokine. It is known to be produced by monocytes, macrophages, dendritic cells, keratinocytes and the adrenal cortex in the human body. This cytokine is produced as an inactive precursor protein, which is cleaved into mature form by activated caspase-1. The caspase itself exists as an inactive precursor in human cells and requires inflammasomes assembly for its activation. IL-18 has been shown to play a key role in mediating different inflammatory conditions. Our laboratory and others have shown that HIV infection is accompanied with increased circulating levels of IL-18 along with decreased levels of its antagonist IL-18 Binding Protein (IL-18BP). In this thesis, we show that IL-18 is also produced and secreted by human platelets upon activation. The platelets also contain components of the inflammasome. They assemble and activate caspase-1 and process the precursor IL-18 into its mature form during the platelet activation process. The cytokine is synthesized in platelets de novo upon activation. Contrary to IL-18, the platelets constitutively express pre-formed IL-18BP, and release it constitutively as well as upon activation. Both IL-18 and IL-18BP colocalized with CD63, a marker for the platelet α granules. Platelet-released IL-18 constitutes the main source of this cytokine in the human circulation in healthy individuals. We found decreased amounts of this cytokine in the platelet lysates in HIV-infected individuals as compared to the healthy ones. On the other hand, its concentrations were increased in the serum and platelet-poor plasma in infected individuals. Similar findings were obtained with IL-18BP in platelet lysates from healthy and HIV-infected individuals. However, lower amounts of this IL-18 antagonist were found in the serum and platelet-poor plasma from HIV-infected individuals compared with the healthy ones. Our findings have important implications for chronic inflammatory disease conditions in which increased IL-18 activities play a pathogenic role. HIV is also accompanied by intestinal inflammation and decreased intestinal integrity as measured by mucosal repair, regeneration and permeability. However, little is known concerning the relation between high level of IL-18 associated to HIV infection and intestinal permeability. In this thesis, we demonstrate the role of HIV and its protein Tat in increasing IL-18 production in two intestinal epithelial cell lines (HT29 and Caco2) and decreasing IL-18BP. IL-18 induces epithelial barrier hyperpermeability by disrupting both tight and adherens Junctions by modulating expression and distribution of occludin, claudin-2 and beta-catenin. Disorganization of F-actin was also observed within the cells upon incubation with treated by IL-18. Upon prolonged incubation, IL-18 caused intestinal cells death and induced apoptosis by activating caspase-1 and caspase-3. Interestingly, the plasma levels of lipopolysaccharide in three different categories of HIV-infected patients (ART-naïve, ART-treated and Elite controllers) correlated with their IL-18 plasma levels. Finally we investigated the signaling pathway through which IL-18 induces increased intestinal permeability. Briefly, our studies identified platelets as an important source of IL-18, and their activation in HIV infection contributes to enhanced concentrations of the cytokine. The virus also induces increased production of the cytokine from intestinal epithelial cells. Increased biological activities of the cytokine contribute towards AIDS pathogenesis by increasing intestinal permeability and causing death of intestinal cells. The cytokine may serve as a molecular target for delaying AIDS progression and reducing low-grade chronic inflammation in HIV infection.

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