The cyclic nucleotide monophosphates (CNs), cAMP and cGMP, are second messengers that participate in the regulation of development, metabolism and adaptive responses. In plants, CNs are associated with the control of pathogen responses, pollen tube orientation, abiotic stress response, membrane transport regulation, stomatal movement and light perception. In this study, we hypothesize that cAMP and cGMP promote changes in the transcription level of genes related to photosynthesis, high light and membrane transport in Arabidopsis thaliana leaves and, that these changes at the molecular level can have functional biological consequences. For this reason we tested if CNs modulate the photosynthetic rate, responses to high light and root ion transport. Real time quantitative PCR was used to assess transcription levels of selected genes and infrared gas analyzers coupled to fluorescence sensors were used to measure the photosynthetic parameters. We present evidence that both cAMP and cGMP modulate foliar mRNA levels early after stimulation. The two CNs trigger different responses indicating that the signals have specificity. A comparison of proteomic and transcriptional changes suggest that both transcriptional and post-transcriptional mechanisms are modulated by CNs. cGMP up-regulates the mRNA levels of components of the photosynthesis and carbon metabolism. However, neither cAMP nor cGMP trigger differences in the rate of carbon assimilation, maximum efficiency of the photosystem II (PSII), or PSII operating efficiency. It was also demonstrated that CN regulate the expression of its own targets, the cyclic nucleotide gated channels - CNGC. Further studies are needed to identify the components of the signaling transduction pathway that mediate cellular changes and their respective regulatory and/or signaling roles.

RALFs são peptídeos hormonais de aproximadamente 5kD que regulam negativamente o alongamento celular. Dentre suas atividades biológicas, a alcalinização do meio extracelular e a inibição do alongamento celular são tidas como associadas, pois a acidificação do meio extracelular é necessária para a expansão celular. A atividade de alcalinização e a de inibição do crescimento são medidas em dois ensaios distintos: o ensaio de alcalinização do meio extracelular de células em suspensão e o ensaio do crescimento de raiz primária de plantas jovens. Buscando-se fazer ambas as avaliações da inibição da expansão celular e da alcalinização em um único modelo de estudo, tomou-se como medida da expansão celular o volume das células decantadas (VCD). Quando o tampão MES ou o pré-tratamento com \"Fusicoccin\" foi utilizado para se atenuar o efeito de alcalinização do AtRALF1, verificou-se que o efeito de inibição do alongamento celular não sofreu alteração. Em arabidopsis são encontrados nove peptídeos RALF, que apresentam alta similaridade com o RALF original de tabaco. Com exceção do AtRALF4, todos são capazes de alcalinizar o meio extracelular e inibir raízes. A comparação da estrutura primária do AtRALF4 com os demais RALFs mostra que poucos resíduos são distintos entre eles, sugerindo que estes possam ser os determinantes das atividades de inibição e alcalinização. A alteração de um destes resíduos, AtRALF4(N92A), é capaz de restaurar a capacidade do AtRALF4 de inibir as raízes sem, no entanto, recuperar a atividade de alcalinização. Quando três outros resíduos exclusivos do AtRALF4 foram substituídos pelos seus correspondentes do AtRALF1, observa-se uma restauração parcial da alcalinização, desta vez, sem alterar a capacidade de inibir as raízes. Recentemente, foi mostrado pelo nosso grupo que o peptídeo AtRALF1 induz a expressão de genes relacionados ao rearranjo da parede celular. Quando verificado por PCR quantitativa, contatou-se que somente os peptídeos mutantes que apresentam atividade de inibição do crescimento são capazes de promover uma indução semelhante. Ainda, utilizando gel indicador de pH, verificou-se que plantas transgênicas super-expressando AtRALF1 (35S:AtRALF1) acidificam o meio durante seu crescimento de maneira semelhante a plantas selvagens. O peptídeo de defesa AtPEP1, a exemplo dos peptídeos RALF, também promove a alcalinização do meio extracelular. A utilização de drogas para reproduzir ou atenuar o efeito de alcalinização promovido por este peptídeo sugere que a expressão dos genes responsivos a AtPEP1 também não está relacionada à alteração na atividade das próton-ATPases. Finalmente, quando mutantes para ambos os receptores de AtPEPs foram utilizados (atpepr1/r2) em gel indicador de pH, verificou-se que estes alcalinizam o pH da rizosfera na presença do peptídeo. Nossos dados somados sugerem uma dissociação das atividades biológicas de alcalinização do meio extracelular e de inibição da expansão celular. A alteração na atividade das próton-ATPases pode não ser apenas uma mensagem secundária do efeito biológico, mas sim outra fonte de informação independente e ainda pouco explorada como tal. / RALFs are 5kD peptide hormones that negatively regulates cell expansion. Among the biological activities of the RALF peptide, the extracellular alkalinization and cellular expansion inhibition were previously suggested to be associated, once the extracellular acidification is required to cell expansion. Usually, the alkalinization and cell expansion inhibition activities are evaluated in two different assays, the cell suspension medium alkalinization and the plantlet root growth inhibition. We manage to set an assay in which both cell expansion inhibition and extracellular alkalinization activities could be evaluated. Using the package suspension cell volume through decantation as a value of cell expansion, we evaluated the relation between alkalinization and cell expansion inhibition in different conditions. When the MES buffer or the pre-treatment with Fusicoccin was used to arrest the AtRALF1 extracellular alkalinization, the package cell volume inhibition activity was not affected. There are 9 RALF peptides encoded in arabidopsis plants that are closely related with the first isoform isolated from tobacco. With exception of the AtRALF4, all those isoforms are able to alkalinize the extracellular medium and arrest root growth. Comparing the AtRALF4 with other eight isoforms, we verified that are few different amino acids between them, suggesting that those amino acids could be essential for the biological activities. The rescue of one of those amino acids, AtRALF4(N92A), was able to regain the root growth inhibition activity of the AtRALF4 peptide, although the extracellular alkalinization activity was not restored. When three other AtRALF4 amino acids were substituted by their AtRALF1 correspondent, there is a partial rescue of the extracellular alkalinization activity, but no alterations in the root growth inhibition. We had recently shown that the AtRALF1 peptide induces the expression of genes related to cell wall rearrangement. The quantitative PCR analyses demonstrates that only the mutant peptides that are able to arrest root growth are also able to induce the gene expression. When submitted to a pH indicator, it was verified that AtRALF1 overexpressing plants acidifies it during its growth, as much as wild type plants.The defense peptide AtPEP1, similarly of AtRALF1, also triggers extracellular alkalinization. The use of proton-pump chemical modulators to simulate or arrests AtPEP1 extracellular alkalinization activity suggests that the gene expression of the AtPEP1-responsive genes is not related to changes in plasma membrane proton pump activity. Finally, when double mutants for both the AtPEP1 receptors (atpepr1/r2) were submitted to a pH gel indicator, it was seen that they alkalinize the rhizosphere pH in the presence of the AtPEP1 peptide. Our data suggests that the extracellular alkalinization and arrest of cell expansion activities are dissociated. The proton pump modulation activity may not be only a secondary messenger, but another source of information independent and yet to be explored.

RALFs são peptídeos hormonais de aproximadamente 5kD que regulam negativamente o alongamento celular. Dentre suas atividades biológicas, a alcalinização do meio extracelular e a inibição do alongamento celular são tidas como associadas, pois a acidificação do meio extracelular é necessária para a expansão celular. A atividade de alcalinização e a de inibição do crescimento são medidas em dois ensaios distintos: o ensaio de alcalinização do meio extracelular de células em suspensão e o ensaio do crescimento de raiz primária de plantas jovens. Buscando-se fazer ambas as avaliações da inibição da expansão celular e da alcalinização em um único modelo de estudo, tomou-se como medida da expansão celular o volume das células decantadas (VCD). Quando o tampão MES ou o pré-tratamento com \"Fusicoccin\" foi utilizado para se atenuar o efeito de alcalinização do AtRALF1, verificou-se que o efeito de inibição do alongamento celular não sofreu alteração. Em arabidopsis são encontrados nove peptídeos RALF, que apresentam alta similaridade com o RALF original de tabaco. Com exceção do AtRALF4, todos são capazes de alcalinizar o meio extracelular e inibir raízes. A comparação da estrutura primária do AtRALF4 com os demais RALFs mostra que poucos resíduos são distintos entre eles, sugerindo que estes possam ser os determinantes das atividades de inibição e alcalinização. A alteração de um destes resíduos, AtRALF4(N92A), é capaz de restaurar a capacidade do AtRALF4 de inibir as raízes sem, no entanto, recuperar a atividade de alcalinização. Quando três outros resíduos exclusivos do AtRALF4 foram substituídos pelos seus correspondentes do AtRALF1, observa-se uma restauração parcial da alcalinização, desta vez, sem alterar a capacidade de inibir as raízes. Recentemente, foi mostrado pelo nosso grupo que o peptídeo AtRALF1 induz a expressão de genes relacionados ao rearranjo da parede celular. Quando verificado por PCR quantitativa, contatou-se que somente os peptídeos mutantes que apresentam atividade de inibição do crescimento são capazes de promover uma indução semelhante. Ainda, utilizando gel indicador de pH, verificou-se que plantas transgênicas super-expressando AtRALF1 (35S:AtRALF1) acidificam o meio durante seu crescimento de maneira semelhante a plantas selvagens. O peptídeo de defesa AtPEP1, a exemplo dos peptídeos RALF, também promove a alcalinização do meio extracelular. A utilização de drogas para reproduzir ou atenuar o efeito de alcalinização promovido por este peptídeo sugere que a expressão dos genes responsivos a AtPEP1 também não está relacionada à alteração na atividade das próton-ATPases. Finalmente, quando mutantes para ambos os receptores de AtPEPs foram utilizados (atpepr1/r2) em gel indicador de pH, verificou-se que estes alcalinizam o pH da rizosfera na presença do peptídeo. Nossos dados somados sugerem uma dissociação das atividades biológicas de alcalinização do meio extracelular e de inibição da expansão celular. A alteração na atividade das próton-ATPases pode não ser apenas uma mensagem secundária do efeito biológico, mas sim outra fonte de informação independente e ainda pouco explorada como tal. / RALFs are 5kD peptide hormones that negatively regulates cell expansion. Among the biological activities of the RALF peptide, the extracellular alkalinization and cellular expansion inhibition were previously suggested to be associated, once the extracellular acidification is required to cell expansion. Usually, the alkalinization and cell expansion inhibition activities are evaluated in two different assays, the cell suspension medium alkalinization and the plantlet root growth inhibition. We manage to set an assay in which both cell expansion inhibition and extracellular alkalinization activities could be evaluated. Using the package suspension cell volume through decantation as a value of cell expansion, we evaluated the relation between alkalinization and cell expansion inhibition in different conditions. When the MES buffer or the pre-treatment with Fusicoccin was used to arrest the AtRALF1 extracellular alkalinization, the package cell volume inhibition activity was not affected. There are 9 RALF peptides encoded in arabidopsis plants that are closely related with the first isoform isolated from tobacco. With exception of the AtRALF4, all those isoforms are able to alkalinize the extracellular medium and arrest root growth. Comparing the AtRALF4 with other eight isoforms, we verified that are few different amino acids between them, suggesting that those amino acids could be essential for the biological activities. The rescue of one of those amino acids, AtRALF4(N92A), was able to regain the root growth inhibition activity of the AtRALF4 peptide, although the extracellular alkalinization activity was not restored. When three other AtRALF4 amino acids were substituted by their AtRALF1 correspondent, there is a partial rescue of the extracellular alkalinization activity, but no alterations in the root growth inhibition. We had recently shown that the AtRALF1 peptide induces the expression of genes related to cell wall rearrangement. The quantitative PCR analyses demonstrates that only the mutant peptides that are able to arrest root growth are also able to induce the gene expression. When submitted to a pH indicator, it was verified that AtRALF1 overexpressing plants acidifies it during its growth, as much as wild type plants.The defense peptide AtPEP1, similarly of AtRALF1, also triggers extracellular alkalinization. The use of proton-pump chemical modulators to simulate or arrests AtPEP1 extracellular alkalinization activity suggests that the gene expression of the AtPEP1-responsive genes is not related to changes in plasma membrane proton pump activity. Finally, when double mutants for both the AtPEP1 receptors (atpepr1/r2) were submitted to a pH gel indicator, it was seen that they alkalinize the rhizosphere pH in the presence of the AtPEP1 peptide. Our data suggests that the extracellular alkalinization and arrest of cell expansion activities are dissociated. The proton pump modulation activity may not be only a secondary messenger, but another source of information independent and yet to be explored.

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / The aim of this study was to determine the intensity of Ichthyophthirius multifiliis infection, as well as net ion fluxes (Na+, K+ and Cl-), in silver catfish juveniles exposed to different pHs (5, 6, 7, 8, and 9 for sixteen days), pH (5.0 and 7.0) and hardness (20, 60 and 120 mg CaCO3.L-1 for sixteen days) and the oxidative stress parameters in liver, gill and muscle of this species and submitted to different pH (5.0 and 7.0 for three days). Net Na+, K+, and Cl- fluxes were determined at different times, trophonts in the skin and gill were counted, and mortality was registered daily. After six days fish kept at pH 6.0, 7.0, 8.0 and 9.0-hardness 20 mg CaCO3.L-1 showed significantly higher cumulative mortality (100% after eight days) and number of trophonts on the skin and gill compared to pH 5.0-hardness 20 mg CaCO3.L-1. Infected silver catfish showed significantly higher Na+ and K+ effluxes in the first day, and there was a recovery (influx) after the second day compared to asymptomatic juveniles. Silver catfish juveniles infected with I.multifiliis and exposed to pHs 5.0 and 7.0 presented significantly higher TBARS levels in the liver and gills compared to asymptomatic juveniles. The activity of catalase in the liver of silver catfish juveniles infected and exposed to both pHs was significantly lower (1st and 3rd day) than in asymptomatic juveniles. The GST activity in the liver and gills of infected juveniles increased throughout all experimental period compared to asymptomatic juveniles. The muscle of infected juveniles maintained at pH 5.0 showed significantly lower TBARS levels at day three compared to asymptomatic juveniles. The CAT activity was significantly lower in the muscle of infected juveniles at pH 5.0 and 7.0 at all experimental days except day 1 at pH 7.0 compared to asymptomatic juveniles. The muscle of infected juveniles presented significantly lower GST activity in all experimental period at both pH 5.0 and 7.0 compared to asymptomatic juveniles. These results allowed us to conclude that infection by I. multifiliis is less severe in silver catfish maintained at pH 5.0-hardness 20 mg CaCO3.L-1. Increase of water hardness increases trophonts infection and impairs survival in silver catfish kept at pH 5.0, but the opposite is observed when juveniles are at pH 7.0. There was no clear evidence of a relationship between mortality and trophonts number in infected silver catfish with net ion fluxes. Infection with I. multifiliis induces liver and gill damage via lipid peroxidation products, but the same is not observed in the muscle. / O objetivo deste estudo foi determinar a intensidade da infecção pelo Ichthyophthirius multifiliis, assim como o fluxo líquido de íons (Na+, K+ e Cl-), em juvenis de jundiá expostos a diferentes pHs (5,0; 6,0; 7,0; 8,0 e 9,0 por dezesseis dias), pH (5,0 e 7,0) e dureza (20, 60 e 120 mg CaCO3/L por dezesseis dias) e os parâmetros de estresse oxidativo no fígado, brânquias e músculo nesta espécie e submetida a diferentes pHs (5,0 e 7,0 por 3 dias). O fluxo dos íons Na+, K+ e Cl- foi determinado em diferentes tempos, o número de trofontes na pele e nas brânquias foi contado e a mortalidade foi registrada diariamente. Após seis dias os peixes submetidos aos pHs 6,0; 7,0; 8,0 e 9,0-dureza de 20 mg CaCO3/L apresentaram mortalidade cumulativa (100% após oito dias) e numero de trofontes na pele e nas brânquias significativamente maior que os mantidos em pH 5,0-dureza de 20 mg CaCO3/L. Jundiás infectados apresentaram efluxo de Na+ e K+ significativamente maior no primeiro dia, havendo uma recuperação (influxo) a partir do segundo dia em relação aos juvenis assintomáticos. Juvenis de jundiá infectados com I.multifiliis e expostos aos pHs 5,0 e 7,0 apresentaram significativo aumento dos níveis de TBARS no fígado e nas brânquias em relação aos juvenis assintomáticos. A atividade da catalase no fígado dos juvenis de jundiás infectados e expostos a ambos pHs foi significativamente maior e menor (1º e 3º dia), em relação aos juvenis assintomáticos. A atividade da GST no fígado e nas brânquias aumentou durante todo o período experimental em relação aos juvenis assintomáticos. O músculo dos juvenis infectados e mantidos em pH 5,0 apresentou significativa diminuição nos níveis de TBARS no terceiro dia comparado aos juvenis assintomáticos. A atividade da catalase foi significativamente menor no músculo dos juvenis infestados e submetidos ao pH 5,0 e 7,0 em todos os dias experimentais, exceto no primeiro dia em pH 7,0 quando comparada aos juvenis assintomáticos. O músculo dos juvenis infectados apresentou atividade da GST significativamente menor em todo o período experimental em ambos pH 5,0 e 7,0 quando comparados aos juvenis assintomáticos. Estes resultados nos permitem concluir que a infecção pelo I. multifiliis é menos severa em jundiás mantidos em pH 5,0-dureza de 20 mg CaCO3/L. O aumento da dureza da água aumenta a infecção pelos trofontes e afeta a sobrevivência dos jundiás mantidos em pH 5,0, mas o oposto é observado quando os juvenis estão no pH 7,0. Não houve uma evidência clara da relação entre a mortalidade e o número de trofontes nos juvenis de jundiá infectados com o fluxo líquido de íons. A infecção por I. multifiliis induz danos no fígado e brânquias, via produtos da peroxidação lipídica, o mesmo não ficando evidenciado no músculo.

No description available.