Flüchtige organische Verbindungen (volatile organic compounds, VOCs) haben vielseitige Funktionen in der Biosphäre und Atmosphäre. VOCs sind an ober- und unterirdischen Interaktionen beteiligt. Zum Beispiel können von Mikroorganismen emittierte VOCs das Pflanzenwachstum beeinflussen und von Pflanzen emittierte VOCs sich auf das Verhalten von Pathogenen und Herbivoren auswirken. Nur wenig ist über die Rolle von VOCs in der Kommunikation von Ektomykorrhizapilzen (EMF) mit ihren Wirtspflanzen bekannt. EMF gehen Symbiosen mit Baumarten wie Pappeln (Populus spp.) ein. Pappeln sind als Biomasseproduzenten von großer ökonomischer Bedeutung, emittieren jedoch eine hohe Konzentration des klima-relevanten VOCs Isopren in die Atmosphäre. Die Rolle von Isopren in biotischen Interaktionen von Pappeln mit Herbivoren ist unklar. Zudem ist es wichtig zu verstehen wie EMF-Inokulation den Metabolismus von Pappeln und dadurch deren oberirdische Interaktion beeinflussen. Hauptziel dieser Arbeit war es, die Kommunikation durch VOCs zwischen Pflanzen und Pilzen zu untersuchen. Zu diesem Zweck wurden die Modellarten Laccaria bicolor und Populus × canescens verwendet. Um die Spezifität von VOC-Mustern sowie Pflanzen-Reaktionen zu untersuchen, wurden einige andere EMF und nicht-Mykorrhiza bildende Pilze getestet sowie die Nicht-Wirtspflanze Arabidopsis verwendet. Um die Bedeutung von Isopren oder EMF auf oberirdische Herbivorie zu untersuchen, wurde die Präferenz des Pappelblattkäfers (Chrysomela populi) und des Weidenblattkäfers (Phrotara vitellinae) für nicht-Isopren emittierende Pappeln überprüft. Insbesondere wurden folgende Fragestellungen untersucht: i) Können EMF und Pilze anderer Lebensweisen aufgrund ihrer VOC-Emissions-Muster voneinander unterschieden werden? ii) Sind pilzliche VOCs an der Erkennung von EMF durch Pappel und Arabidopsis beteiligt und wenn dies zutrifft, welche Verbindungen der Volatilen-Mischung sind an der Reaktion beteiligt? iii) Ist die Isopren-Emission von Pappeln für die Orientierung von Pappelblattkäfern von Bedeutung? iv) Beeinflusst eine Inokulation von Pappeln mit EMF die Abwehr gegen den Pappelblattkäfer C. populi und wenn, welche Transkriptionsveränderungen in den Blättern von EMF-inokulierten im Vergleich zu nicht-inokulierten Pflanzen sind an dieser Reaktion beteiligt? Untersuchungen über Mykorrhiza-Interaktion mit Pappeln erfordern kontrollierte Kultivierungs-Systeme. Daher werden detaillierte Protokolle für die Anzucht von Pappelarten mit und ohne EMF unter axenischen und Freiland-Bedingungen angegeben. Zur Untersuchung der Interaktion zwischen Pappeln und EMF werden zwei-geteilte Wachstumssysteme für die Kultivierung der Pflanzen ohne direkten Kontakt zu EMF beschrieben. i) Um die Spezifität und Gemeinsamkeiten von VOCs von EMF und anderen, nicht-Mykorrhiza bildenden Pilzen zu untersuchen, wurden VOC-Muster von Pilzen verschiedener Lebenssweisen verglichen. In der vorliegenden Arbeit wurden die VOC-Emissionen der drei EMF Cenococcum geophilum, L. bicolor und Paxillus involutus (Stämme MAJ und NAU), der drei Pathogene Armillaria mellea, Pholiota squarrosa und Verticillium longisporum sowie der zwei Saprophyten Stropharia rugosoannulata und Trichoderma viride im Gasraum der Kulturen gesammelt. Die Pilze wurden in Petrischalen auf einem synthetischen Medium, welches eine geringe eigene VOC-Emission aufwies, angezogen. Alle VOCs, welche in Kontrollschalen ohne Pilz gemessen wurden, wurden aus dem Datensatz entfernt. Nach Entfernung dieser 40 Hintergrund-VOCs der Kontrollplatten verblieben 54 Pilz-VOCs. Die untersuchten Pilze unterschieden sich stark in ihrem VOC-Emissions-Profil. Nur 15 VOCs wurden bei allen Lebensweisen identifiziert; darunter die typische Pilz-VOC 1-octen-3-ol. Fünfzehn VOCs wurden zuvor noch nicht bei Pilzen gemessen und einige VOCs wurden nur bei einem Pilz oder einer Lebensweise gefunden. Insbesondere die Emission der Sesquiterpene (SQTs) unterschied sich stark zwischen den Pilzen. Multivariate Analysen der VOC-Profile gruppierte die Pilzarten nach ihren Lebensweisen. ii) Zur Ermittlung, ob Pilz-VOCs wichtige Signalstoffe für Pflanzen sind, unabhängig von ihrer Fähigkeit eine Mykorrhiza bilden zu können, wurden die Wirtspflanze P. × canescens und die Nicht-Wirtspflanze A. thaliana VOCs der EMF L. bicolor und C. geophilum ausgesetzt. Pflanzen und Pilze wurden in einem geschlossenen System mit zwei separaten Kompartimenten und gemeinsamem Gasraum kultiviert. Sammeln der Pilz-VOC-Emissionen in den Kontrollplatten mit den Pflanzen zeigte, dass Arabidopsis nur wenige VOCs emittierte, wohingegen sowohl in den Kulturen von L. bicolor als auch in der gemeinsamen Kultur von L. bicolor mit Pflanzen vor allem SQTs detektiert wurden. Die Seitenwurzelbildung von Arabidopsis und Pappel wurde durch L. bicolor-VOCs angeregt. C. geophilum, welcher nicht fähig ist SQTs zu bilden, hatte keine Wirkung auf die Wurzelstruktur. Unterdrückung der SQT-Synthese in L. bicolor durch Inhibierung des Mevalonat-Biosyntheseweges mit Lovastatin verminderte die Stimulierung der Seitenwurzelbildung signifikant. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass pilzliche SQTs Seitenwurzelbildung auslösen. Das schwach emittierte Thujopsen stimulierte die Seitenwurzelbildung sowohl in Abwesenheit des Pilzes als auch bei einer Unterdrückung der SQT-Biosynthese des Pilzes durch Lovastatin. Das SQT β-Caryophyllene hatte keinen Einfluss auf die Wurzelstruktur. Diese Arbeit zeigt, dass pilzliche SQTs, darunter das spezifische Thujopsen, wichtige Signalstoffe in der Interaktion zwischen EMF und Wirts- sowie Nicht-Wirtspflanzen darstellen. iii) Die Käfer C. populi und P. vitellinae sind typisch vorkommende Schädlinge in Pappelplantagen und können signifikante ökonomische Verluste verursachen. Zur Ermittlung, ob von Pappelblättern emittiertes Isopren von C. populi und P. vitellinae Käfern wahrgenommen wird und eine Rolle bei der Orientierung dieser Käfer spielt, wurden verschiedene Fraßversuche mit den Käfern und Isopren-emittierenden und transgenen nicht-Isopren-emittierenden Pappeln durchgeführt. Sowohl in Gewächshaus- als auch in Laborversuchen zeigten weder die Larven noch die Käfer eine Präferenz für Isopren-emittierende oder nicht-emittierende Linien. Unerwarteter Weise wurden eine verstärkte Eiablage und ein höherer Fraßschaden auf Isopren-emittierenden gegenüber nicht-emittierenden Linien unter Freilandbedingungen festgestellt. Metabolomanalysen wiesen auf Veränderungen in den Blättern, welche von der Pappellinie abhängig waren, und auf Effekte auf Terpen-Muster hin. Die Käfer waren in der Lage verschiedene Terpene wahrzunehmen, waren aber nicht in der Lage Isopren wahrzunehmen. Daher könnten kleine Veränderungen der VOC-Emission in den transgenen nicht-Isopren emittierenden Pappellinien durch Unterdrückung der Isopren-Produktion und/oder ausgelöste Veränderungen im Metabolom-Profil die Käfer-Präferenz verändert haben. Obwohl das Hauptziel der Untersuchung - Isopren - keinen Einfluss auf das Käferverhalten hatte, wurde das Käferverhalten auf den Pappeln durch Konsequenzen der Modifikation beeinflusst. Das Ausmaß dieses Effektes war jedoch marginal. iv) Unter natürlichen Bedingungen interagieren Pappeln zeitgleich mit unterirdischen und oberirdischen Organismen. Zur Untersuchung, ob eine Inokulation von Pappeln mit EMF in den Blättern molekulare Veränderungen hervorruft und ob diese Veränderungen das Verhalten von Pappelblattkäfern beeinflussen, hatten C. populi-Käfer die Wahl zwischen Pappeln, welche mit L. bicolor inokuliert waren, und solchen, die nicht inokuliert waren. C. populi präferierten die Nicht-inokulierten sowohl als Nahrung als auch zur Eiablage. RNA-Sequenzierung des Blatttranskriptoms deutete an, dass der Käferbefall eine starke Abwehrreaktion in den Pflanzen auslöste. Auch die EMF-Inokulation beeinflusste das Blatt-Transkriptom, jedoch nur von wenigen Genen. Im Vergleich zu den nicht-inokulierten Pappeln wiesen die inokulierten Pappeln verringerte Transkript-Abundanzen von Genen des Abscisinsäure-Signalweges und der Flavonoid-Biosynthese sowie erhöhte Transkript-Abundanzen der Biosynthesegene von Aldoximen auf, welche kürzlich als Abwehrstoffe identifiziert wurden. Diese Ergebnisse lassen vermuten, dass EMF die Abwehr gegen Herbivore aktivieren und dadurch den natürlichen Schutz von Pappeln verbessern. In jungen Pappeln verursachen EMF jedoch auch ein signifikant geringeres Wachstum. Zusammenfassend zeigen die Ergebnisse dieser Dissertation, dass EMF-VOC-Profile sich von jenen anderer Pilze oder anderer Lebensweisen unterscheiden und dass eine bestimmte chemische Gruppe, die SQTs, als Signalmoleküle in frühen Interaktionen mit Pflanzen fungieren. Zum ersten Mal konnte eine Pilz-VOC, Thujopsen, identifiziert werden, welche für die Stimulierung der Seitenwurzelbildung in Pflanzen verantwortlich ist. Es wurde gezeigt, dass die Haupt-Pappel-VOC Isopren nur eine geringe Rolle in oberirdischen Interaktionen mit dem Herbivoren C. populi spielt. EMF führten zu Transkriptveränderungen in Pappelblättern und einer reduzierten Attraktivität für C. populi Käfer. Die Ergebnisse dieser Dissertation können für biotechnologische Verbesserungen von Pappeln und verstärktem Schutz von Pappeln in Biomasseplantagen verwendet werden.

Les plantes produisent une grande diversité de produits naturels parmi lesquels les isoprénoïdes prédominent. Ces molécules ont des fonctions essentielles pour la croissance et le développement : hormones végétales, régulateurs de croissance comme les brassinostéroïdes, pigments photosynthétiques, tous agissant sur des processus biologiques majeurs. Ainsi, la germination, la floraison, la tolérance aux stress thermiques et hydriques, ou la production de semences, sont contrôlées par l’action d’isoprénoïdes. Le but de mon projet est d’identifier par une sélection génétique les éléments régulateurs de l’homéostasie des isoprénoïdes. Pour cela, j’ai réalisé le criblage de suppresseurs de défaut de croissance dans deux mutants de biosynthèse d’isoprénoïdes chez Arabidopsis thaliana et un mutant de signalisation de brassinostéroïdes chez Hordeum vulgare. J’ai par ailleurs étudié la voie de biosynthèse de stérols spécifique ayant lieu dans un type cellulaire particulier, le tube pollinique en croissance. / Plants produce a great diversity of natural compounds, among which isoprenoids prevail. These molecules have essential functions for growth and development: plant hormones, growth regulators as brassinosteroids, photosynthetic pigments, acting on major biological processes. Thus, germination, flowering, heat and draught stress tolerance, or seed production are controlled by the action of isoprenoids. The aim of my project is to identify by genetic selection the regulators of isoprenoid homeostasis. For this, I carried out genetic screens for suppressors of growth defects in two isoprenoid biosynthesis deficient Arabidopsis thaliana mutants and a brassinosteroid signaling Hordeum vulgare mutant. The second part of my project was focused on the specific sterol biosynthetic pathway occurring in a specialized cell type, the germinating pollen tube.

A malária mata mais de um milhão de pessoas por ano, sendo uma das doenças infecciosas mais relevantes e um grande problema de saúde pública. Além disso, o surgimento de cepas resistentes aos quimioterápicos utilizados faz necessário o estudo de novos alvos para tratamentos contra esta doença. No nosso laboratório foi demonstrada a biossíntese de isoprenóides, em P. falciparum pela via MEP. Sabe-se que substâncias inibidoras da biossíntese de isoprenóides, dentre essas os terpenos, apresentam atividade antimalárica. Levando em consideração o anterior, nós avaliamos o potencial antimalárico do álcool perilico (POH) em P. falciparum e P. berghei. Nossos resultados demonstraram que o POH teve efeito inibitório contra o crescimento do P. falciparum in vitro, nas cepas 3D7 e K1 com uma IC50 de 4,8 ± 0,5 &mu;M, e 10,41±2,33 &mu;M, respectivamente. Além disso, o POH não teve efeito tóxico na linhagem celular Vero. Ainda, Comprovamos que o POH inibiu a farnesilação de proteinas entre 20 e 37 KDa de P. falciparum. Por outro lado, os experimentos in vivo não mostraram eficácia do tratamento do POH contra PbGFP em camundongos Balb/c. Em contraste, foi demostrada a eficácia do POH na de malária cerebral experimental (MCE), , indicando uma redução na taxa de incidência da MCE no grupo tratado com POH, comparado o não tratado ( P<0,05). Além disso, o POH reduziu a inflamação no cérebro dos animais tratados, uma vez que teve uma redução significativa na adesão de leucócitos aos vasos cerebrais (P<0.001), como também, o numero de hemorragias foi menor comparados com os animais não tratados. (P<0.0001). Portanto, os resultados obtidos nesta pesquisa abrem novas alternativas no estudo do mecanismo de ação do POH como um terpeno com grande potencial para tratar MC. / Malaria kills over one million people a year worldwide, and is one of the most important infectious diseases and a major public health problem. Furthermore, the emergence of resistant strains to chemotherapeutic agents used, make it necessary to study new targets for treatments against this disease. In our laboratory we have demonstrated the isoprenoids biosynthesis in P. falciparum, by the MEP pathway. It is known that the substances that inhibit isoprenoid biosynthesis, among these terpenes, have antimalarial activity in vitro and in vivo. Considering this, we evaluate the antimalarial potential of PA (POH) in P. falciparum and P. berghei. Our results showed that the POH had inhibitory effect against the growth of strains 3D7 and K1 of P. falciparum in vitro, with an IC50 of 4.8 &mu;M ± 0.5, and 10.41 ± 2.33 &mu;M, respectively. Furthermore, the POH had no toxic effect on cell line Vero. Moreover, the POH proved that inhibited proteins farnesylation from 20 to 37 kDa of P.falciparum. On the other hand, in vivo experiments did not show efficacy on treatment against POH PbGFP in BALB/c mice. In contrast, the effectiveness of POH in the experimental cerebral malaria (MCE) was demonstrated, indicating a reduction in the incidence rate of MCE in the group treated with POH, compared with of untreated animals (P <0.05). In addition, the POH reduced inflammation in the brain of treated animals, since it had a significant reduction in leukocyte adhesion to cerebral vessels (P <0.001), as also the number of bleeding was lower compared to untreated animals (P<0.0001). Therefore, the results obtained in this work provide new alternatives to study the POH\'s mechanism of action as a terpene with great potential to treat MC.

A malária mata mais de um milhão de pessoas por ano, sendo uma das doenças infecciosas mais relevantes e um grande problema de saúde pública. Além disso, o surgimento de cepas resistentes aos quimioterápicos utilizados faz necessário o estudo de novos alvos para tratamentos contra esta doença. No nosso laboratório foi demonstrada a biossíntese de isoprenóides, em P. falciparum pela via MEP. Sabe-se que substâncias inibidoras da biossíntese de isoprenóides, dentre essas os terpenos, apresentam atividade antimalárica. Levando em consideração o anterior, nós avaliamos o potencial antimalárico do álcool perilico (POH) em P. falciparum e P. berghei. Nossos resultados demonstraram que o POH teve efeito inibitório contra o crescimento do P. falciparum in vitro, nas cepas 3D7 e K1 com uma IC50 de 4,8 ± 0,5 &mu;M, e 10,41±2,33 &mu;M, respectivamente. Além disso, o POH não teve efeito tóxico na linhagem celular Vero. Ainda, Comprovamos que o POH inibiu a farnesilação de proteinas entre 20 e 37 KDa de P. falciparum. Por outro lado, os experimentos in vivo não mostraram eficácia do tratamento do POH contra PbGFP em camundongos Balb/c. Em contraste, foi demostrada a eficácia do POH na de malária cerebral experimental (MCE), , indicando uma redução na taxa de incidência da MCE no grupo tratado com POH, comparado o não tratado ( P<0,05). Além disso, o POH reduziu a inflamação no cérebro dos animais tratados, uma vez que teve uma redução significativa na adesão de leucócitos aos vasos cerebrais (P<0.001), como também, o numero de hemorragias foi menor comparados com os animais não tratados. (P<0.0001). Portanto, os resultados obtidos nesta pesquisa abrem novas alternativas no estudo do mecanismo de ação do POH como um terpeno com grande potencial para tratar MC. / Malaria kills over one million people a year worldwide, and is one of the most important infectious diseases and a major public health problem. Furthermore, the emergence of resistant strains to chemotherapeutic agents used, make it necessary to study new targets for treatments against this disease. In our laboratory we have demonstrated the isoprenoids biosynthesis in P. falciparum, by the MEP pathway. It is known that the substances that inhibit isoprenoid biosynthesis, among these terpenes, have antimalarial activity in vitro and in vivo. Considering this, we evaluate the antimalarial potential of PA (POH) in P. falciparum and P. berghei. Our results showed that the POH had inhibitory effect against the growth of strains 3D7 and K1 of P. falciparum in vitro, with an IC50 of 4.8 &mu;M ± 0.5, and 10.41 ± 2.33 &mu;M, respectively. Furthermore, the POH had no toxic effect on cell line Vero. Moreover, the POH proved that inhibited proteins farnesylation from 20 to 37 kDa of P.falciparum. On the other hand, in vivo experiments did not show efficacy on treatment against POH PbGFP in BALB/c mice. In contrast, the effectiveness of POH in the experimental cerebral malaria (MCE) was demonstrated, indicating a reduction in the incidence rate of MCE in the group treated with POH, compared with of untreated animals (P <0.05). In addition, the POH reduced inflammation in the brain of treated animals, since it had a significant reduction in leukocyte adhesion to cerebral vessels (P <0.001), as also the number of bleeding was lower compared to untreated animals (P<0.0001). Therefore, the results obtained in this work provide new alternatives to study the POH\'s mechanism of action as a terpene with great potential to treat MC.