Abstract Cardiac and skeletal muscle cell contraction is a result of excitation-contraction coupling (ECC), where an electrical signal leads to a rise in intracellular calcium levels and contraction. This process is carefully regulated to meet physiological demand and heavily dependent on an adequate energy supply. Disturbed ECC can have severe consequences on muscle cell function and underlies many cardiac and skeletal muscle pathologies. Cell stress, changing intracellular Ca2+ concentrations, and calcium signal dynamics can all play a role in the transcriptional regulation of genes involved in myocyte Ca2+-handling. In this thesis project, the transcriptional control of ECC was studied in skeletal and cardiac myocytes. Skeletal myocyte calsequestrin (CASQ1) was downregulated in a mouse model of mitochondrial myopathy and it contributed to the decreased SR Ca2+ load and impaired Ca2+ handling in Tfam-/- skeletal myocytes. In cultured neonatal cardiomyocytes, mitochondrial uncoupler FCCP-induced mitochondrial dysfunction led to downregulation of cardiac calsequestrin (CASQ2) and similarly impaired Ca2+ handling. Whereas there was no increase in reactive oxygen species (ROS) levels in Tfam-/- myocytes, cultured cells exposed to FCCP did display increased ROS, an effect that was counteracted by coexposure with the ROS scavenger (NAC). NAC attenuated FCCP-induced CASQ2 downregulation and restored Ca2+ handling. Therefore, mitochondrial dysfunction led to CASQ1/2 downregulation and impaired Ca2+ handling in these two cell types, but by different mechanisms. This project also looked at the role of Ca2+ dynamics on the transcriptional regulation of Ca2+ handling genes. Increased intracellular Ca2+ levels and β-adrenergic stimulation of cardiomyocytes activate Ca2+-calmodulin kinase II (CaMKII) and can trigger hypertrophic remodeling. It was found that CaMKII downregulated expression of the L-type Ca2+ channel α1c-subunit (Cacna1c) in cultured cardiomyocytes. Analysis of the Cacna1c promoter revealed that the transcriptional repressor DREAM bound to a putative downstream regulatory element. The results shed light on the complex interplay between muscle cell energetics and transcriptional regulation of SR Ca2+ handling proteins. A unique pathway for Cacna1c transcriptional regulation by CaMKII and DREAM was also described. / Tiivistelmä Sydän- ja luustolihassolujen supistuminen on seurausta ärsytys-supistuskytkennästä (ECC), jossa sähköinen ärsytys kohottaa solunsisäistä kalsiumpitoisuutta ja aiheuttaa supistuksen. Tätä säädellään tarkasti fysiologisen tarpeen mukaan, ja se riippuu riittävästä energian saannista. Häiriintynyt ECC voi aiheuttaa vakavia seurauksia lihassolujen toiminnalle, ja se on mukana monien sydän- ja luustolihasten sairauksien synnyssä. Tässä tutkimuksessa ECC:n transkriptionaalista säätelyä tutkittiin luustolihasten ja sydämen lihassoluissa. Luustolihassolujen kalsekvestriinin (CASQ1) väheneminen pienensi SR:n Ca2+-määrää mitokondrioiden myopatian hiirimallissa ja heikensi Ca2+-tasapainon ylläpitoa Tfam-/--luustolihassoluissa. Viljellyissä vastasyntyneiden kammio-sydänlihassoluissa mitokondrio-irtikytkijän FCCP:n aiheuttama mitokondrioiden toimintahäiriö johti sydämen kalsekvestriinin (CASQ2) vähenemiseen ja heikensi samalla tavalla Ca2+-tasapainon ylläpitoa. Vaikka Tfam-/--myosyyteissä reaktiivisten happilajien (ROS) tasot eivät olleet koholla, FCCP:lle altistetuissa viljellyissä soluissa ROS kuitenkin lisääntyi. Vaikutusta esti ROS-puhdistaja NAC, joka heikensi FCCP:n aiheuttamaa CASQ2:n laskua ja palautti Ca2+-säätelyn normaaliksi. Mitokondrioiden toimintahäiriö siis johti CASQ1/2:n vähenemiseen ja Ca2+-säätelyn heikentymiseen molemmissa solutyypeissä, mutta eri mekanismeilla. Tässä tutkimuksessa tarkasteltiin myös Ca2+-dynamiikan osuutta Ca2+-tasapainoon osallistuvien geenien transkription säätelyssä. Lisääntynyt solunsisäinen Ca2+-taso ja sydänlihassolujen β-adrenerginen stimulointi aktivoivat Ca2+-kalmoduliinikinaasi II:n (CaMKII), ja ne voivat laukaista sydämen hypertrofisen uudelleenmuovautumisen. Havaittiin, että CaMKII vähensi L-tyypin Ca2+-kanavan a1c-alayksikön (Cacna1c) ilmentymistä viljellyissä sydänlihassoluissa. Promoottorianalyysi osoitti tämän johtuvan transkription repressorin DREAM:n sitoutumisesta oletettuun DRE:hen (alavirrassa sijaitseva säätelyelementti). Nämä tulokset tuovat uutta tietoa lihassolujen energiatalouden ja SR:n Ca2+:n vaikuttavien proteiinien transkription säätelyn vuorovaikutuksesta. Lisäksi havaittiin ainutlaatuinen Cacna1c-transkription säätelyn reitti, johon osallistuvat CaMKII ja DREAM.

Abstract Collagen XV is a proteoglycan localized in the outermost layer of the basement membrane (BM) and in the fibrillar matrix. Although it is widely distributed in many tissues, its amount is generally low. It is characterized by a highly interrupted collagenous domain flanked by large globular domains and attached glycosaminoglycan chains, thus also being identified as a chondroitin sulphate proteoglycan. The C-terminal end of collagen XV, termed restin, has proved to have antiangiogenic effects. In view of its location in the outermost layer of the lamina densa and in association with interstitial collagen fibrils near BMs, it has been suggested that collagen XV may form a bridge between the fibrillar collagen matrix and the BMs. In vivo studies of mice lacking collagen XV have demonstrated that collagen XV is needed as a structural component to stabilize the skeletal muscle cells and capillaries. The role of collagen XV in the extracellular matrix (ECM) was studied using a mouse model lacking the gene of interest (Col15a1-/-). The matrix of peripheral nerves, skeletal muscle, heart and the uterus during pregnancy was analysed at several time points, and peripheral nerve development was evaluated in a mouse model lacking collagen XV and the laminin α4 chain simultaneously as well as in Col15a1-/- mice. The function of collagen XV in the heart was analysed in young, adult and old mice separately. The results indicate that collagen XV is needed for organizing collagen fibrils into proper bundles in the cardiac ECM. In the developing nerve it regulates collagen fibril size and the organization of the fibrils within the collagen bundle. In mature nerves and skeletal muscles it structures the BM–fibrillar matrix interphase, and in the uterus of pregnant mice it participates in fibrillar collagen remodelling, affecting the lateral fusion of collagens into thick fibrils. Even delicate changes in the matrix can lead to an alteration in the functioning of certain organs. Abnormal C-fibrils, polyaxonal myelination and decreased sensory conduction velocity were observed in the Col15a1-/- peripheral nerves, and a simultaneous lack of collagen XV and the laminin α4 chain resulted in more severe and permanent impairment of the segregation and myelination of the nerve axons. A complex cardiac phenotype was observed in the Col15a1-/- mice, predisposing them to cardiomyopathy. / Tiivistelmä Kollageeni XV on proteoglykaani, jonka lokalisaatio on tyvikalvon uloimmassa kerroksessa ja soluväliaineen säikeissä. Vaikka sitä tuotetaan laajalti useissa eri kudoksissa, sitä on määrällisesti vähän kudoksissa. Kollageenin XV ominaisuuksiin kuuluvat useat katkokset kollageenisilla alueilla, globulaariset alueet proteiinin päissä, sekä siihen kiinnittyneet glykosaminoglykaaniketjut, jotka on tunnistettu kondroiittisulfaatiksi. Kollageenin XV C-terminaalisella osalla, jota kutsutaan restiniksi, on osoitettu olevan antiangiogeneettisiä vaikutuksia. Ottaen huomioon kollageeni XV lokalisaation tyvikalvon uloimmassa kerroksessa, ja sen liittymisen säikeisiin kollageeneihin lähellä tyvikalvoa, on ehdotettu että sen tehtävänä olisi toimia yhteys-siltana säikeisten kollageenien ja tyvikalvon välillä. In vivo tutkimuksissa kollageeni XV poistogeenisillä hiirillä on osoitettu, että kollageenia XV tarvitaan rakenteellisena osana stabiloimaan luurankolihasta sekä hiussuonia. Kollageenin XV merkitystä sidekudoksessa tutkittiin käyttäen hiirimallia, jolta puuttuu kyseinen geeni (Col15a1-/-). Ääreishermojen, luurankolihaksen, sydämen ja kohdun soluväliainetta analysoitiin eri-ikäisillä hiirillä. Lisäksi ääreishermojen kehitystä tutkittiin hiirimallilla, jolta puuttuu sekä kollageeni XV että laminiini α4-ketju samanaikaisesti, sekä Col15a1-/- hiirillä. Kollageenin XV tehtävää sydämessä analysoitiin nuorilla, aikuisilla ja ikääntyneillä Col15a1-/- hiirillä. Tulokset viittaavat kollageeni XV merkittävään rooliin soluväliaineen järjestäytymisessä, erityisesti kollageenisäikeiden järjestäytymisessä kimpuiksi sydämen soluvälitilassa. Kehittyvässä hermossa sen tehtävä on säädellä säikeisten kollageenien läpimittaa sekä säikeiden järjestäytymistä säiekimpun sisällä. Täysin kehittyneessä hermossa ja luurankolihaksessa se strukturoi tyvikalvon ja säikeisen soluväliaineen välitilaa, kun taas raskaana olevien hiirien kohdussa se osallistuu säikeisten kollageenien muokkaukseen, vaikuttamalla kollageenien paksuuntumiseen lateraalisen fuusion kautta. Jopa hienoiset muutokset soluväliaineen rakenteessa voivat johtaa muutoksiin elinten toiminnassa. Epämuodostuneita C-säikeitä, polyaksonaalista myelinisaatiota ja hidastunutta sensorista johtonopeutta todettiin Col15a1-/- perifeerisissä hermoissa. Samanaikainen kollageenin XV ja laminiini α4-ketjun puutos johtivat vaikeampaan ja pysyvämpään haittaan hermon aksonien segregaatiossa ja myelinisaatiossa. Col15a1-/- hiirillä todettiin monimuotoinen sydämen ilmiasu, joka altistaa hiiret kardiomyopatialle.

Abstract A non-ischemic etiology of sudden cardiac death (SCD), mostly due to various cardiomyopathies (CMP), accounts for about 20% of all SCDs. Most of the major studies of risk factors for SCD have focused on coronary artery disease (CAD). The aim of the present study was to clarify the characteristics of non-ischemic SCD in Northern Finland. In this study, consecutive victims of SCD (n=2661) were prospectively collected, and among whom post-mortem examinations were performed between 1998 and 2007. Information about the SCD victims was obtained from a combination of available medical records, postmortem examination reports, medication used at the time of SCD, and standardized questionnaire filled out by the closest family members of the victims of SCD. We also screened the candidate genes from a Finnish family in which fatal arrhythmias was first manifestation of a cardiac disease. The collagen content of the myocardium from histological samples in victims of SCD due to idiopathic myocardial fibrosis (IMF) was also evaluated. CAD was the most common cause of death (2082 victims, 78.2%). The prevalence of non-ischemic SCDs was 21.8% of all the SCDs. After sub-grouping the non-ischemic SCDs into various categories, the most common cause of death was CMP related to obesity (23.7%), followed by alcoholic CMP (19.0%), hypertensive CMP (15.5%) and IMF (13.6%). The association of SCD with IMF is notably frequent among victims <40 years old (28.3%). The prevalence of family history of SCD was significantly higher in the victims of ischemic (34.2%) than non-ischemic SCD (13.4%, P<0.001) or controls (17.6%, P<0.001). Lamin A/C gene mutation R541C was found from Finnish SCD family, in which the IMF was predominant pathologic-anatomic finding. Myocardial type I collagen synthesis was increased in victims of SCD due to IMF. In conclusion, the characteristics of non-ischemic SCD in Finland differ from those reported previously. Higher prevalences of CMP-associated SCDs related to obesity, IMF and alcoholic CMP were observed as clinical and/or pathologic bases for non-ischemic SCD. The family history of SCD is not significantly increased in victims of non-ischemic SCD, suggesting a larger role of sporadic occurrence than inherited traits as the cause of non-ischemic SCD. Replacement of cardiac myocytes by fibrosis can be responsible for fatal cardiac arrhythmias in subjects with the lamin A/C gene mutation. The victims of SCD due to IMF have increased myocardial type I collagen synthesis. / Tiivistelmä Ei-iskeeminen sydänperäinen äkkikuolema aiheuttaa noin 20 % kaikista sydänperäisistä äkkikuolemista. Suurin osa ei-iskeemisistä sydänperäisistä äkkikuolemista johtuu erilaisista sydänlihassairauksista, kardiomyopatioista. Useimmat sydänperäisen äkkikuoleman riskitekijöitä kartoittavista tutkimuksista ovat keskittyneet sepelvaltimotautiin. Tämän tutkimuksen tarkoituksena oli selvittää ei-iskeemisen sydänperäisen äkkikuoleman tunnuspiirteitä pohjoissuomalaisessa väestössä. Tutkimuksessa käytettiin potilasaineistona sydänperäiseen äkkikuolemaan menehtyneitä vainajia (n=2661), joille on tehty oikeuslääketieteellinen ruumiinavaus. Tiedot vainajista saatiin saatavilla olevista potilaskertomuksista, ruumiinavauspöytäkirjoista, äkkikuoleman aikaisesta lääkityksestä ja lähiomaisille lähetetystä standardisoidusta kyselylomakkeesta. Kandidaattigeenit tutkittiin pohjoissuomalaisesta perheestä, jossa ensimmäinen oire sydänsairaudesta oli hengenvaarallinen rytmihäiriö. Lisäksi sydänlihaksen kollageenikoostumus analysoitiin histologisista näytteistä potilailta, joiden sydänperäinen äkillinen kuolema johtui idiopaattisesta sydänlihaksen sidekudoskasvusta. Sepelvaltimotauti oli yleisin sydänperäisen äkkikuoleman aiheuttaja (n=2082, 78,2 %). Ei-iskeemisten sydänperäisten äkkikuolemien osuus oli 21,8 % (n=579) kaikista sydänperäisistä äkkikuolemista. Ei-iskeemiset sydänperäiset äkkikuolemat jaettiin alaryhmiin, joista yleisimmät olivat lihavuuteen assosioituva kardiomyopatia (23,7 %), alkoholikardiomyopatia (19,0 %), korkeaan verenpaineeseen assosioituva kardiomyopatia (15,5 %) sekä idiopaattinen sydänlihaksen sidekudoskasvu (13,6 %), joka myös oli yleisin ei-iskeemiseen sydänperäiseen äkkikuolemaan johtava syy alle 40-vuotiailla (28,3 %). Positiivinen sydänperäisen äkkikuoleman sukuhistoria oli tilastollisesti merkitsevästi yleisempää iskeemisillä (34,2 %) kuin ei-iskeemisillä (13,4 %) sydänperäisen äkkikuoleman uhreilla. Lamin A/C – geenin mutaatio löydettiin pohjoissuomalaisesta äkkikuolemaperheestä, jossa idiopaattinen sydänlihaksen sidekudoskasvu todettiin pääasialliseksi patologiseksi löydökseksi. Tyypin I kollageenin synteesi todettiin kohonneeksi idiopaattiseen sydänlihaksen sidekudoskasvuun menehtyneillä vainajilla. Yhteenvetona voidaan todeta, pohjoissuomalaisen väestön ei-iskeemisen sydänperäisen äkkikuoleman tunnuspiirteet eroavat aiemmin raportoiduista; lihavuuteen assosioituva kardiomyopatia, alkoholikardiomyopatia, sekä idiopaattinen sydänlihaksen sidekudoskasvu olivat aiempaa yleisempiä ei-iskeemisen äkkikuoleman aiheuttajia. Positiivinen sydänperäisen äkkikuoleman sukuhistoria ei ollut tilastollisesti merkitsevästi kohonnut ei-iskeemisen sydänperäiseen äkkikuolemaan menehtyneillä. Tämä tarkoittaa, että perinnöllinen syy ei-iskeemisen sydänperäisen äkkikuoleman aiheuttajana on luultua harvinaisempi. Lamin A/C – geenimutaation kantajilla sydänlihassolujen korvautuminen sidekudoksella todettiin hengenvaarallisen rytmihäiriön aiheuttajaksi. Lisäksi, tyypin I kollageenin synteesi todettiin kohonneeksi idiopaattiseen sydänlihaksen sidekudoskasvuun menehtyneillä vainajilla.

Abstract Organogenesis involves precursor cells proliferation, differentiation along with their coordinated organization into precise multicellular arrangements by planar cell polarity (PCP) pathways. The beta-catenin independent/non-canonical type of Wnt-11 signaling has been known as a PCP modulator during development. In this thesis were analyzed the roles of Wnt-11 in heart and kidney development by using in vivo functional genomics technologies. We show that the Wnt-11 gene is important for murine ventricular myocardium development, since Wnt-11 deficiency in early cardiogenesis leads to impaired organization and maturation of mouse ventricular cardiomyocytes, causing primary cardiomyopathy with in utero lethality. Wnt-11 coordinates the co-localized expression of the cell adhesion molecules N-cadherin and β-catenin, which are critical for the spatially specific organization of cardiomyocytes. We show that Wnt-11 deficiency causes primary hypertrophic and noncompaction cardiomyopathy in adult mice, with consequences for regional myocardium function. The Wnt family of secreted signals has been implicated in kidney tubule development and tubular cystic diseases such as polycystic kidney disease. We show here that Wnt-11 is expressed in mature nephrons and is involved in late steps of nephrogenesis, since the kidney tubule organization is deregulated in Wnt-11 deficient kidneys, to enlarged lumen with increased convolution. These tubule abnormalities are associated with glomerular microcyst formation and kidney failure. Wnt-11 deficiency reduced significantly Wnt-9b expression, a critical signal for PCP-mediated kidney tubule elongation. In the cortical region this associated with reduced expression of nephron and stromal progenitor cell marker. The results in this thesis point out that Wnt-11 function is required for proper myocardium organization and maturation as well as proper morphogenesis of the kidney tubules during the embryonic and postnatal developmental stages. Wnt-11 knockout phenotypes depend on the genetic background, similarly to human congenital disease. This data may be relevant for human congenital cardiomyopathy and glomerulocystic kidney disease studies. / Tiivistelmä Alkion sisäelinten kehityksen aikana esisolut lisääntyvät ja erilaistuvat muodostaen tarkoin määriteltyjä monisoluisia rakenteita. Muodostuvan kudosrakenteen määrittelyssä erilaiset solusignaalit ovat keskeisessä asemassa. Yksi näistä on nk. Wnt signaali perhe. Wnt perheeen jäsen Wnt-11 tehtävät on huonosti tunnettu. Wnt-11 viestittää ilmeisesti nk. planaaristen solupolariteettireittien (PCP) avulla, joka on beeta-kateniinista riippumattoman nk. ei-kanonisen Wnt signaali. Väitöskirjatyössä selvitettiin Wnt-11:n vaikutuksia sydämen ja munuaisten kehitykseen in vivo funktionaalisten genomisten menetelmien avulla. Ihmisen synnynnäiset kardiomyopatiat ovat sydänlihaksen ensisijaisia vaurioita, joiden taustalla on sydänlihaksen kehityshäiriö. Tutkimuksessa osoitetaan, että Wnt-11-geenillä on tärkeä merkitys hiiren sydänkammion kehitykselle, koska Wnt-11-geenin puute sydämen varhaisen kehityksen vaiheessa johtaa sydänlihassolujen järjestäytymisen ja kypsymisen häiriintymiseen, jolloin seurauksena on ensisijaisesta kardiomyopatiasta johtuva sikiökuolema. Wnt-11 koordinoi kahden solukiinnitysmolekyylin, N-kadheriinin ja β-kateniinin, samanaikasta ilmentymistä. Kyseiset molekyylit ovat keskeisen tärkeitä sydänlihasssolujen spatiaalisen järjestäytymisen kannalta. Tutkimuksessa osoitetaan, että Wnt-11-puutos aiheuttaa aikuisilla hiirillä ensisijaista sydänlihaksen liikakasvua ja trabekuloivaa kardiomyopatiaa, mikä vaikuttaa sydänlihaksen toimintaan. Tuloksilla voi olla merkitystä tutkittaessa ihmisen synnynnäisiä kardiomyopatioita. Wnt-signaaliperheen on osoitettu olevan yhteydessä munuaisputken kehitykseen ja sen sairauksiin, kuten munuaisten monirakkulatautiin. Väitöstutkimuksessa osoitetaan, että Wnt-11 ilmentyy kypsissä nefroneissa ja että se osallistuu nefrogeneesiin myöhempiin vaiheisiin, koska munuaisputken kehityksen säätely on poikkeavaa niissä munuaisissa, joista Wnt-11 puuttuu. Seurauksena on laajentunut, normaalia poimuttuneempi luumen. Munuaisputken poikkeavuuksilla oli yhteyttä munuaiskerästen mikrokystien muodostumiseen sekä munuaisten vajaatoimintaan. Wnt-11 -puute vähensi huomattavasti Wnt-9b-ilmentymistä, joka on PCP-välitteisen munuaisputken pidentymisen kannalta keskeisen tärkeä signaali. Kortikaalialueella Wnt9b:n vaimennussäätely liittyi poikkeavaan solujen lisääntymiseen, apoptoosiin ja kypsymiseen sekä vähentyneeseen nefroni- ja stroomakantasolujen merkkiaineen ilmentymiseen. Väitöskirjatutkimuksen tulokset viittaavat siihen, että Wnt-11 -toiminto on välttämätön sydänlihaksen normaalin muodostumisen ja kypsymisen sekä munuaisputken normaalin morfogeneesin kannalta sikiövaiheen ja syntymän jälkeisen kehityksen aikana. Wnt-11 -poistogeenisen hiiren fenotyypi riippuu geneettisestä tausta, samaan tapaan kuin ihmisen synnynnäisissä sairauksissa. Väitöstutkimuksesta saatavalla tiedolla voi olla merkitystä tutkittaessa ihmisen synnynnnäistä kardiomyopatiaa ja munuaisten monirakkulatautia.