Berlin, Freie Universität, Thesis (doctoral), 2000.

Die ökologische Rolle der meisten Wildtier-Pathogene in Bezug zur langfristigen Populationsdynamik ihrer Wirte ist nur ansatzweise erforscht und wird deshalb nur unzureichend verstanden. Stattdessen ist die Erforschung von Infektionen mit Pathogenen oft beschränkt auf einzelne Fallstudien oder auf Perioden mit deutlich erhöhten Mortalitätsraten innerhalb der Wirtspopulation. Pathogene mit geringer Virulenz können jedoch durch synergistisches Auftreten verheerende Auswirkungen auf die Fitness ihrer Wirte haben oder sich auf wichtige individuelle lebensgeschichtliche Merkmale, wie zum Beispiel Lebensdauer oder Reproduktionserfolg, auswirken. Des Weiteren sind die Auswirkungen von Krankheitserregern auf die Populationsdynamik der Wildtiere schwer abzuschätzen, zum Beispiel wenn sie die Überlebenschancen von selten zu beobachtenden Jungtieren beeinträchtigen. Bis heute sind Untersuchungen von Infektionen mit Pathogenen und deren Auswirkungen auf Lebensgeschichten meist auf Laborstudien beschränkt, in denen Tiere unter streng definierten Bedingungen gezüchtet und gehalten werden, bzw. auf Studien an kleinen, kurzlebigen Arten wie Nagern, Vögeln und Insekten oder auf Studien an der Humanpopulation. Ziel dieser Arbeit war, die Auswirkungen von Einzel- oder Koinfektionen auf individuelle lebensgeschichtliche Schlüsselparameter sowie die Einflüsse bestimmter lebensgeschichtlicher Merkmale auf den Infektionsstatus anhand einer frei lebenden sozialen Karnivorenart, der Tüpfelhyäne Crocuta crocuta, zu untersuchen. Diese Arbeit war in eine Langzeitstudie integriert und wurde an mehreren Gruppen von Tüpfelhyänen zweier Subpopulationen durchgeführt, die im Serengeti Nationalpark sowie in dem angrenzenden Ngorongoro Krater in Tansania in Ostafrika lebten. Daten über wichtige lebensgeschichtliche Merkmale von mehreren hundert individuell bekannten Tieren in Kombination mit Daten über die wechselhafte Beuteverfügbarkeit in den Territorien der Gruppen standen hierfür zur Verfügung. Ich etablierte molekularbiologische Methoden (Polymerase Kettenreaktionen (PCRs) und Reverse Transkriptions PCRs), um eine Vielzahl an Kot-, Blut- und Gewebeproben individueller Tüpfelhyänen und sympatrisch lebender Karnivoren auf das Vorkommen von Coronaviren, Caliciviren, Hundestaupe-Viren, Parvoviren sowie eines von Zecken übertragenen Blutparasiten, Hepatozoon sp., zu untersuchen. 1 / The ecological role of most wildlife pathogens is poorly understood because pathogens are rarely studied in relation to the long-term population dynamics of wildlife hosts. Instead, pathogen infections are reported on a case basis or studies are focused on periods when pathogens cause noticeable mortality in their hosts. However, pathogens that appear to be of low virulence may also have an important effect if they operate in a synergistic fashion or affect life history parameters such as longevity or reproductive success. Furthermore, the effect of pathogens on population dynamics may be difficult to detect in wildlife, for example if they reduce the survival of young age classes that are rarely observed. Until now, research on the life history consequences of pathogen infection has mainly been confined to laboratory studies where animals are raised and kept under strictly defined conditions, or to small, short lived species such as rodents, birds or insects, as well as to human populations. The aim of this thesis was to address these problems by assessing the impact of single infections and co-infections by pathogens on key life history parameters and the influence of life history traits on infection status in a free-ranging social carnivore species, the spotted hyena Crocuta crocuta. The study was embedded in a long-term study on several clans of spotted hyenas from two subpopulations inhabiting the Serengeti National Park and the adjacent Ngorongoro Crater in Tanzania, East Africa. Data on key life history parameters were available for several hundred individually known animals as was information on changing levels of prey availability. I established molecular biological methods (polymerase chain reactions (PCRs) and reverse transcription PCRs) to screen an extensive set of faecal, blood and tissue samples from individually known spotted hyenas and sympatric carnivores for the presence of coronavirus, calicivirus, canine distemper virus, canine parvovirus and the tick-borne blood parasite Hepatozoon sp. to determine the prevalence of the pathogens. 1

Introduction Hepatitis E is a worldwide distributed disease, which is caused by the hepatitis E virus (HEV). In addition to humans, domestic pigs, wild boars, rabbits and dromedaries can be subclinically infected as reservoir animals with the zoonotic HEV genotypes 3, 4 and 7. In addition, HEV and HEV-like viruses have been described sporadically in other mammals, as well as in birds and fish, although their distinct role as reservoirs or carriers of the virus is still unclear. Aims The aim of the study was therefore to analyse in more detail the importance of different mammalian species, which do not belong to the known HEV reservoirs, for the epidemiology of HEV infections, thus enabling a better assessment of the risk of virus transmission by these animal species. Material and Methods Fourteen non-human primate species and 66 other mammal species, as well as Norway rats (Rattus norvegicus) and feeder rats (Rattus norvegicus forma domestica) from German zoos were selected for the investigations. In total 259 individual non-human primate sera and 244 individual mammalian sera of clinically healthy zoo animals were analysed for the presence of HEV-specific antibodies (ab) using a species-independent double-antigen sandwich ELISA. The non-human primate sera were additionally examined using a commercial human ELISA. Real-time reverse-transcription (RT)-PCR, nested broad-spectrum RT-PCR and a rat HEV-specific RT-PCR were used to detect the HEV genome in sera of mammals and rat liver samples. A commercial and an in-house method were used for the DNA sequencing. Results HEV-specific ab were detected in 3.9% (10/259) of the non-human primate sera (4 species) and 11.5% (28/244) of the mammalian sera (16 species). The highest detection rates were recorded with 33.3% (9/27) in porcines and with 27.0% (10/37) in carnivores. HEV-RNA was detected in a clinically healthy female Syrian brown bear (Ursus arctos syriacus) and in 8 of the investigated Norway rats. Sequence analysis identified the virus as rat HEV; the viruses from the bear and the free-ranging rats from the same zoo showed a high nucleotide sequence identity (94.6%–97.8%). Because of the small number of samples due to the small populations within the individual zoos, further statistical evaluations were not carried out. Conclusions The results show that non-human primates in zoos may be infected with HEV or HEV-like viruses; however, the low ab detection rates together with the negative genome detection argue against a high risk of virus transmission to humans. The study in other zoo-housed mammalian species was able to significantly increase the number of animal species with indications of HEV infections. In most animal species, only rare evidence and low detection rates were available, which can best be explained by “spillover-infections”. In addition to the expected high detection rate in porcine species, the high percentage of HEV antibody-positive carnivores is remarkable. Their role as possible HEV reservoir animals should therefore be clarified in further investigations. The detection of rat HEV in the serum of the bear and its high nucleotide sequence identity with the HEVs of the pest rodents provides first evidence of transmission of this virus species between rodents and carnivores.:List of content List of figures List of tables List of abbreviations 1 General introduction 1.1 Discovery of HEV 1.2 Taxonomy 1.3 Morphology 1.4 Genomic organisation 1.5 Viral replication 1.6 Hepatitis E in humans 1.7 Tools for HEV diagnosis 1.8 Therapy 1.9 Animal infections with HEV and HEV-like viruses 1.10 Experimental infections of animals 1.11 Geographical distribution 1.12 Transmission pathways 1.13 Epidemiology 1.14 Prevention 2 Aims of the study 3 Publications 3.1 Publication I 3.1.1 Summary of Publication I 3.1.2 Key messages of Publication I 3.1.3 Own contribution to Publication I 3.2 Publication II 3.2.1 Summary of Publication II 3.2.2 Key messages of Publication II 3.2.3 Own contribution to Publication II 3.3 Publication III 3.3.1 Summary of Publication III 3.3.2 Key messages of Publication III 3.3.3 Own contribution to Publication III 4 General discussion 4.1 HEV infections in various animal species 4.2 Prevalence of natural HEV infections in non-human primates 4.3 Prevalence of natural HEV infections in other zoo-housed mammals 4.4 Transmission pathways of HEV in a zoo-setting 4.5 Risk of virus transmission from zoo animals to humans 5 Conclusion and perspectives 6 Summary 7 Zusammenfassung 8 References List of animals investigated in the study List of publications Acknowledgements / Einleitung Hepatitis E ist eine durch das Hepatitis E-Virus (HEV) verursachte, weltweit verbreitete Erkrankung. Neben dem Menschen können Hausschwein, Wildschwein, Kaninchen und Dromedar als Reservoirtiere subklinisch mit den zoonotischen HEV-Genotypen 3, 4 und 7 infiziert werden. Darüber hinaus wurden HEV und HEV-ähnliche Viren vereinzelt bei weiteren Säugetieren, sowie Vögeln und Fischen beschrieben, wobei deren genaue Rolle als Reservoir oder Überträger des Virus bislang unklar ist. Ziele Ziel der Arbeit war es deshalb, die Bedeutung verschiedener Säugetierarten, die nicht zu den bekannten HEV-Reservoiren gehören, für die Epidemiologie der HEV-Infektionen besser zu erfassen und dadurch das Risiko einer Virusübertragung durch diese Tierarten besser abzuschätzen. Material und Methoden Vierzehn Affenarten und 66 weitere Säugetierarten, sowie Wanderratten (Rattus norvegicus) und Futterratten (Rattus norvegicus forma domestica) aus deutschen Zoos wurden für die Untersuchungen ausgewählt. Insgesamt wurden 259 individuelle Affenseren und 244 individuelle Säugerseren klinisch gesunder Zootiere mittels eines Spezies-unabhängigen Doppel-Antigen-Sandwich-ELISAs auf das Vorhandensein von HEV-spezifischen Antikörpern (AK) untersucht. Die Affenseren wurden zusätzlich mittels eines kommerziellen humanen ELISAs untersucht. Real-time reverse-transcription (RT)-PCR, nested broad-spectrum RT-PCR sowie eine Ratten-HEV-spezifische RT-PCR wurden für den HEV-Genomnachweis in Seren der Säuger und in Ratten-Lebern verwendet. Für die DNA-Sequenzierungen wurden eine kommerzielle und eine In-house-Methode verwendet. Ergebnisse In 3,9% (10/259) der Affenseren (4 Arten) und 11,5% (28/244) der Säugerseren (16 Arten) wurden HEV-spezifische AK nachgewiesen. Die höchsten Nachweisraten wurden mit 33,3% (9/27) in Schweineartigen und 27,0% (10/37) in Fleischfressern ermittelt. HEV-RNA wurde in einer klinisch gesunden Syrischen Braunbärin (Ursus arctos syriacus), sowie in 8 der untersuchten Wanderratten nachgewiesen. Die Sequenzanalyse identifizierte das Virus als Ratten-HEV; die Viren aus der Bärin und aus den wildlebenden Ratten desselben Zoos zeigten eine hohe Nukleotidsequenz-Identität (94,6%–97,8%). Weitergehende statistische Auswertungen wurden wegen der geringen Probenzahlen aufgrund der kleinen Populationen innerhalb der einzelnen Zoos nicht durchgeführt. Schlussfolgerungen Die Ergebnisse zeigen, dass Affen in Zoos mit HEV oder HEV-ähnlichen Viren infiziert sein können, jedoch sprechen die geringen AK-Nachweisraten zusammen mit den negativen Genomnachweisen gegen ein hohes Übertragungsrisiko auf den Menschen. Die Studie an anderen Säugetierarten in Zoos konnte die Zahl der Tierarten mit Hinweisen auf HEV-Infektionen deutlich erhöhen. Bei den meisten Tierarten lagen nur seltene Nachweise und niedrige Detektionsraten vor, die am besten durch „Spillover-Infektionen“ erklärt werden können. Neben der erwarteten hohen Nachweisrate bei Schweineartigen ist der hohe Prozentsatz an HEV AK-positiven Fleischfressern bemerkenswert, weshalb deren Rolle als mögliche HEV-Reservoirtiere in weiteren Untersuchungen geklärt werden sollte. Der Ratten-HEV-Nachweis im Serum der Bärin, sowie dessen hohe Nukleotidsequenz-Identität zu den HEVs der Schadnager geben erstmals Hinweise auf eine Übertragung dieser Virusart zwischen Nagern und Fleischfressern.:List of content List of figures List of tables List of abbreviations 1 General introduction 1.1 Discovery of HEV 1.2 Taxonomy 1.3 Morphology 1.4 Genomic organisation 1.5 Viral replication 1.6 Hepatitis E in humans 1.7 Tools for HEV diagnosis 1.8 Therapy 1.9 Animal infections with HEV and HEV-like viruses 1.10 Experimental infections of animals 1.11 Geographical distribution 1.12 Transmission pathways 1.13 Epidemiology 1.14 Prevention 2 Aims of the study 3 Publications 3.1 Publication I 3.1.1 Summary of Publication I 3.1.2 Key messages of Publication I 3.1.3 Own contribution to Publication I 3.2 Publication II 3.2.1 Summary of Publication II 3.2.2 Key messages of Publication II 3.2.3 Own contribution to Publication II 3.3 Publication III 3.3.1 Summary of Publication III 3.3.2 Key messages of Publication III 3.3.3 Own contribution to Publication III 4 General discussion 4.1 HEV infections in various animal species 4.2 Prevalence of natural HEV infections in non-human primates 4.3 Prevalence of natural HEV infections in other zoo-housed mammals 4.4 Transmission pathways of HEV in a zoo-setting 4.5 Risk of virus transmission from zoo animals to humans 5 Conclusion and perspectives 6 Summary 7 Zusammenfassung 8 References List of animals investigated in the study List of publications Acknowledgements