In den letzen Jahren gab es durch epidemiologische und molekularbiologische Studien vermehrt Hinweise, dass kutane humane Papillomviren (HPV) ursächlich an der Entstehung nicht-melanozytärer Hauttumore (engl. NMSC) beteiligt sind. Ziel der vorliegenden Arbeit war die Identifizierung molekularer Mechanismen der viralen Proteine E6 und E7 kutaner HPV-Typen. Die E6 oder E7 Gene der verschiedenen HPV-Typen 1, 4, 5, 8, 20, 38 und RTRX7 wurden untersucht. Natürliche Wirtszellen dieser Viren, humane primäre Keratinozyten (HPK) der Haut, wurden mit rekombinanten, für E6 oder E7 kodierenden Retroviren infiziert. Die Analysen erfolgten in Monolayer-Kultur (undifferenzierte Keratinozyten) oder in organotypischen Hautmodellen (Induktion der Keratinozytendifferenzierung). Die Expression von E6 oder E7 führte in Monolayer-HPK zu einer Verlängerung der Lebensspanne und zu einer deutlich erhöhten Verdoppelungsrate. Eine Telomeraseaktivierung, die charakteristisch für immortale Zellen ist, wurde nur in HPV 8 E6 positiven HPK nachgewiesen. In organotypischen Hautmodellen induzierte das E7 Protein von HPV 1, 4 und 38 starke Veränderungen in der Differenzierung sowie eine Zunahme der Proliferation. Weiterhin wurde eine Aufhebung der normalen Zellzykluskontrolle in suprabasalen HPV 5 E7 oder HPV 8 E7 beobachtet. Hinweise auf ein starkes invasives Potential von E7-infizierten HPK wurden für HPV 8 E7 bestätigt und für HPV 4 E7, HPV 38 E7 und RTRX7 E7 erweitert. Molekulare Mechanismen der viralen Gene E6 und E7 kutaner HPV unterscheiden sich von mukosalen Typen. Das Mehrstufenmodell der Karzinogenese beinhaltet eine Reihe fundamentaler Zelltransformationen, die für eine Tumorgenese nötig sind. In dieser Arbeit beschriebene Mechanismen der Modulation der Zelldifferenzierung und Zellproliferation durch die kutanen HPV-Typen 4, 5, 8 und 38 können unter Umständen zur Induktion und Progression früher Stadien von Plattenepithelkarzinomen (SCC) beitragen. / In the last years epidemiologic and molecular biological studies accumulated increasing evidence that cutaneous human papillomaviruses are etiologically involved in the formation of non-melanoma skin cancer (NMSC). The presented work aims to identify the underlying molecular mechanisms of the viral proteins E6 and E7 of cutaneous HPV types. The E6 and E7 genes of the different HPV types 1, 4, 5, 8, 20, and RTRX7, which are in vivo associated with cutaneous benign or malignant lesions, were studied. Natural host cells of these viruses, human primary keratinocyts (HPK) of the skin, were infected with recombinant E6 and E7 encoding retroviruses. The following analyses were performed in monolayer culture (non-differentiated keratinocytes) or in organotypic skin culture (induction of keratinocyte differentiation). The expression of E6 and E7 elongated the life span of monolayer HPK and significantly increased the doubling rate. An activation of the telomerase, characteristic for immortalized cells, was only detected in HPV 8 E6 positive cells. In organotypic skin cultures E7 of HPV 1, 4 and 38 induced drastic changes in differentiation and proliferation. Additionally an impairment of the normal cell cycle control in suprabasale HPV 5 E7 and 8 E7 cultures was seen. Hints for a strong invasive potential of E7 infected HPK were proven for HPV 8 E7 and expanded to HPV 4 E7, HPV 38 E7 and RTRX E7. The viral E6 and E7 genes of cutaneous and mucosal HPV types exhibit different molecular mechanisms. The multistep model of carcinogenesis includes a series of fundamental cell transformations necessary for tumorigenesis. Mechanisms for the modulation of cell differentiation and proliferation by cutaneous HPV types 4, 5, 8 and 38 described in this work could potentially contribute to the induction and progression of early stages of squamous cell carcinoma.

Die Expression von Haupthistokompatibilitätsantigenen auf der Zelloberfläche kernhaltiger Zellen ist die Hauptursache für die Detektion durch das Immunsystem und die Rejektion allogener Transplantate. Eine vielversprechende Strategie, die MHC-I-Expression auf der Zelloberfläche zu senken, ist der Einsatz intrazellulär lokalisierter Antikörpern, sogenannter Intrabodies. In der vorliegenden Arbeit wurde erstmals versucht, eine die Expression an MHC-I-Molekülen auf der Zelloberfläche durch den Einsatz von anti-MHC-I-Intrabodies zu verhindern. Ein Hauptproblem in der Transplantation ist der Mangel an geeignetem Spendermaterial. Um diesem Zustand entgegenzuwirken, wird versucht, adäquaten Organersatz durch Tissue Engineering bereitzustellen. Die in vitro-Züchtung autologer epithelialer Zellen zur Generierung transplantierbarer Hautstücke spielt heute bereits eine große Rolle bei der Transplantation artifizieller Gewebe. Ferner werden diverse vollsynthetische Materialien für diesen Zweck hergestellt. Eine Verbesserung in diesen Bereich würde die Generierung von nicht-immunogenen allogenen Keratinozyten darstellen. Im Rahmen dieser Arbeit wurden primäre Rattenkeratinozyten mit anti-MHC-I-Intrabodies transfiziert. Diese Zellen zeigten einen MHC-I-"knock-out"-Phänotyp - eine starke Expression der Intrabodies war jedoch essentiell für die vollständige Zurückhaltung aller MHC-I-Moleküle in der Zelle. Neben der Applikation von Intrabodies in Rattenkeratinozyten konnte die MHC-I-Expression auf der Zelloberfläche von 293-Zellen und primären humanen Keratinozyten ebenfalls durch die Expression von anti-MHC-I-Intrabodies vermindert werden. Im Vergleich mit dem ebenfalls MHC-I-bindenden adenoviralen Protein p19 bewirkten die eingesetzten anti-MHC-I-Intrabodies bei gleich starker Expression eine wesentlich stärkere "Downregulation" der MHC-I-Oberflächenexpression von 293-Zellen. Intrabody-exprimierende Zellen zeigten keine signifikanten morphologischen oder physiologischen Veränderungen gegenüber untransfizierten Zellen: Wachstum, die Expression anderer Oberflächenmoleküle und morphologische Erscheinung waren unverändert. Es konnte lediglich eine verstärkte intrazelluläre Akkumulation von MHC-I-Molekülen detektiert werden. Die funktionelle Bedeutung der MHC-I-"Downregulation" durch Intrabodies konnte durch die stark verminderte zytolytische Aktivität zytotoxischer T-Zellen gegenüber Intrabody-exprimierender Rattenkeratinozyten im Vergleich zu unmodifizierten Zellen gezeigt werden. In der vorliegenden Arbeit ist es erstmals gelungen, Zellen mit einem vollständigen MHC-I-"knock-out"-Phänotyp zu erzeugen - bisherige Modifikationen der MHC-I-Oberflächenexpression durch die Generierung _2-Mikroglobulin- oder TAP-defizienter Mäuse führte zu keinem restlosen Verlust der Klasse-I-Moleküle auf der Zelloberfläche. MHC-I-"downregulierte" Keratinozyten könnten in der Hauttransplantation anstelle der limitiert zur Verfügung stehenden autologen Zellen eingesetzt werden oder in Kombination mit synthetischen Materialien verwendet werden, wo sie durch die Sekretion von heilungsfördernden Faktoren eine Verbesserung des Wundheilungsprozesses bewirken würden. / The expression of major histocompatibility antigens on the surface of eucaryotic cells is the predominant reason for immunologic detection and the rejection of allogeneic transplants. A promising strategy to lower the MHC I expression on the cell surface is the use of intracellular localized antibodies, termed intrabodies. In this work it has been tried for the first time to prevent the expression of MHC class I molecules on the cell surface by intrabody expression. A major problem in transplantation is the shortage of suitable donor material. To overcome this situation tissue engineering has and will continue to enlarge the scope of organ grafting. Today, the in vitro culture of autologous epithelial cells to generate transplantable skin sheets plays an important role in the transplantation of artificial tissues. Furthermore various fully synthetic materials are produced for transplantation. An improvement in this field could be the generation of non-immunogeneic allogeneic keratinocytes. Within this work primary rat keratinocytes have been transfected with anti-MHC-I-Intrabodies. These cells show a MHC I "knockout" phenotype - yet a strong intrabody expression was essential for the complete retention of all MHC I molecules inside the cell. Besides the application of intrabodies in keratinocytes the MHC I expression on the surface of 293 cells and human primary keratinocytes could be reduced by anti-MHC I intrabodies as well. In comparison with the also employed adenoviral protein p19 the applied intrabodies generated at the same expression level a much stronger down-regulation of the MHC I surface expression of 293 cells. Intrabody expressing cells did not show any significant morphologic or physiologic alterations compared to untransfected cells: growth, the expression of other surface molecules and the morphological appearance were unaltered. Merely an enhanced intracellular accumulation of MHC I molecules could be detected. The functional relevance of the MHC I down-regulation by intrabodies could be shown by the strong diminished cytolytic activity of cytotoxic T cells to intrabody expressing rat keratinocytes in comparison to unmodified cells. In this work cells with a completely MHC I knock-out phenotype has been successfully generated for the first time - modifications of the MHC I surface expression by generation of _2-microglobulin or TAP deficient mice did not lead to a complete loss of all MHC I molecules on the cell surface so far. MHC I down-regulated keratinocytes could be employed in skin transplantation instead of the limited available autologous cells or utilized in combination with synthetic materials where they would induce an improvement of the healing process by the secretion of cytokines.

In etlichen Studien konnte die gesundheitsfördernde Wirkung von probiotischen Bakterien nachgewiesen werden. Heutzutage werden diese zahlreich in der Nahrungsmittel- und Kosmetikindustrie verwendet, um das Immunsystem des Menschen positiv zu beeinflussen. Probiotische Bakterien oder deren Extrakte können zum Beispiel die Produktion von Zytokinen anregen oder herabsetzen und dadurch Entzündungsreaktionen verhindern oder die körpereigene Abwehr steigern. Auch die Produktion des humanen Beta-Defensins-2 (hBD-2) kann durch probiotische Bakterien verändert werden. Dieses wirkt im menschlichen Körper wie ein körpereigenes Antibiotikum und wird von verschiedenen Zellen kontinuierlich gebildet. Gerade in entzündetem Gewebe unterliegt es einer gesteigerten Produktion. Inwieweit sich die hBD-2-Produktion in oralen Keratinozyten der Zelllinie OKF6/hTERT-2 verändert, während diese mit den Extrakten der probiotischen Bakterien Lactobacillus salivarius (L.s.) und Lactobacillus rhamnosus GG (L.GG.) inkubiert wurden, war das Ziel dieser Arbeit. Die Ergebnisse zeigen deutlich eine verringerte hBD-2-Produktion der oralen Keratinozyten nach der Stimulation mit den Bakterienextrakten zu verschiedenen Konzentrationen und Zeiten. Ein günstiger Therapieansatz durch die Gabe von probiotischen Bakterienextrakten bei entzündlichen Erkrankungen der Mundschleimhaut, wäre durch eine gesteigerte hBD-2-Produktion denkbar. Dieses bekämpft nämlich pathogene Erreger und unterstützt somit die Immunabwehr. Mit den Bakterienextrakten von L.s. und L.GG. ließ sich die Produktion von hBD-2 in den oralen Keratinozyten nicht steigern. Einen anti-inflammatorischen Effekt der Extrakte auf die Zellen ist dennoch nicht auszuschließen, da die hBD-2-Konzentration auch indirekt als Indikator einer Entzündung angesehen werden kann und hier mit zunehmender Bakterienextraktkonzentration sinkt. Jedoch sind andere Ursachen für den Konzentrationsabfall ebenso denkbar.