Pemphigus vulgaris (PV) ist eine blasenbildende Autoimmunerkrankung, die durch Autoantikörper gegen Dsg1 und Dsg3 gekennzeichnet ist. Der genaue Pathomechanismus, der zu einem PV-IgG vermittelten Verlust der interzellulären Adhäsion führt, ist noch unklar. Die Dsg3-Depletion und die Modulation von Signalkaskaden stellen hierbei kennzeichnende Merkmale der Erkrankung dar. Mit den Ergebnissen der vorliegenden Arbeit ist eine bessere Einordnung der Dsg3-Depletion in den pathogenetischen Kontext von Pemphigus vulgaris möglich. Die Experimente zeigen, dass die Dsg3-Depletion von Differenzierungsprozessen abhängig ist und mit einem Adhäsionsverlust einhergehen kann. Die Hemmung der PKC verhindert hierbei sowohl die PV-IgG vermittelten Effekte in der Zellkultur als auch die Blasenbildung im Mausmodell in vivo und in humaner Haut ex vivo. Des Weiteren liefert die Arbeit neue Erkenntnisse, welche für die suprabasale Lokalisation der Blasenbildung bedeutsam sein könnten. / Pemphigus vulgaris (PV) is a blistering autoimmune disease characterised by antibodies directed against Dsg1 (desmoglein 1) and Dsg3 (desmoglein 3). The exact pathomechanism leading to PV-IgG induced loss of intercellular adhesion is still unclear. The Dsg3-depletion and the modulation of signaling pathways are characteristics of the disease. With the results of this study, a better classification of Dsg3-depletion in the pathogenetic context of pemphigus vulgaris becomes possible. The experiments show that the Dsg3-depletion is dependent on differentiation processes and can be accompanied by a loss of adhesion. Inhibition of PKC in this case prevents PV-IgG-mediated effects in the cell culture as well as blistering in murine skin in vivo and in human skin ex vivo. Furthermore, this work provides new insights that could be significant for the suprabasal localisation of blistering.

Gestörte Proliferations- und Differenzierungsprozesse in Keratinozyten spielen eine wichtige Rolle in der Pathogenese vieler Hauterkrankungen. Intrazelluläre Signalmechanismen, die die korrekte Balance zwischen epidermaler Proliferation und Differenzierung aufrecht halten, sind bis jetzt größtenteils unbekannt. Einer dieser ausschlaggebenden Transkriptionsfaktoren ist der Nukleäre Faktor-kappaB (NF-kB). Uns interessierte der Einfluss des IKK/IkBa/NF-kB-Signalweges auf das intrinsische Differenzierungsprogramm von Keratinozyten. Mittels retroviraler Infektion wurden sowohl in primären Keratinozyten als auch in HaCaT verschieden mutante Formen von Faktoren des NF-kB-Signalweges eingebracht: dominant negative (dn) Formen der IKK1 und IKK2, eine konstitutiv aktive Form der IKK2 (IKK2 EE) und eine nicht-degradierbare Form des Inhibitors IkBa. Zusätzlich wurden auch pharmakologische Inhibitoren von NF-kB (BAY 11-7082 und SC-514) untersucht. Die Funktionalität der Mutanten wurde im Westernblot durch Analyse der IkBa Degradation überprüft. Anschließend wurde die Differenzierung der Keratinozyten durch Erhöhung des extrazellulären Calciums induziert. Der Grad der Differenzierung wurde durch morphologische Studien und Untersuchung der Expression der Differenzierungs-marker p21 und Involucrin untersucht. Im Gegensatz zu Ergebnissen aus Tiermodellen, konnten wir keine Effekte der mutierten IkB Kinasen 1 und 2 auf die Calcium-induzierte in vitro Differenzierung beobachten. Jedoch wurde die Aktivierung inflammatorischer Gene, gemessen an der Induktion von ICAM-1 und IL-8 nach TNF-a Stimulation, vollständig in den IKK2 KD und mut IkBa exprimierenden Zellen inhibiert. In der Zelllinie, welche die entsprechende IKK1 Mutante trug, wurde deren Expression nur teilweise geblockt. Zusammenfassend lässt sich aus unseren Ergebnissen schließen, dass zumindest in vitro IKK1 und IKK2 nicht an der Regulation des Calcium-induzierten intrinsischen Differen-zierungsprozesses von Keratinozyten beteiligt sind, jedoch eine zentrale Rolle in der inflammatorischen Aktivierung dieser Zellen spielen. / Disturbed proliferation and differentiation processes of keratinocytes play a major role in the pathogenesis of many skin diseases. Intracellular signalling mechanisms which regulate the balance between epidermal proliferation and differentiation, however, are thus far largely unknown. Earlier reports suggest a role for the transcription factor nuclear factor–kappaB (NF-kB) in such processes. Here we attempted to analyze the impact of the IKK/IkBa/NF-kB signalling pathway on the intrinsic differentiation process of keratinocytes. Primary human keratinocytes as well as HaCaT cells were retrovirally infected to express different mutant forms of components of the IKK/NF-kB pathway: dominant negative (dn) mutants of NF-kB upstream kinases IKK1 and IKK2, a constitutive active form of IKK2 (IKK2 EE), and a non degradable mutant form of IkBa. In addition, pharmacological inhibitors of the pathway such as BAY 11-7082 and SC-514 were analysed. Proper functionality of the generated mutants was subsequently confirmed by Western blot analysis monitoring induced IkBa degradation. Thereafter, differentiation of keratinocytes was induced by elevation of extracellular calcium levels. The differentiation state of keratinocytes was then assessed by studying morphology and expression of differentiation markers such as p21 as well as involucrin. In contrast to data reported from animal models, we could not detect any effects of mutated IKK1 or IKK2 on the calcium-induced intrinsic differentiation program in keratinocytes. However, inflammatory activation of keratinocytes as measured by TNF-a-mediated up-regulation of ICAM-1 and IL-8 was almost completely inhibited in cells expressing dn IKK2 and the IkBa mutant form whereas it was only partly blocked in IKK1dn cells. In conclusion, our data suggest that, in least in vitro, IKK1 and IKK2 are not involved in the regulation of calcium-induced keratinocyte differentiation while they are pivotal for inflammatory activation of these cells.

Die subklinische Klauenrehe oder claw horn disruption (CHD) ist von großer wirtschaftlicher Bedeutung für die Rinderhaltung, da sie zu Lahmheiten, Beeinträchtigungen des Allgemeinbefindens sowie einer eingeschränkten Leistungsfähigkeit der Tiere führt. Trotz zahlreicher Untersuchungen sind die pathophysiologischen Grundlagen der CHD noch immer nicht vollständig geklärt. Die derzeitigen Hypothesen weisen auf eine Ischämie in den noch lebensfähigen Epidermisschichten infolge einer veränderten dermalen Mikrozirkulation. Diese hat pathophysiologische Veränderungen zur Folge, die eine Störung der epidermalen Zellproliferation, eine Schädigung der dermo-epidermalen Verbindung sowie eine veränderte Keratinisierung und Hornproduktion umfassen. Von Bedeutung sind daher In-vitro-Ischämiemodelle, um die epidermale Reaktionsmechanismen auf die pathologischen Veränderungen der Dermis zu untersuchen. Ziel in der vorliegenden Arbeit war die Etablierung eines In-vitro-Ischämiemodells auf der Grundlage boviner Keratinozyten aus der Klauenepidermis. Mithilfe dieses Modells sollten die zellulären Pathomechanismen infolge einer Ischämie, einer Hypoxie sowie eines Glukoseentzugs untersucht werden. Des Weiteren stand die Analyse des Differenzierungsverhaltens der Keratinozyten infolge ischämischer, hypoxischer und hypoglykämischer Konditionen im Mittelpunkt. Für die Etablierung des In-vitro-Ischämiemodells diente als Grundlage das oxygen glucose deprivation (OGD)-Modell, das die Untersuchung eines gleichzeitigen Sauerstoff- und Glukosemangels sowie lediglich einer Hypoxie und eines Glukoseentzugs bei bovinen Keratinozyten ermöglichte. Die Versuche wurden in eine Kurzzeitanalyse über 96 Stunden sowie eine Langzeitanalyse über drei Wochen geteilt. Nach erfolgter Exposition wurde die Zellviabilität mittels LDH(Lactatdehydrogenase)- und MTT(3-(4,5-Dimethylhiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazoliumbromid)-Assay untersucht. Des Weiteren wurde das veränderte Differenzierungsverhalten der Keratinozyten infolge der veränderten Kultivierungsbedingungen mittels Western Blot-Analyse anhand der Involukrin- und Lorikrin-Expression untersucht. Die Keratinozyten zeigten infolge einer OGD nach kurzer Expositionsdauer die höchsten zytotoxischen Effekte, die von einer zeitabhängigen Abnahme der Zellviabilität sowie massiven morphologischen Veränderungen gefolgt wurde. Hypoxische Bedingungen bewirkten eine zeitabhängige Abnahme der Zellviabilität, die erst nach zweiwöchiger Inkubation die größte Zytotoxizität aufwies, sowie eine geringgradig veränderte Zellmorphologie bei Erhaltung des Zellverbands. Der Glukoseentzug bewirkte eine stark verminderte Zellviabilität sowie starke morphologische Zellveränderungen. In der Western Blot-Analyse konnte eine gesteigerte Involukrin- und Lorikrin-Expression infolge einer OGD, einer Hypoxie und eines Glukoseentzugs nachgewiesen werden. In der vorliegenden Arbeit konnte erstmalig ein auf bovinen Keratinozyten basierendes In-vitro-Ischämiemodell etabliert werden, das die Untersuchung zellulärer Mechanismen der Epidermis ermöglichte. Die OGD zeigte den stärksten Einfluss auf die Zellviabilität sowie eine veränderte Zelldifferenzierung der Keratinozyten, was die pathophysiologischen Veränderungen im Rahmen der CHD reflektiert. Die ebenfalls starken Zellveränderungen infolge eines Glukoseentzugs verdeutlichen die Rolle der Glukose im Zellmetabolismus der Keratinozyten. Solch ein epidermaler Glukosemangel ist in Verbindung mit der negativen Energiebilanz der Rinder im peripartalen Zeitraum denkbar. Die Ergebnisse infolge einer Hypoxie verweisen auf vielfältige Adaptationsmechanismen der Keratinozyten an hypoxische Bedingungen, denen sie in der Epidermis in vivo während der Zelldifferenzierung ausgesetzt werden. Damit besitzt das In-vitro-Ischämiemodell ein großes Potenzial für den Einsatz in der Klauenreheforschung, um einerseits die mit einer Ischämie einhergehenden pathologischen Veränderungen der CHD untersuchen zu können. Andererseits liefert das Modell wertvolle Informationen zu den physiologischen Grundlagenmechanismen der Epidermis, die mit der Zelldifferenzierung einhergehen. / The subclinical laminitis or claw horn disruption (CHD) is of great economic importance in the dairy industry as it causes lameness, poor general condition and reduced performance. Despite extensive research efforts, the pathomechanism of CHD remains widely unclear. The current hypotheses on CHD pathogenesis include ischemic alterations of the epidermal keratinocytes resulting from an impaired blood supply. This causes an alteration of cell proliferation, a dermo-epidermal separation and an impaired keratinization and horn production. Therefore, in vitro ischemia models are of critical importance in clarification of the epidermal responses to an altered microcirculation. The aim of this study was the establishment of an in vitro ischemia model based on bovine claw keratinocytes. This in vitro model should enable the investigation of cellular pathomechanisms following exposure to ischemia, hypoxia and glucose deprivation. An additional aim was the analysis of the differentiation pattern of keratinocytes under ischemic, hypoxic and hypoglycaemic conditions. To establish the in vitro ischemia model, the keratinocytes were exposed to oxygen-glucose deprivation (OGD). In addition, this model allowed the parallel examination of hypoxic and hypoglycaemic conditions on bovine claw keratinocytes. The experiments were divided into a short-term analysis over 96h and a long-term analysis over three weeks. Measurement of cell viability was performed by LDH(lactatedehydrogenase) and MTT(3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetra- zolium bromide) assays. Furthermore, the differentiation pattern of the keratinocytes after exposure to ischemia, hypoxia and glucose deprivation was detected by western blot analysis of the focus on expression of involucrin and loricrin. The highest cytotoxic effect was measured after short exposure to OGD followed by a time-dependent decrease of cell viability and extensive morphological changes of the keratinocytes. Hypoxic conditions lead to a time-dependent decrease of cell viability with the highest cytotoxicity after two weeks. The keratinocytes showed slight changes in cell morphology while maintaining a confluent cell layer. Exposure of keratinocytes to glucose deprivation showed a high decrease of cell viability and strong morphological changes. Furthermore, western blot analysis showed an altered expression pattern with increased involucrin and loricrin levels after exposure to OGD, hypoxia and glucose deprivation. The present study established for the first time an in vitro ischemia model based on bovine claw keratinocytes to study the cellular mechanisms of the epidermis. After exposure to OGD, keratinocytes showed the highest loss in cell viability and an altered cell differentiation. This reflects the pathophysiological changes following epidermal ischemia occurring during the pathogenesis of CHD. The massive cellular alterations after glucose deprivation provide good evidence for the importance of glucose in the cellular metabolism of keratinocytes. An epidermal glucose deficiency may occur in combination with a negative energy balance during peripartal period in cattle. The results of hypoxia show the different adaptive mechanisms of keratinocytes to hypoxic conditions which are present in the epidermis during cell differentiation. Thus, the in vitro ischemia model has a great potential for use in research into CHD pathogenesis and pathomechanisms associated with ischemia. On one side, it is possible to investigate the pathological changes following ischemia during CHD. On the other side, the model offers useful information on physiological response mechanisms of the epidermis that correlate with cell differentiation.

Die subklinische Klauenrehe oder claw horn disruption (CHD) ist von großer wirtschaftlicher Bedeutung für die Rinderhaltung, da sie zu Lahmheiten, Beeinträchtigungen des Allgemeinbefindens sowie einer eingeschränkten Leistungsfähigkeit der Tiere führt. Trotz zahlreicher Untersuchungen sind die pathophysiologischen Grundlagen der CHD noch immer nicht vollständig geklärt. Die derzeitigen Hypothesen weisen auf eine Ischämie in den noch lebensfähigen Epidermisschichten infolge einer veränderten dermalen Mikrozirkulation. Diese hat pathophysiologische Veränderungen zur Folge, die eine Störung der epidermalen Zellproliferation, eine Schädigung der dermo-epidermalen Verbindung sowie eine veränderte Keratinisierung und Hornproduktion umfassen. Von Bedeutung sind daher In-vitro-Ischämiemodelle, um die epidermale Reaktionsmechanismen auf die pathologischen Veränderungen der Dermis zu untersuchen. Ziel in der vorliegenden Arbeit war die Etablierung eines In-vitro-Ischämiemodells auf der Grundlage boviner Keratinozyten aus der Klauenepidermis. Mithilfe dieses Modells sollten die zellulären Pathomechanismen infolge einer Ischämie, einer Hypoxie sowie eines Glukoseentzugs untersucht werden. Des Weiteren stand die Analyse des Differenzierungsverhaltens der Keratinozyten infolge ischämischer, hypoxischer und hypoglykämischer Konditionen im Mittelpunkt. Für die Etablierung des In-vitro-Ischämiemodells diente als Grundlage das oxygen glucose deprivation (OGD)-Modell, das die Untersuchung eines gleichzeitigen Sauerstoff- und Glukosemangels sowie lediglich einer Hypoxie und eines Glukoseentzugs bei bovinen Keratinozyten ermöglichte. Die Versuche wurden in eine Kurzzeitanalyse über 96 Stunden sowie eine Langzeitanalyse über drei Wochen geteilt. Nach erfolgter Exposition wurde die Zellviabilität mittels LDH(Lactatdehydrogenase)- und MTT(3-(4,5-Dimethylhiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazoliumbromid)-Assay untersucht. Des Weiteren wurde das veränderte Differenzierungsverhalten der Keratinozyten infolge der veränderten Kultivierungsbedingungen mittels Western Blot-Analyse anhand der Involukrin- und Lorikrin-Expression untersucht. Die Keratinozyten zeigten infolge einer OGD nach kurzer Expositionsdauer die höchsten zytotoxischen Effekte, die von einer zeitabhängigen Abnahme der Zellviabilität sowie massiven morphologischen Veränderungen gefolgt wurde. Hypoxische Bedingungen bewirkten eine zeitabhängige Abnahme der Zellviabilität, die erst nach zweiwöchiger Inkubation die größte Zytotoxizität aufwies, sowie eine geringgradig veränderte Zellmorphologie bei Erhaltung des Zellverbands. Der Glukoseentzug bewirkte eine stark verminderte Zellviabilität sowie starke morphologische Zellveränderungen. In der Western Blot-Analyse konnte eine gesteigerte Involukrin- und Lorikrin-Expression infolge einer OGD, einer Hypoxie und eines Glukoseentzugs nachgewiesen werden. In der vorliegenden Arbeit konnte erstmalig ein auf bovinen Keratinozyten basierendes In-vitro-Ischämiemodell etabliert werden, das die Untersuchung zellulärer Mechanismen der Epidermis ermöglichte. Die OGD zeigte den stärksten Einfluss auf die Zellviabilität sowie eine veränderte Zelldifferenzierung der Keratinozyten, was die pathophysiologischen Veränderungen im Rahmen der CHD reflektiert. Die ebenfalls starken Zellveränderungen infolge eines Glukoseentzugs verdeutlichen die Rolle der Glukose im Zellmetabolismus der Keratinozyten. Solch ein epidermaler Glukosemangel ist in Verbindung mit der negativen Energiebilanz der Rinder im peripartalen Zeitraum denkbar. Die Ergebnisse infolge einer Hypoxie verweisen auf vielfältige Adaptationsmechanismen der Keratinozyten an hypoxische Bedingungen, denen sie in der Epidermis in vivo während der Zelldifferenzierung ausgesetzt werden. Damit besitzt das In-vitro-Ischämiemodell ein großes Potenzial für den Einsatz in der Klauenreheforschung, um einerseits die mit einer Ischämie einhergehenden pathologischen Veränderungen der CHD untersuchen zu können. Andererseits liefert das Modell wertvolle Informationen zu den physiologischen Grundlagenmechanismen der Epidermis, die mit der Zelldifferenzierung einhergehen. / The subclinical laminitis or claw horn disruption (CHD) is of great economic importance in the dairy industry as it causes lameness, poor general condition and reduced performance. Despite extensive research efforts, the pathomechanism of CHD remains widely unclear. The current hypotheses on CHD pathogenesis include ischemic alterations of the epidermal keratinocytes resulting from an impaired blood supply. This causes an alteration of cell proliferation, a dermo-epidermal separation and an impaired keratinization and horn production. Therefore, in vitro ischemia models are of critical importance in clarification of the epidermal responses to an altered microcirculation. The aim of this study was the establishment of an in vitro ischemia model based on bovine claw keratinocytes. This in vitro model should enable the investigation of cellular pathomechanisms following exposure to ischemia, hypoxia and glucose deprivation. An additional aim was the analysis of the differentiation pattern of keratinocytes under ischemic, hypoxic and hypoglycaemic conditions. To establish the in vitro ischemia model, the keratinocytes were exposed to oxygen-glucose deprivation (OGD). In addition, this model allowed the parallel examination of hypoxic and hypoglycaemic conditions on bovine claw keratinocytes. The experiments were divided into a short-term analysis over 96h and a long-term analysis over three weeks. Measurement of cell viability was performed by LDH(lactatedehydrogenase) and MTT(3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetra- zolium bromide) assays. Furthermore, the differentiation pattern of the keratinocytes after exposure to ischemia, hypoxia and glucose deprivation was detected by western blot analysis of the focus on expression of involucrin and loricrin. The highest cytotoxic effect was measured after short exposure to OGD followed by a time-dependent decrease of cell viability and extensive morphological changes of the keratinocytes. Hypoxic conditions lead to a time-dependent decrease of cell viability with the highest cytotoxicity after two weeks. The keratinocytes showed slight changes in cell morphology while maintaining a confluent cell layer. Exposure of keratinocytes to glucose deprivation showed a high decrease of cell viability and strong morphological changes. Furthermore, western blot analysis showed an altered expression pattern with increased involucrin and loricrin levels after exposure to OGD, hypoxia and glucose deprivation. The present study established for the first time an in vitro ischemia model based on bovine claw keratinocytes to study the cellular mechanisms of the epidermis. After exposure to OGD, keratinocytes showed the highest loss in cell viability and an altered cell differentiation. This reflects the pathophysiological changes following epidermal ischemia occurring during the pathogenesis of CHD. The massive cellular alterations after glucose deprivation provide good evidence for the importance of glucose in the cellular metabolism of keratinocytes. An epidermal glucose deficiency may occur in combination with a negative energy balance during peripartal period in cattle. The results of hypoxia show the different adaptive mechanisms of keratinocytes to hypoxic conditions which are present in the epidermis during cell differentiation. Thus, the in vitro ischemia model has a great potential for use in research into CHD pathogenesis and pathomechanisms associated with ischemia. On one side, it is possible to investigate the pathological changes following ischemia during CHD. On the other side, the model offers useful information on physiological response mechanisms of the epidermis that correlate with cell differentiation.

Chemische und physikalische Eigenschaften von Polymeren können verschiedene Zelltypen unterschiedlich, z. B. hinsichtlich Adhärenz oder Funktionalität, beeinflussen. Die Elastizität eines Polymers beeinflusst vor allem, welche Zugkräfte eine Zelle gegenüber ihrem Substrat entwickeln kann. Das Zellverhalten wird dann über intrazelluläre Rückkopplungsmechanismen reguliert. Die Oberflächenladung und/oder Hydrophilie eines Polymers beeinflusst zunächst die Adsorption von Ionen, Proteinen und anderen Molekülen. Vor allem über die Zusammensetzung, Dichte und Konformation der adsorbierten Komponenten werden anschließend die Wechselwirkungen mit den Zellen vermittelt. Des Weiteren können verschiedene Zelltypen unterschiedliche membranassoziierte Proteine, Zucker und Lipide aufweisen, so dass Polymereigenschaften zellspezifische Effekte bewirken können. Für biotechnologische Anwendungen und für den Einsatz in der regenerativen Medizin gewinnen Polymere, die spezifische Zellreaktionen regulieren können, immer weiter an Bedeutung. Die Isolierung und Kultur von primären Keratinozyten ist noch immer anspruchsvoll und die adäquate Heilung von Hautwunden stellt eine fortwährende medizinische Herausforderung dar. Ein Polymer, das eine bevorzugte Adhärenz von Keratinozyten bei gleichzeitig verminderter Anheftung dermaler Fibroblasten ermöglicht, würde erhebliche Vorteile für den Einsatz in der Keratinozyten-Zellkultur und als Wundauflage bieten. Um den potentiell spezifischen Einfluss bestimmter Polymereigenschaften auf primäre humane Keratinozyten und dermale Fibroblasten zu untersuchen, wurde in der vorliegenden Arbeit ein Zellkultursystem für die Mono- und Cokultur beider Zelltypen entwickelt. Das Testsystem wurde als Screening konzipiert, um den Einfluss unterschiedlicher Polymereigenschaften in mehreren Abstufungen auf die Zellen zu untersuchen. Folgende Parameter wurden untersucht: 1. Vitalität und Dichte adhärenter und nicht-adhärierter Zellen, 2. Schädigung der Zellmembran, 3. selektive Adhärenz von Keratinozyten in Cokultur durch die spezifische immunzytochemische Färbung von Keratin14 und Vimentin. Für die Polymere mit variabler Elastizität wurden zusätzlich die Ablagerung extrazellulärer Matrixkomponenten und die Sekretion löslicher Faktoren durch die Zellen untersucht. Als Modellpolymere für die Variation der Elastizität wurden vernetzte Poly(n-butylacrylate) (cPnBA) verwendet, da deren Elastizität durch den Anteil des Vernetzers eingestellt werden kann. Auf dem weniger elastischen cPnBA zeigte sich in der Cokultur ein doppelt so hohes Verhältnis von Keratinozyten zu Fibroblasten wie auf dem elastischeren cPnBA, so dass ein leichter zellselektiver Effekt angenommen werden kann. Acrylnitril-basierte Copolymere wurden als Modellpolymere für die Variation der Oberflächenladung und Hydrophilie verwendet, da die Eigenschaften durch Art und molaren Anteil des Comonomers eingestellt werden können. Durch Variation des molaren Anteils der Comonomere mit positiver bzw. negativer Ladung, Methacrylsäure-2-aminoethylester-hydrochhlorid (AEMA) und N-3-Aminopropyl-methacrylamid-hydro-chlorid (APMA) bzw. Natriumsalz der 2-Methyl-2-propen-1-sulfonsäure (NaMAS), wurde der Anteil der positiven bzw. negativen Ladung im Copolymer variiert. Durch die Erhöhung des molaren Anteils des hydrophilen Comonomers N-Vinylpyrrolidon (NVP) wurde die Hydrophilie des Copolymers gesteigert. Die Erhöhung des molaren Anteils an positiv geladenem Comonomer AEMA im Copolymer führte tendenziell zu einer höheren Keratinozytendichte, wobei die Fibroblastendichte unverändert blieb. Durch die Erhöhung des molaren Anteils des positiv geladenen Comonomers APMA ergaben sich keine deutlichen Unterschiede in Dichte, Vitalität oder Selektivität der Zellen. Durch die stufenweise Erhöhung des molaren Anteils des negativ geladenen Comonomers NaMAS konnte, wie im Falle von AEMA, eine Tendenz zur verbesserten Keratinozytenadhärenz beobachtet werden. Die Steigerung der Hydrophilie der Copolymere führte sowohl für Keratinozyten als auch für Fibroblasten zu einer reduzierten Adhärenz und Vitalität. In der vorliegenden Doktorarbeit wurde ein Testverfahren etabliert, das die Untersuchung von primären humanen Keratinozyten und primären humanen Fibroblasten in Monokultur und Cokultur auf verschiedenen Polymeren ermöglicht. Die bisherigen Ergebnisse zeigen, dass sich durch die gezielte Modifizierung verschiedener Polymereigenschaften die Adhärenz und Vitalität beider Zelltypen beeinflussen lässt. Die Reduktion der Elastizität sowie die Erhöhung des molaren Anteils geladener Comonomere führten zu einer Zunahme der Keratinozytenadhärenz. Da die Fibroblasten unbeeinflusst blieben, zeigte sich für einige der untersuchten Polymere eine leichte Zellselektivität. Diese könnte durch die weitere Erhöhung der Steifigkeit oder des Anteils geladener Comonomere möglicherweise weiter gesteigert werden. / Chemical and physical properties of polymers can influence various cell types, e.g. concerning adherence and functionality. For instance, the elasticity of a polymer can influence, which pulling force a cell can generate towards a substrate. According to the cell type, its behavior can be controlled by intracellular feedback mechanisms. The surface charge and/or hydrophilicity of a polymer initially influence the adsorption of ions, proteins and other molecules. In particular, the composition, density, and conformation of the adsorbed components mediate the cell-material interactions. Since different cell types present varying cell membrane associated proteins, sugars and lipids, it is assumed that polymer properties can induce cell specific effects. Polymers, which can regulate specific cell reactions, become more and more important for biotechnological uses and applications in the regenerative medicine. The isolation and culture of primary keratinocytes is still challenging and an adequate wound healing remains a clinical task. A polymer, which enables a preferential adherence of keratinocytes and induces a reduced adherence of dermal fibroblasts, would provide enormous advantages for keratinocyte culture systems as well as for wound dressings. To investigate the specific influence of certain polymer properties on primary human keratinocytes and fibroblasts, a cell culture system for mono- and coculture of both cell types was established. The test system was designed as a screening to investigate the influence of polymers with gradations of different properties on the cells. Thereby, the viability and density of adherent and not adhered cells, as well as the impairment of the cell membranes were analyzed in mono- and cocultures, and the selective adherence of keratinocytes in the coculture was evaluated using a specific immunocytochemical staining for keratin14 and vimentin. Furthermore, the deposition of extracellular matrix components and the secretion of soluble factors were analyzed for the elastic polymers. Since the elasticity of crosslinked poly(n-butylacrylate) (cPnBA) networks can be adjusted by the amount of the crosslinker, they were used as model polymers to investigate the influence of varying elasticity to the cells. On the less elastic cPnBA, the ratio of keratinocytes to fibroblasts was increased compared to the more elastic one. From these results, a slight cell selective effect can be assumed. Acrylonitrile-based copolymers were used as model polymers for the variation of surface charge and hydrophilicity, since their properties can be modified by the type and molar ratio of comonomers. By the variation of the molar ratio of positively charged comonomers (Methacrylic acid-2-aminoethylester hydrochloride (AEMA) and N-3-aminopropyl methacrylamide hydrochloride (APMA)), or a negatively charged comonomer (2-methyl-2-propene-1-sulfonic acid sodium salt (NaMAS)), the amount of positive or negative charges was modified. The hydrophilicity was increased by the molar ratio of the hydrophilic comonomer N-vinylpyrrolidone (NVP). With an increased molar ratio of the positively charged comonomer AEMA, a tendency towards a higher density of adherent keratinocytes could be shown, whereby, the density of adherent fibroblasts remained unaffected. With increasing molar ratios of the positively charged comonomer APMA, no differences between cell densities, viability or selectivity were detectable. Comparable to AEMA, a tendency towards improved keratinocyte adhesion could be shown with an increasing molar ratio of the negatively charged comonomer NaMAS. The increase of the hydrophilicity of the copolymers led to a reduced adherence and viability of the keratinocytes, as well as of the fibroblasts. In conclusion, a test system was established, which enables the evaluation of primary human keratinocytes and fibroblasts in contact with different polymers in monoculture, as well as in coculture. Furthermore, the present thesis shows that directed modifications of polymer properties influenced the adherence and viability of both cell types. The decrease of elasticity and the increase of the molar ratio of charged comonomers led to an increased keratinocyte adherence. Since the fibroblasts remained unaffected, slight cell selectivity was shown. By further increasing the stiffness or the amount of charged comonomers, further enhancement of this effect might be possible.

Der humane Stammzellfaktor (SCF) ist ein zentraler Wachstumsfaktor für Mastzellen in der Dermis und für Melanozyten in den Basalzellschichten der Epidermis. Er wird u. a. von Keratinozyten produziert. In dieser Arbeit wurde die mögliche Regulation der Expression von SCF aus Keratinozyten durch All-Trans-Retinsäure (RA) und Dexamethason in vitro an Hand der HaCaT-Zelllinie untersucht. Die HaCaT-Zellen wurden mit den beiden o. g. Substanzen (10 hoch -5 M bis 10 hoch -9 M) über 24 Stunden und 11 Tage inkubiert. Die Auswertung der HaCaT-Zellzahl, des Gesamt-Proteins SCF, dessen Splicevarianten (mSCF, sSCF) und der Rezeptoren von RA (RAR-alpha, -beta, -gamma) und von Dexamethason (GR-alpha, -beta) erfolgte mittels ELISA und RT-PCR. Dabei ergaben sich folgende Resultate: RA bewirkt einen Anstieg von SCF, Dexamethason bewirkt bei Kurzinkubation eine deutliche Zunahme von SCF, bei Dauerinkubation einen starken Abfall. Die RA-Rezeptoren RA-alpha und -gamma waren nach Inkubation mit RA verstärkt nachzuweisen; die Glukokortikoid-Rezeptoren GR-alpha und -beta zeigten nach Inkubation mit Dexamethason ebenfalls eine vermehrte Expression. Die Expression des Mastzellwachstumsfaktors SCF könnte deshalb unter physiologischen, pathologischen und therapeutischen Bedingungen durch Retinoide und Glukokortikoide reguliert sein. / The human stem cell factor (SCF) is a crucial growth factor for mast cells in the dermis and for the melanocytes in the basal layers of the epidermis. SCF is produced, among others, by keratinocytes. This study examines the possible regulation of the expression of SCF from keratinocytes by all-trans retinoic acid (RA) and dexamethasone in vitro by the keratinocyte cell line HaCaT. The HaCaT-cells were incubated for 24 hours or 11 days, respectively, with one of the above mentioned substances (10 to the power of -5 M to 10 to the power of -9 M). The analysis of the number of HaCaT-cells, of the total SCF protein, its splice variants (mSCF, sSCF), the receptors of RA (RAR-alpha, -beta, -gamma), and of the dexamethasone (GR-alpha, -beta) was done by ELISA and RT-PCR. The following results were found: RA induces an increase of SCF, dexamethasone at a short incubation period a considerable increase of SCF, and at long-term incubation a strong decrease. The RA-receptors RA-alpha und -gamma expression is increased after incubation with RA, and the glucocorticoid-receptors GR-alpha and -beta after the incubation with dexamethasone. Therefore, it is probable that the increase of the mast cell growth factor SCF under physiological, pathological and therapeutic conditions could be regulated by retinoic acid and glucocorticoids.

Met und der korrespondierende Ligand HGF/SF sind im hyperproliferativen Epithelium von Hautwunden exprimiert. Aus diesem Grund ist es wahrscheinlich, dass der Rezeptor und sein Ligand in autokriner Weise wechselwirken und wichtige Funktionen für den Heilungsprozess der Haut besitzen. Unter Verwendung der Keratin 14 Cre-Rekombinase konnte ein „Knockout“ des Met-Rezeptors spezifisch in der Epidermis erzielt werden. In der Tat zeigten die Ergebnisse, dass Met für die Re-epithelisierung in Wundschlussprozessen essentiell ist, da in den an der Wundheilung beteiligten Keratinozyten keine Rekombination des Met-Gens stattgefunden hat. In Met-Mausmutanten war der Wundschlussprozess verlangsamt, denn er erfolgte ausschließlich durch wenige Keratinozyten, in denen die Cre-Rekombinase keine Rekombination bewirkte. Met konnte als erstes Gen identifiziert werden, das absolut erforderlich für Re epithelisierungsprozesse von Wunden ist. Diese Arbeit trägt daher wesentlich zum Verständnis der Regulation von Wundheilungsprozessen bei. / Met and its ligand, HGF/SF are expressed in the hyperproliferative epithelium of the wound. This suggests that receptor and ligand may act in an autocrine manner to promote wound healing in the skin. Using Keratin 14 cre recombinase, Met receptor was specifically knockout in the epidermis. In this way, it was demonstrated that Met receptor is essential for wound healing process and that keratinocytes, which contributed to the wound closure were Met-postitive. In the Met mutant mice, wound closure was slightly attenuated, but occurred exclusively by a few keratinocytes that had escaped recombination. Met is therefore the fist gene, which is absolutely required for re-epithelialization of the wound. This finding is fundamental for understanding the regulation of wound healing process.

Bovine Dermatitis digitalis (DD) ist eine weltweit verbreitete Infektionskrankheit bei Rindern, die primär die plantare Haut über dem Kronenrand nahe des Zwischenzehenspalts der Hinterklauen betrifft. Schmerzhafte ulzero-proliferative Läsionen mit akuten und chronischen Erscheinungsformen führen zu Verhaltensänderungen und Lahmheit der Tiere. DD hat damit einen erheblichen Einfluss auf deren Wohl und ihre Leistungen. Zahlreiche Untersuchungen zur Ätiologie der Krankheit ergaben, dass es sich um das Zusammenspiel verschiedener Ursachen handelt. Einer synergistischen multifaktoriellen Infektion mit starker Beteiligung von Bakterien der Gattung Treponema kommt dabei besondere Bedeutung zu. Aspekte wie Tierhaltung, Hygienestandards und genetische Prädispositionen wurden ebenfalls intensiv untersucht. Nichtsdestotrotz bleiben Infektionsherde, Transmissionsrouten und Pathomechanismen weitgehend unklar. Zum besseren Verständnis der Ereignisse, die zu DD-Läsionen führen, sollte im Zuge dieser Arbeit ein organotypisches Zellkulturmodell der bovinen Haut erstellt werden, welches in späteren Versuchen mit dem Krankheitserreger zum Einsatz kommen soll. Verlässliche und reproduzierbare Techniken zur Isolation und Kultur von bovinen primären Keratinozyten und Fibroblasten wurden etabliert; geeignete Zellkulturmedien für die Langzeitkultivierung und –aufbewahrung der Hautzellen wurden identifiziert. Zur Erstellung des Hautmodells wurden zwei verschiedene Ansätze miteinander verglichen. Der zweite Ansatz, bei dem Keratinozyten direkt auf ein dermales Äquivalent, d.h. ein Pad aus bovinem Kollagen I mit eingesäten post-mitotischen Fibroblasten, gesät wurden, brachte ein vielversprechendes Hautmodell hervor. Die inkorporierten post-mitotischen Fibroblasten wiesen eine charakteristische Zellmorphologie mit intakten Nuklei auf. Die terminale Differenzierung der Keratinozyten auf dem dermalen Äquivalent wurde mittels Immunfluoreszenzfärbungen mit Antikörpern gegen die Markerproteine Keratin 14 und Desmoglein 1 gezeigt. Die Ergebnisse erster Experimente mit Treponema spp. verdeutlichen, dass das Hautäquivalent ein geeignetes Modell zur Untersuchung der Pathogenese der DD darstellt. / Bovine digital dermatitis (DD) is a worldwide occurring, infectious disease in cattle primarily affecting the plantar skin above the coronary band near the interdigital cleft on hind feet. Painful ulceroproliferative lesions with acute and chronic appearances lead to behavioral changes and lameness. Hence, DD has a major impact on animal welfare and performance. Substantial efforts in investigating the etiology of the disease revealed a synergistic origin with evidence for a multibacterial infection and the strong involvement of bacteria from the genus Treponema. As the interaction between host, pathogen and environment is not negligible, surrounding circumstances such as housing, general hygiene and genetic predispositions have been investigated intensively. Nevertheless, infection reservoirs, transmission routes and pathomechanisms remain widely unclear. To better understand the cellular and molecular events during Treponema-infection of bovine skin, it was the specific aim of this study to establish an organotypic in vitro skin model, which could be challenged with the causative agent of the disease. A technique to reliably and reproducibly isolate primary keratinocytes and fibroblasts from the site of infection was established. Appropriate cell culture media for the long-term cultivation and storage of bovine skin cells were identified. Two different methods to develop the skin model were compared. The second strategy in which keratinocytes were directly seeded on top of a dermal equivalent, i.e. a bovine collagen type I pad with embedded post-mitotic fibroblasts, gave rise to a promising organotypic skin equivalent. The incorporated post-mitotic fibroblasts showed a characteristic cell morphology with intact nuclei. The terminal differentiation of the keratinocytes on top of the dermal equivalent was shown with anti-K14 and anti-Dsg1 immunofluorescence stainings. The results of initial Treponema-experiments proved that the skin equivalent is a suitable model to investigate the underlying mechanisms during Treponema-infection of bovine skin and hence, the pathogenesis of DD.

Topische Glukokortikoide (GCs) sind wirksam bei Therapie von entzündlichen Hauterkrankungen. Durch ihr Nebenwirkungspotential (z.B. Induktion von Hautatrophie) ist ihr Einsatz jedoch begrenzt. Für die Medikamentenentwicklung ist die Bestimmung des atrophogenen Potenzials neuer Verbindungen daher von großer Bedeutung. Derzeit stehen dafür keine prädiktiven in vitro Modelle zur Verfügung. Ziel dieser Arbeit war daher die Etablierung solcher Modelle. Es wurden kutane Zelltypen (3T3-Zellen, Rattenfibroblasten, HaCaT-Zellen, humane Keratinozyten [NHEK] und Fibroblasten) und Vollhautmodelle (CellSystems AST-2000 und Phenions FTSM) untersucht. Atrophie-Marker, die Proliferation, Kollagen-Metabolismus und Epidermisdicke betreffend, wurden auf mRNA-, Protein- bzw. zellulärer Ebene gemessen. Außerdem wurden mittels Genexpressionsanalysen von GC-behandelter Nagerhaut neue potenzielle Marker identifiziert, deren Regulation in vitro jedoch nicht bestätigt werden konnte. Nach Pilotexperimenten wurden 3 Modelle ausgewählt und für Evaluierungsexperimente mit Referenz-GCs behandelt: 1). MMP1, -2, -3 und -9 mRNA-Expression in NHEK, 2). COL1A1 und COL3A1 mRNA-Expression in 3T3-Zellen, 3.) Epidermisdicke, Kollagen- und MMP-Synthese in FTSM. Die Messparameter der 3 Modelle erwiesen sich als dosisabhängig reguliert und korrelierten mit dem atrophogenen Potenzial der GCs. Schließlich wurde die Prädiktabilität der 3 in vitro Modelle für die in vivo Situation im Nager analysiert. In allen 3 in vitro Systemen induzierte die Behandlung mit einem selektiven GC-Rezeptor-Agonisten weniger atrophogene Effekte als das Referenz-GC. Ähnliche Ergebnisse wurden auch in vivo im Rattenhautatrophie-Modell gefunden. Zusammenfassend wird eine Kaskade von 3 in vitro Modellen empfohlen, um das atrophogene Potential von GC-Rezeptor-Liganden zu bestimmen. Der tatsächliche prädiktive Wert für die klinische Situation sollte in weiteren Studien untersucht werden. / Topical glucocorticoids (GCs) are effective for the therapy of inflammatory skin diseases. However, their use is limited by their side effect potential, with skin atrophy being the most prominent one. Thus, determining the atrophogenic potential of novel compounds is of importance for drug development. Currently, there are no according predictive in vitro models available. The aim of this study was to establish such atrophy models. Rodent and human cutaneous cell types (3T3 cells, rat fibroblasts, HaCaT cells, human keratinocytes [NHEK] and fibroblasts) and human full-thickness skin equivalents (CellSystems AST-2000 and Phenions FTSM) were investigated. Atrophy markers related to proliferation, collagen metabolism and epidermal thickness were measured on mRNA, protein and cellular level, respectively. Additionally, by gene expression profiling of GC-treated rodent skin novel potential markers were identified, but subsequently not confirmed in vitro. After pilot studies 3 models were selected and treated with reference GCs for evaluation experiments: 1.) MMP1, -2, -3 and -9 mRNA expression in NHEK, 2.) COL1A1 and COL3A1 mRNA expression in 3T3 cells, 3.) epidermal thickness, collagen and MMP synthesis in FTSM. The read out parameters of all 3 test systems turned out to be regulated dose-dependently and correlated with the atrophogenic potential of the GCs. Finally, the predictability of the 3 recommended in vitro test system for the rodent in vivo situation was analyzed. In all 3 in vitro test systems, the treatment with a novel selective GC receptor agonist induced less atrophogenic effects than the reference GC clobetasol. Indeed, similar results were found in the hr/hr rat skin atrophy model. In summary, a cascade of 3 in vitro models is recommended to be applied for the characterization of the atrophogenicity of GC receptor ligands. Further experiments are necessary to eventually demonstrate the true predictability of these models for the clinical situation.

In den letzen Jahren gab es durch epidemiologische und molekularbiologische Studien vermehrt Hinweise, dass kutane humane Papillomviren (HPV) ursächlich an der Entstehung nicht-melanozytärer Hauttumore (engl. NMSC) beteiligt sind. Ziel der vorliegenden Arbeit war die Identifizierung molekularer Mechanismen der viralen Proteine E6 und E7 kutaner HPV-Typen. Die E6 oder E7 Gene der verschiedenen HPV-Typen 1, 4, 5, 8, 20, 38 und RTRX7 wurden untersucht. Natürliche Wirtszellen dieser Viren, humane primäre Keratinozyten (HPK) der Haut, wurden mit rekombinanten, für E6 oder E7 kodierenden Retroviren infiziert. Die Analysen erfolgten in Monolayer-Kultur (undifferenzierte Keratinozyten) oder in organotypischen Hautmodellen (Induktion der Keratinozytendifferenzierung). Die Expression von E6 oder E7 führte in Monolayer-HPK zu einer Verlängerung der Lebensspanne und zu einer deutlich erhöhten Verdoppelungsrate. Eine Telomeraseaktivierung, die charakteristisch für immortale Zellen ist, wurde nur in HPV 8 E6 positiven HPK nachgewiesen. In organotypischen Hautmodellen induzierte das E7 Protein von HPV 1, 4 und 38 starke Veränderungen in der Differenzierung sowie eine Zunahme der Proliferation. Weiterhin wurde eine Aufhebung der normalen Zellzykluskontrolle in suprabasalen HPV 5 E7 oder HPV 8 E7 beobachtet. Hinweise auf ein starkes invasives Potential von E7-infizierten HPK wurden für HPV 8 E7 bestätigt und für HPV 4 E7, HPV 38 E7 und RTRX7 E7 erweitert. Molekulare Mechanismen der viralen Gene E6 und E7 kutaner HPV unterscheiden sich von mukosalen Typen. Das Mehrstufenmodell der Karzinogenese beinhaltet eine Reihe fundamentaler Zelltransformationen, die für eine Tumorgenese nötig sind. In dieser Arbeit beschriebene Mechanismen der Modulation der Zelldifferenzierung und Zellproliferation durch die kutanen HPV-Typen 4, 5, 8 und 38 können unter Umständen zur Induktion und Progression früher Stadien von Plattenepithelkarzinomen (SCC) beitragen. / In the last years epidemiologic and molecular biological studies accumulated increasing evidence that cutaneous human papillomaviruses are etiologically involved in the formation of non-melanoma skin cancer (NMSC). The presented work aims to identify the underlying molecular mechanisms of the viral proteins E6 and E7 of cutaneous HPV types. The E6 and E7 genes of the different HPV types 1, 4, 5, 8, 20, and RTRX7, which are in vivo associated with cutaneous benign or malignant lesions, were studied. Natural host cells of these viruses, human primary keratinocyts (HPK) of the skin, were infected with recombinant E6 and E7 encoding retroviruses. The following analyses were performed in monolayer culture (non-differentiated keratinocytes) or in organotypic skin culture (induction of keratinocyte differentiation). The expression of E6 and E7 elongated the life span of monolayer HPK and significantly increased the doubling rate. An activation of the telomerase, characteristic for immortalized cells, was only detected in HPV 8 E6 positive cells. In organotypic skin cultures E7 of HPV 1, 4 and 38 induced drastic changes in differentiation and proliferation. Additionally an impairment of the normal cell cycle control in suprabasale HPV 5 E7 and 8 E7 cultures was seen. Hints for a strong invasive potential of E7 infected HPK were proven for HPV 8 E7 and expanded to HPV 4 E7, HPV 38 E7 and RTRX E7. The viral E6 and E7 genes of cutaneous and mucosal HPV types exhibit different molecular mechanisms. The multistep model of carcinogenesis includes a series of fundamental cell transformations necessary for tumorigenesis. Mechanisms for the modulation of cell differentiation and proliferation by cutaneous HPV types 4, 5, 8 and 38 described in this work could potentially contribute to the induction and progression of early stages of squamous cell carcinoma.