Die subklinische Klauenrehe oder claw horn disruption (CHD) ist von großer wirtschaftlicher Bedeutung für die Rinderhaltung, da sie zu Lahmheiten, Beeinträchtigungen des Allgemeinbefindens sowie einer eingeschränkten Leistungsfähigkeit der Tiere führt. Trotz zahlreicher Untersuchungen sind die pathophysiologischen Grundlagen der CHD noch immer nicht vollständig geklärt. Die derzeitigen Hypothesen weisen auf eine Ischämie in den noch lebensfähigen Epidermisschichten infolge einer veränderten dermalen Mikrozirkulation. Diese hat pathophysiologische Veränderungen zur Folge, die eine Störung der epidermalen Zellproliferation, eine Schädigung der dermo-epidermalen Verbindung sowie eine veränderte Keratinisierung und Hornproduktion umfassen. Von Bedeutung sind daher In-vitro-Ischämiemodelle, um die epidermale Reaktionsmechanismen auf die pathologischen Veränderungen der Dermis zu untersuchen. Ziel in der vorliegenden Arbeit war die Etablierung eines In-vitro-Ischämiemodells auf der Grundlage boviner Keratinozyten aus der Klauenepidermis. Mithilfe dieses Modells sollten die zellulären Pathomechanismen infolge einer Ischämie, einer Hypoxie sowie eines Glukoseentzugs untersucht werden. Des Weiteren stand die Analyse des Differenzierungsverhaltens der Keratinozyten infolge ischämischer, hypoxischer und hypoglykämischer Konditionen im Mittelpunkt. Für die Etablierung des In-vitro-Ischämiemodells diente als Grundlage das oxygen glucose deprivation (OGD)-Modell, das die Untersuchung eines gleichzeitigen Sauerstoff- und Glukosemangels sowie lediglich einer Hypoxie und eines Glukoseentzugs bei bovinen Keratinozyten ermöglichte. Die Versuche wurden in eine Kurzzeitanalyse über 96 Stunden sowie eine Langzeitanalyse über drei Wochen geteilt. Nach erfolgter Exposition wurde die Zellviabilität mittels LDH(Lactatdehydrogenase)- und MTT(3-(4,5-Dimethylhiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazoliumbromid)-Assay untersucht. Des Weiteren wurde das veränderte Differenzierungsverhalten der Keratinozyten infolge der veränderten Kultivierungsbedingungen mittels Western Blot-Analyse anhand der Involukrin- und Lorikrin-Expression untersucht. Die Keratinozyten zeigten infolge einer OGD nach kurzer Expositionsdauer die höchsten zytotoxischen Effekte, die von einer zeitabhängigen Abnahme der Zellviabilität sowie massiven morphologischen Veränderungen gefolgt wurde. Hypoxische Bedingungen bewirkten eine zeitabhängige Abnahme der Zellviabilität, die erst nach zweiwöchiger Inkubation die größte Zytotoxizität aufwies, sowie eine geringgradig veränderte Zellmorphologie bei Erhaltung des Zellverbands. Der Glukoseentzug bewirkte eine stark verminderte Zellviabilität sowie starke morphologische Zellveränderungen. In der Western Blot-Analyse konnte eine gesteigerte Involukrin- und Lorikrin-Expression infolge einer OGD, einer Hypoxie und eines Glukoseentzugs nachgewiesen werden. In der vorliegenden Arbeit konnte erstmalig ein auf bovinen Keratinozyten basierendes In-vitro-Ischämiemodell etabliert werden, das die Untersuchung zellulärer Mechanismen der Epidermis ermöglichte. Die OGD zeigte den stärksten Einfluss auf die Zellviabilität sowie eine veränderte Zelldifferenzierung der Keratinozyten, was die pathophysiologischen Veränderungen im Rahmen der CHD reflektiert. Die ebenfalls starken Zellveränderungen infolge eines Glukoseentzugs verdeutlichen die Rolle der Glukose im Zellmetabolismus der Keratinozyten. Solch ein epidermaler Glukosemangel ist in Verbindung mit der negativen Energiebilanz der Rinder im peripartalen Zeitraum denkbar. Die Ergebnisse infolge einer Hypoxie verweisen auf vielfältige Adaptationsmechanismen der Keratinozyten an hypoxische Bedingungen, denen sie in der Epidermis in vivo während der Zelldifferenzierung ausgesetzt werden. Damit besitzt das In-vitro-Ischämiemodell ein großes Potenzial für den Einsatz in der Klauenreheforschung, um einerseits die mit einer Ischämie einhergehenden pathologischen Veränderungen der CHD untersuchen zu können. Andererseits liefert das Modell wertvolle Informationen zu den physiologischen Grundlagenmechanismen der Epidermis, die mit der Zelldifferenzierung einhergehen. / The subclinical laminitis or claw horn disruption (CHD) is of great economic importance in the dairy industry as it causes lameness, poor general condition and reduced performance. Despite extensive research efforts, the pathomechanism of CHD remains widely unclear. The current hypotheses on CHD pathogenesis include ischemic alterations of the epidermal keratinocytes resulting from an impaired blood supply. This causes an alteration of cell proliferation, a dermo-epidermal separation and an impaired keratinization and horn production. Therefore, in vitro ischemia models are of critical importance in clarification of the epidermal responses to an altered microcirculation. The aim of this study was the establishment of an in vitro ischemia model based on bovine claw keratinocytes. This in vitro model should enable the investigation of cellular pathomechanisms following exposure to ischemia, hypoxia and glucose deprivation. An additional aim was the analysis of the differentiation pattern of keratinocytes under ischemic, hypoxic and hypoglycaemic conditions. To establish the in vitro ischemia model, the keratinocytes were exposed to oxygen-glucose deprivation (OGD). In addition, this model allowed the parallel examination of hypoxic and hypoglycaemic conditions on bovine claw keratinocytes. The experiments were divided into a short-term analysis over 96h and a long-term analysis over three weeks. Measurement of cell viability was performed by LDH(lactatedehydrogenase) and MTT(3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetra- zolium bromide) assays. Furthermore, the differentiation pattern of the keratinocytes after exposure to ischemia, hypoxia and glucose deprivation was detected by western blot analysis of the focus on expression of involucrin and loricrin. The highest cytotoxic effect was measured after short exposure to OGD followed by a time-dependent decrease of cell viability and extensive morphological changes of the keratinocytes. Hypoxic conditions lead to a time-dependent decrease of cell viability with the highest cytotoxicity after two weeks. The keratinocytes showed slight changes in cell morphology while maintaining a confluent cell layer. Exposure of keratinocytes to glucose deprivation showed a high decrease of cell viability and strong morphological changes. Furthermore, western blot analysis showed an altered expression pattern with increased involucrin and loricrin levels after exposure to OGD, hypoxia and glucose deprivation. The present study established for the first time an in vitro ischemia model based on bovine claw keratinocytes to study the cellular mechanisms of the epidermis. After exposure to OGD, keratinocytes showed the highest loss in cell viability and an altered cell differentiation. This reflects the pathophysiological changes following epidermal ischemia occurring during the pathogenesis of CHD. The massive cellular alterations after glucose deprivation provide good evidence for the importance of glucose in the cellular metabolism of keratinocytes. An epidermal glucose deficiency may occur in combination with a negative energy balance during peripartal period in cattle. The results of hypoxia show the different adaptive mechanisms of keratinocytes to hypoxic conditions which are present in the epidermis during cell differentiation. Thus, the in vitro ischemia model has a great potential for use in research into CHD pathogenesis and pathomechanisms associated with ischemia. On one side, it is possible to investigate the pathological changes following ischemia during CHD. On the other side, the model offers useful information on physiological response mechanisms of the epidermis that correlate with cell differentiation.

Einleitung: Klauenerkrankungen und Lahmheiten stellen ein großes ökonomisches sowie tierschutzrelevantes Problem in der modernen Milchviehhaltung dar. Diese werden wesentlich durch die Haltung auf harten Böden wie Beton oder Gussasphalt begünstigt. Daher werden in Rinderställen vermehrt Gummi-Laufflächenbeläge eingebaut, welche die mechanischen Belastungen und somit potentielle Schädigungen der Klauen reduzieren sollen. Die Einwirkung von Kräften in Abhängigkeit unterschiedlicher Böden auf die Klauenfußungsfläche kann mittels Druckmessung untersucht werden. Um dabei den direkten kinetischen Einfluss des Bodens auf die Fußungsfläche ermitteln zu können, sind dünne Sensorfolien nötig. Ziele der Untersuchung: Ziel der Arbeit war es, zunächst ein Ex-vivo-Belastungsmodell für isolierte Rindergliedmaßen zu etablieren, um mit einem folienbasierten Druckmesssystem den direkten kinetischen Einfluss verschiedener Untergründe auf die Fußungsfläche der Klauen zu ermitteln. Anschließend sollte dieses Messsystem erstmals unter lebenden Rindern angewendet werden. Tiere, Material und Methoden: Insgesamt wurden drei Versuche durchgeführt, in denen die kinetischen Einflüsse von Betonboden sowie mindestens einem Gummiboden der Firma Gummiwerk KRAIBURG Elastik GmbH & Co. KG anhand folgender Parameter untersucht wurden: Kraftverteilung, Belastungsfläche sowie durchschnittlicher und maximaler Druck. Die Datenerfassung erfolgte mit dem Hoof™System (Tekscan®). Zunächst wurde ein Ex-vivo-Versuch mit einem speziell für diese Messung angefertigten Belastungsgerät durchgeführt. Damit wurden zwölf linke isolierte distale Hintergliedmaßen auf Betonboden sowie drei Laufgang-Gummimatten (KARERA P, KURA P und profiKURA P) belastet. Außerdem wurde in diesem Versuch neben den oben aufgeführten Parametern zusätzlich die Kraft- und Druckverteilung innerhalb definierter Bereiche unter der Klaue analysiert. Diese Versuchsanordnung wurde anschließend in einen statischen In-vivo-Versuch mit elf auf Beton und KURA P Gummiboden stehenden, adulten Milchkühen überführt. Außerdem wurden die Sensorfolien in einem zweiten In-vivo-Versuch unter den Klauen der linken Hintergliedmaße von zehn adulten Milchkühen angebracht und die kinetischen Einflüsse von Beton und KURA P Gummiboden im Stand und beim Laufen ermittelt. Die statistischen Vergleiche zwischen den Böden wurden gepaart für die Klauen bzw. Kühe sowie zwischen den Versuchen mittels Wilcoxon-Vorzeichen-Rang-Test mit anschließender Post-Hoc-Korrektur nach Bonferroni-Holm berechnet. Für alle Resultate mit einer Wahrscheinlichkeit von p < 0,05 wurde eine statistische Signifikanz angenommen. Zusätzlich wurden im Laufen die Kraft-Zeit-Kurven einzeln für die laterale und mediale Klaue aufgezeichnet. Ergebnisse: In allen Versuchen sowie auf allen untersuchten Böden lastete die Kraft signifikant mehr auf den lateralen als auf den medialen Klauen. Die belastete Fläche war auf allen Gummiböden signifikant größer als auf Betonboden. Dadurch zeigten sich auf allen Gummiböden signifikant geringere Druckbelastungen als auf Betonboden: Der durchschnittliche Druck fiel im Ex-vivo-Versuch auf allen untersuchten Gummiböden im Mittel 34 - 44 % geringer aus als auf Betonboden (44,69 ± 5,39 N/cm²), während die Durchschnittsdruckwerte in den In-vivo-Versuchen auf KURA P-Gummiboden im Mittel um 16 - 21 % geringer waren als auf Beton (statisch: 32,05 ± 4,56 N/cm² bis 35,74 ± 7,66 N/cm², dynamisch: 46,60 ± 13,94 N/cm² bis 55,60 ± 9,78 N/cm²). Der auf die Klauen wirkende Maximaldruck war im Ex-vivo-Versuch auf den getesteten Gummiböden im Mittel 33 - 45 % geringer als auf Beton (130,31 ± 23,29 N/cm²) und in den In-vivo-Versuchen auf KURA P-Gummiboden im Mittel 28 - 32 % geringer als auf dem Betonboden (statisch: 92,12 ± 8,83 N/cm² bis 104,79 ± 20,40 N/cm², dynamisch: 158,47 ± 37,66 N/cm²). Die Kraft-Zeit-Kurven des dynamischen In-vivo-Versuchs zeigten weitgehend biphasische Verläufe mit lokalen Maxima bei 29 % und 79 % der Stützphase. Es traten jedoch interindividuell sowie jeweils zwischen lateralen und medialen Klauen deutliche Unterschiede im Kurvenverlauf auf. Schlussfolgerungen: Das Hoof™System konnte erfolgreich bei Rindern eingesetzt werden. Mit dem Belastungsgerät konnten standardisierte Messwiederholungen auf verschiedenen Untergründen durchgeführt werden. Künftig können damit weitere Untergründe sowie neue Klauenpflegetechniken zunächst ex vivo evaluiert werden, bevor sie an lebenden Rindern Anwendung finden. In allen Versuchen war auf Gummiboden eine mechanische Entlastung der Klauenfußungsfläche zu verzeichnen, was die Vermutung nahelegt, dass diese Böden einen Beitrag zur nachhaltigen Verbesserung der Klauengesundheit in der konventionellen Milchviehhaltung leisten können. / Introduction: Claw lesions and lameness are amongst the major problems in modern dairy husbandry. They are mainly caused by keeping the cows on hard, unyielding floors like concrete or mastic asphalt. Therefore preventively, an increasing number of farmers install rubber floorings in the walking alleys to minimize the mechanical stress to the sole and consequently reduce damage of the claws. The kinetic effect of different flooring types to the sole can be analyzed by means of pressure measurement. In order to detect the direct kinetic impact of the tested flooring, thin sensor foils capturing the interactions between claw and floor are required. Aims of the study: In the present study, an ex vivo load applicator was to be developed in order to use a foil-based pressure measurement system to determine the direct kinetic effect of different flooring types on the claws’ soles. Furthermore, this system was to be applied to live dairy cows for the first time. Materials and Methods: Three trials were conducted in which the kinetic effects of concrete and at least one rubber flooring (Gummiwerk KRAIBURG Elastik GmbH & Co. KG) were analyzed considering the following parameters: force balance, contact area, mean pressure and maximum pressure. Data acquisition was performed with the Tekscan® Hoof™System. Initially, an ex vivo trial was carried out with a purpose-built load applicator. Using this method, twelve left isolated distal hind limbs were loaded on concrete and three rubber floorings (KARERA P, KURA P and profiKURA P). Beside the parameters mentioned above, force and pressure distribution were analyzed within the separate areas of the claw’s sole. Afterwards, this test setting was transposed into a static in vivo trial with eleven adult dairy cows standing on concrete and KURA P rubber mats, respectively. Subsequently, the sensor foils were attached under the left hind limbs of ten adult dairy cows and the kinetic impacts of concrete and KURA P rubber flooring were determined during standing and walking. Statistical analysis was conducted using the Wilcoxon signed-rank test in combination with Holm-Bonferroni post hoc correction. Differences were considered to be significant at p < 0.05. In addition to the parameters mentioned above, force-time-curves of the walking cows were captured separately for the lateral and medial claw. Results: In all trials and on all tested floorings load was distributed unevenly between the claws at the expense of the lateral claw. The contact area was larger on all rubber floorings than on concrete. Therefore, the mean and maximum pressure loads were lower on all rubber floorings compared to concrete: In the ex vivo trial the mean pressure was, on average, 34 - 44 % lower on all rubber floorings than on concrete (44.69 ± 5.39 N/cm²), while in the in vivo measures the mean pressure was, on average, 16 - 21 % lower on KURA P rubber flooring compared to concrete (static: between 32.05 ± 4.56 N/cm² and 35.74 ± 7.66 N/cm², dynamic: between 46.60 ± 13.94 N/cm² and 55.60 ± 9.78 N/cm²). The maximum pressure loads in the ex vivo measures were, on average, 33 - 45 % lower on the tested rubber floorings than on concrete (130.31 ± 23.29 N/cm²) and in the in vivo trials, on average, 28 - 32 % lower on KURA P rubber flooring compared to concrete (static: between 92.12 ± 8.83 N/cm² and 104.79 ± 20.40 N/cm², dynamic: 158.47 ± 37.66 N/cm²). The force-time-curves of the dynamic in vivo study essentially showed biphasic curve progression with local peaks at 29 and 79 % of the stance phase. However, considerable differences in the curve progression between individuals as well as between the respective lateral and medial claw were found. Conclusions: The Hoof™System was applied successfully in dairy cattle claws for the first time. With the load applicator standardized repeated measurements on different floorings were conducted. In the future, more flooring systems as well as novel claw trimming methods can be evaluated using this setup before they are applied on live cattle. In all trials, a mechanical relief for the sole on the rubber floorings was determined. This leads to the conclusion that these floorings may contribute to a sustainable improvement of claw health in conventional dairy husbandry.

Die subklinische Klauenrehe oder claw horn disruption (CHD) ist von großer wirtschaftlicher Bedeutung für die Rinderhaltung, da sie zu Lahmheiten, Beeinträchtigungen des Allgemeinbefindens sowie einer eingeschränkten Leistungsfähigkeit der Tiere führt. Trotz zahlreicher Untersuchungen sind die pathophysiologischen Grundlagen der CHD noch immer nicht vollständig geklärt. Die derzeitigen Hypothesen weisen auf eine Ischämie in den noch lebensfähigen Epidermisschichten infolge einer veränderten dermalen Mikrozirkulation. Diese hat pathophysiologische Veränderungen zur Folge, die eine Störung der epidermalen Zellproliferation, eine Schädigung der dermo-epidermalen Verbindung sowie eine veränderte Keratinisierung und Hornproduktion umfassen. Von Bedeutung sind daher In-vitro-Ischämiemodelle, um die epidermale Reaktionsmechanismen auf die pathologischen Veränderungen der Dermis zu untersuchen. Ziel in der vorliegenden Arbeit war die Etablierung eines In-vitro-Ischämiemodells auf der Grundlage boviner Keratinozyten aus der Klauenepidermis. Mithilfe dieses Modells sollten die zellulären Pathomechanismen infolge einer Ischämie, einer Hypoxie sowie eines Glukoseentzugs untersucht werden. Des Weiteren stand die Analyse des Differenzierungsverhaltens der Keratinozyten infolge ischämischer, hypoxischer und hypoglykämischer Konditionen im Mittelpunkt. Für die Etablierung des In-vitro-Ischämiemodells diente als Grundlage das oxygen glucose deprivation (OGD)-Modell, das die Untersuchung eines gleichzeitigen Sauerstoff- und Glukosemangels sowie lediglich einer Hypoxie und eines Glukoseentzugs bei bovinen Keratinozyten ermöglichte. Die Versuche wurden in eine Kurzzeitanalyse über 96 Stunden sowie eine Langzeitanalyse über drei Wochen geteilt. Nach erfolgter Exposition wurde die Zellviabilität mittels LDH(Lactatdehydrogenase)- und MTT(3-(4,5-Dimethylhiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazoliumbromid)-Assay untersucht. Des Weiteren wurde das veränderte Differenzierungsverhalten der Keratinozyten infolge der veränderten Kultivierungsbedingungen mittels Western Blot-Analyse anhand der Involukrin- und Lorikrin-Expression untersucht. Die Keratinozyten zeigten infolge einer OGD nach kurzer Expositionsdauer die höchsten zytotoxischen Effekte, die von einer zeitabhängigen Abnahme der Zellviabilität sowie massiven morphologischen Veränderungen gefolgt wurde. Hypoxische Bedingungen bewirkten eine zeitabhängige Abnahme der Zellviabilität, die erst nach zweiwöchiger Inkubation die größte Zytotoxizität aufwies, sowie eine geringgradig veränderte Zellmorphologie bei Erhaltung des Zellverbands. Der Glukoseentzug bewirkte eine stark verminderte Zellviabilität sowie starke morphologische Zellveränderungen. In der Western Blot-Analyse konnte eine gesteigerte Involukrin- und Lorikrin-Expression infolge einer OGD, einer Hypoxie und eines Glukoseentzugs nachgewiesen werden. In der vorliegenden Arbeit konnte erstmalig ein auf bovinen Keratinozyten basierendes In-vitro-Ischämiemodell etabliert werden, das die Untersuchung zellulärer Mechanismen der Epidermis ermöglichte. Die OGD zeigte den stärksten Einfluss auf die Zellviabilität sowie eine veränderte Zelldifferenzierung der Keratinozyten, was die pathophysiologischen Veränderungen im Rahmen der CHD reflektiert. Die ebenfalls starken Zellveränderungen infolge eines Glukoseentzugs verdeutlichen die Rolle der Glukose im Zellmetabolismus der Keratinozyten. Solch ein epidermaler Glukosemangel ist in Verbindung mit der negativen Energiebilanz der Rinder im peripartalen Zeitraum denkbar. Die Ergebnisse infolge einer Hypoxie verweisen auf vielfältige Adaptationsmechanismen der Keratinozyten an hypoxische Bedingungen, denen sie in der Epidermis in vivo während der Zelldifferenzierung ausgesetzt werden. Damit besitzt das In-vitro-Ischämiemodell ein großes Potenzial für den Einsatz in der Klauenreheforschung, um einerseits die mit einer Ischämie einhergehenden pathologischen Veränderungen der CHD untersuchen zu können. Andererseits liefert das Modell wertvolle Informationen zu den physiologischen Grundlagenmechanismen der Epidermis, die mit der Zelldifferenzierung einhergehen. / The subclinical laminitis or claw horn disruption (CHD) is of great economic importance in the dairy industry as it causes lameness, poor general condition and reduced performance. Despite extensive research efforts, the pathomechanism of CHD remains widely unclear. The current hypotheses on CHD pathogenesis include ischemic alterations of the epidermal keratinocytes resulting from an impaired blood supply. This causes an alteration of cell proliferation, a dermo-epidermal separation and an impaired keratinization and horn production. Therefore, in vitro ischemia models are of critical importance in clarification of the epidermal responses to an altered microcirculation. The aim of this study was the establishment of an in vitro ischemia model based on bovine claw keratinocytes. This in vitro model should enable the investigation of cellular pathomechanisms following exposure to ischemia, hypoxia and glucose deprivation. An additional aim was the analysis of the differentiation pattern of keratinocytes under ischemic, hypoxic and hypoglycaemic conditions. To establish the in vitro ischemia model, the keratinocytes were exposed to oxygen-glucose deprivation (OGD). In addition, this model allowed the parallel examination of hypoxic and hypoglycaemic conditions on bovine claw keratinocytes. The experiments were divided into a short-term analysis over 96h and a long-term analysis over three weeks. Measurement of cell viability was performed by LDH(lactatedehydrogenase) and MTT(3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetra- zolium bromide) assays. Furthermore, the differentiation pattern of the keratinocytes after exposure to ischemia, hypoxia and glucose deprivation was detected by western blot analysis of the focus on expression of involucrin and loricrin. The highest cytotoxic effect was measured after short exposure to OGD followed by a time-dependent decrease of cell viability and extensive morphological changes of the keratinocytes. Hypoxic conditions lead to a time-dependent decrease of cell viability with the highest cytotoxicity after two weeks. The keratinocytes showed slight changes in cell morphology while maintaining a confluent cell layer. Exposure of keratinocytes to glucose deprivation showed a high decrease of cell viability and strong morphological changes. Furthermore, western blot analysis showed an altered expression pattern with increased involucrin and loricrin levels after exposure to OGD, hypoxia and glucose deprivation. The present study established for the first time an in vitro ischemia model based on bovine claw keratinocytes to study the cellular mechanisms of the epidermis. After exposure to OGD, keratinocytes showed the highest loss in cell viability and an altered cell differentiation. This reflects the pathophysiological changes following epidermal ischemia occurring during the pathogenesis of CHD. The massive cellular alterations after glucose deprivation provide good evidence for the importance of glucose in the cellular metabolism of keratinocytes. An epidermal glucose deficiency may occur in combination with a negative energy balance during peripartal period in cattle. The results of hypoxia show the different adaptive mechanisms of keratinocytes to hypoxic conditions which are present in the epidermis during cell differentiation. Thus, the in vitro ischemia model has a great potential for use in research into CHD pathogenesis and pathomechanisms associated with ischemia. On one side, it is possible to investigate the pathological changes following ischemia during CHD. On the other side, the model offers useful information on physiological response mechanisms of the epidermis that correlate with cell differentiation.