Im Mittelpunkt der Arbeit stehen Betrachtungen zur Mobilität von epikutan applizierten ESR-Spinsonden, sowie noch weitgehend ungeklärte Fragen zu den Wechselwirkungen zwischen Liposomen und Haut. Dazu gehört vor allem die Frage nach der Integrität von epikutan applizierten Liposomen. Weiterhin wurden die Auswirkungen von Liposomen auf die Flexibilität der intercorneozytären Lipiddoppelmembranen, die Penetration von ESR-Spinsonden unterschiedlicher Hydro-/Lipophilie, sowie die Mobilität von ESR-Spinsonden in der Haut und die Polarität ihrer Mikroumgebung untersucht. Als wichtigste Ergebnisse der Arbeit sind folgende Punkte zu nennen. Liposomen verlieren nach epikutaner Applikation ihre Integrität und bilden auf dem Stratum corneum einen Lipidfilm aus. Dabei nimmt nicht nur der Dispersitätsgrad der Liposomen sondern auch die Flexibilität ihrer Membranen ab. Entgegen der Erwartung führt die epikutane Applikation von liposomalen Zubereitungen nicht zu einer stärkeren Fluidisierung der intercorneozytären Lipiddoppelmembranen als Phosphatpuffer, wohingegen durch Ölsäure eine deutlich stärkere Fluidisierung erreicht wird. Liposomen mit rigiden Membranen führen zu höheren Spinsondenkonzentrationen in der Haut als Liposomen mit fluiden Membranen, und solche aus partialsynthetischen Lipiden führen zu höheren Konzentrationen als Liposomen aus Sojabohnenphospholipiden. Der Vergleich der Penetration von ESR-Spinsonden in die Haut nach epikutaner Applikation von Liposomen mit der Penetration der Spinsonden aus anderen topischen Zubereitungen zeigt, dass eine generelle Aussage zur Penetrationsförderung durch die Anwendung von Liposomen problematisch ist. Es konnte ein Polaritätsprofil der Mikroumgebung von Spinsonden in der Haut erstellt werden, das belegt, dass die Polarität in der Epidermis geringer ist als in der Dermis. Mit zunehmender Inkubationsdauer konnte ein Anstieg der Polartiät in den Hautproben nachgewiesen werden. Die Anwendung eines durch Freed et al. entwickelten Computerprogramms zur Bestimmung von Rotationskorrelationszeiten sich langsam bewegender Moleküle aus Spektren, die mittels spektral-räumlich aufgelöster ESR-Tomografie erhalten wurden, erlaubt die Erstellung von Viskositätsprofilen der oberen Hautschichten in Abhängigkeit von den epikutan applizierten Zubereitungen. Die Bandbreite der ortsabhängig berechneten Rotationskorrelationszeiten von CAT-1 und TEMPOL in der Haut nach epikutaner Applikation der Spinsonden in Liposomen reicht von 5,94 ns bis 1,97 ns. Dies entspricht einer Viskosität der Mikroumgebung von 118 bis 26 mPas. / The present thesis was focused on the mobility of epicutaneously applied ESR spinprobes and open questions concerning the interactions between liposomes and skin e.g. the integrity of liposomes after epicutaneous application. Additionally the effect of liposomes on the flexibility of lipid membranes in the stratum corneum, the penetration of ESR spinprobes with different hydrophilic / lipophilic properties as well as the mobility and polarity of the microsurrounding of ESR spinprobes in the skin were investigated. The main results of the investigations are mentioned in the following. There will be a loss of integrity of epicutaneously applied liposomes and a lipid film will be formed on the stratum corneum. At the same time the degree of dispersity and the flexibility of their membranes decreases. Contrary to the expectation the application of liposomal formulations does not lead to a stronger fluidity of the lipid membranes of the stratum corneum than the incubation of the samples with phosphate buffer, whereas the incubation with oleic acid results in a substantial increase of the fluidity. The application of ESR spinprobes in liposomes with rigid membranes leads to higher spinprobe concentrations in the skin than with liposomes having fluid membranes. At the same time the application of liposomes made from semi-synthetic lipids leads to higher concentrations of the spinprobe in the skin, than the application of liposomes made from soybean phospholipids. The penetration of spin probes into the skin out of liposomes compared to other topical preparations shows, that a general statement concerning the penetration enhancing effect of liposomes is difficult. On using the ESR tomography a polarity profile of the skin was obtained, showing that the polarity in the epidermis is lower than in the dermis. With increasing incubation time of the skin samples the polarity increases. The application of a computer program, developed by Freed et al. in order to determine rotational correlation times for slowly tumbling molecules, to spectra, obtained from spectral-spatially resolved ESR tomography, allowed the establishment of viscosity profiles for the upper skin layers in dependency on the applied formulations. The range of the calculated rotational correlation times of CAT-1 and TEMPOL in the skin reaches from 5.94 ns to 1.97 ns. This corresponds to a viscosity of the spinprobes microsurrounding from 118 to 26 mPas.

Met und der korrespondierende Ligand HGF/SF sind im hyperproliferativen Epithelium von Hautwunden exprimiert. Aus diesem Grund ist es wahrscheinlich, dass der Rezeptor und sein Ligand in autokriner Weise wechselwirken und wichtige Funktionen für den Heilungsprozess der Haut besitzen. Unter Verwendung der Keratin 14 Cre-Rekombinase konnte ein „Knockout“ des Met-Rezeptors spezifisch in der Epidermis erzielt werden. In der Tat zeigten die Ergebnisse, dass Met für die Re-epithelisierung in Wundschlussprozessen essentiell ist, da in den an der Wundheilung beteiligten Keratinozyten keine Rekombination des Met-Gens stattgefunden hat. In Met-Mausmutanten war der Wundschlussprozess verlangsamt, denn er erfolgte ausschließlich durch wenige Keratinozyten, in denen die Cre-Rekombinase keine Rekombination bewirkte. Met konnte als erstes Gen identifiziert werden, das absolut erforderlich für Re epithelisierungsprozesse von Wunden ist. Diese Arbeit trägt daher wesentlich zum Verständnis der Regulation von Wundheilungsprozessen bei. / Met and its ligand, HGF/SF are expressed in the hyperproliferative epithelium of the wound. This suggests that receptor and ligand may act in an autocrine manner to promote wound healing in the skin. Using Keratin 14 cre recombinase, Met receptor was specifically knockout in the epidermis. In this way, it was demonstrated that Met receptor is essential for wound healing process and that keratinocytes, which contributed to the wound closure were Met-postitive. In the Met mutant mice, wound closure was slightly attenuated, but occurred exclusively by a few keratinocytes that had escaped recombination. Met is therefore the fist gene, which is absolutely required for re-epithelialization of the wound. This finding is fundamental for understanding the regulation of wound healing process.

Die Familie der ErbB-Rezeptor-Tyrosinkinasen besteht aus vier Mitgliedern, dem EGF-Rezeptor (ErbB-1), ErbB-2, ErbB-3 und ErbB-4. ErbB-Rezeptoren spielen eine wichtige Rolle bei der Entwicklung des Nervensystems, des Herzens und der Brustdrüsen. Ein Teil dieser Differenzierungsvorgänge läßt sich in vitro nachvollziehen: so ist zum Beispiel die Aktivierung des ErbB-2 Rezeptors ausreichend für alveoläre Morphogenese der Brustdrüsenepithelzellinie EpH4. Intrazelluläre Moleküle, die dieses ErbB2-Signal übertragen, sind allerdings noch unbekannt. Mit Hilfe eines neuen, modifizierten Hefe-2-Hybrid-Systems wurde in der vorliegenden Arbeit Vav2 als neuer Interaktionspartner von ErbB-2 identifiziert. Vav2 assoziiert mit aktiviertem ErbB-2 über eine SH2-Domäne. Die Interaktion ist direkt und ist von zwei Phosphotyrosinen in ErbB-2 abhängig. Vav2 kann den GDP/GTP-Austausch bei GTPasen der Rho-Familie vermitteln. Dadurch kann der Umbau des Zytoskeletts und Veränderungen der Transkription sowie Zelltransformation induziert werden. In einem dreidimensionalen Zellkultursystem kann aktiviertes Vav2 in EpH4 Zellen die Bildung von alveolären Zellaggregaten induzieren. In diesen Alveolen umgibt eine Schicht polarisierter milchproduzierender Zellen ein zentrales Lumen. Diese Vav2-vermittelte Morphogenese ist abhängig von der katalytischen GDP/GTP-Austausch Aktivität von Vav2. Katalytisch-inaktives Vav2 kann die morphogenetische Aktivität von ErbB-2 in EpH4-Zellen verhindern, ohne die mitogene Aktivität von ErbB-2 zu beeinflussen. Vav2 ist mit ErbB-2 coexprimiert und interagiert mit dem Rezeptor in Brustdrüsenzellen schwangerer Mäuse. Diese Untersuchungen deuten darauf hin, dass Vav2 eine wichtige Funktion bei der durch ErbB-2 induzierten alveolären Morphogenese der Brustdrüse spielt. / The ErbB receptor tyrosine kinases constitute a subfamily of four structurally related members, the EGF receptor (ErbB-1), ErbB-2, ErbB-3 and ErbB-4. ErbB receptor tyrosine kinases are critical for embryonic development of central and peripheral neural structures and heart. In addition, ErbB receptors play an important role in the postnatal development of the mammary gland. Previous studies showed that activated ErbB-2 receptor induces alveolar morphogenesis of EpH4 mammary epithelial cells that are cultured on a three-dimensional matrix (termed Matrigel). However, the downstream signaling proteins that mediate this biological activity of ErbB-2 were unknown. In this work, Vav2 was identified as a direct interaction partner of tyrosine-phosphorylated ErbB receptors using the yeast two-hybrid system. Vav2 is a member of a family of guanine nucleotide exchange factors that induce cytoskeletal rearrangements, transcriptional alterations, and have oncogenic potential when activated. To test the ability of Vav2 to mediate morphogenic signals of ErbB-2, EpH4 cells overexpressing Vav2 protein were cultured on Matrigel. Indeed, Vav2 induces alveolar morphogenesis of EpH4 cells when activated either by oncogenic mutation or tyrosine phosphorylation by ErbB-2. The morphogenic activity of Vav2 requires the Dbl homology domain, which mediates GDP/GTP exchange. Dominant-negative Vav2 specifically blocks the morphogenic signals of ErbB-2 in EpH4 cells without interfering with ErbB2-induced mitogenesis. Importantly, Vav2 is co-expressed and interacts with ErbB-2 in the mammary glands of pregnant mice. Taken together, these results point to Vav2 as a candidate to mediate ErbB-2 signals for alveolar morphogenesis in vivo, which is a relevant step in the development of the mammary gland during pregnancy.

Die in dieser Arbeit isolierten und hochaufgereinigten, humanen dermalen Mastzellen wurden mit UVB, UVA-1 und PUVA-1 bestrahlt und anschließend entweder mit Substanz P oder anti-IgE stimuliert. Dadurch sollten Einblicke in die unterschiedlichen Wirkmechanismen der bei zahlreichen mastzellassoziierten Erkrankungen eingesetzten UV Licht Therapie gewonnen werden. Ein Schwerpunkt dieser Arbeit lag in der Erforschung der Histamin-, Tryptase- und Zytokinfreisetzung von menschlichen Mastzellen. Zusätzlich wurde die Expression von Lysosomen-assoziierten Membran Proteinen (LAMPs) auf der Oberfläche dieser Zellen untersucht. Im Gegensatz zu der durch UV Licht induzierbaren spontanen Histaminfreisetzung zeigte sich die anti-IgE stimulierte Histaminausschüttung durch UVB, UVA-1 und PUVA-1 signifikant und dosisabhängig inhibierbar. Auch die durch Substanz P stimulierten Mastzellen gaben nach UVA-1 Bestrahlung deutlich weniger Histamin ab. Demgegenüber blieb die sezernierte Menge des Mediators nach UVB und PUVA-1 konstant. Analog zu den erhobenen Histaminergebnissen konnte eine signifikante Inhibition der anti-IgE induzierten Tryptasefreisetzung nachgewiesen werden. Ebenso zeigte sich eine signifikante Verringerung, der innerhalb von vierundzwanzig Stunden basal freigesetzten Menge an Interleukin-6 und Interleukin-8, nach UV Bestrahlung. Die spontane Ausschüttung vom Tumornekrosefaktor-a verblieb in dem Untersuchungszeitraum auf sehr geringem Niveau, so dass eine relevante Beeinflussung durch UV Licht nicht stattfand. Des weiteren konnte eine vermehrte basale Expression von CD107a und CD63 auf der Mastzellmembran durch UV Bestrahlung demonstriert werden. Auch die anti-IgE induzierte Mehrexpression der LAMPs konnte bei den drei Bestrahlungsarten nachweisbar supprimiert werden. Die in dieser Arbeit gewonnenen Erkenntnisse zeigen, dass die Auswirkungen der UV Licht Therapie auf Mastzellen sehr komplex sind. Zu beachten ist, dass unter physiologischen Bedingungen nicht nur isolierte Mastzellen, sondern auch weitere bestrahlte Zellverbände eine Veränderung erfahren. Erst durch das Zusammenspiel aller Zellen lassen sich Rückschlüsse auf Krankheitsbilder und die anzuwendende Therapien ziehen. Letztendlich soll diese Arbeit dazu beitragen, dass das Verständnis der unterschiedlichen Wirkungen von UV Licht begriffen und so ein sinnvolles und gezieltes Einsetzen im klinischen Alltag ermöglicht wird. / For all experiments highly purified dermal mast cells were used. The aim of the current study was to systematically investigate the effects of UVB, UVA-1 and PUVA-1 on skin derived human mast cells. Baseline and stimulated release of histamine, tryptase and of the proinflammatory cytokines IL-6, IL-8 and TNF-a were examined. Furthermore, the CD 107a and CD 63 surface levels in UV treated cells were investigated representing two members of lysosome associated membrane proteins which were found to appear on mast cell surface during degranulation. Prior treatment with UV resulted in a striking suppression of the anti-IgE induced release of preformed mediators such as histamine and tryptase in a dose dependent manner. This inhibition was accompanied by a diminished, anti-IgE mediated increase in CD 107a and CD 63 surface expression. In sharp contrast, UV-light slightly preactivates mast cells as indicated by a marginal but statistically significant direct UV-caused histamine release. Theses findings matched the observation of slightly enhanced CD 107a and CD 63 surface levels in UV treated but unstimulated cells. After UVA-1 treatment the histamine release of substance P stimulated mast cells is statistically significant reduced which contrasts to the unchanged liberation of this preformed marker after UVB and PUVA-1 irradiation. Furthermore the release of mediators that are not or only partially preformed was examined. In the present study all types of UV-irradiation inhibits baseline IL-6 and IL-8 secretion from mast cells. The very low baseline level of TNF-a remained unaffected. Taken together, the present findings identify cutaneous human mast cells as important targets of UV-induced immunomodulation. They help explain both the dose-dependent adverse effects of UV-light and the beneficial and desired antiinflammatory effects during therapy.