Abstract The epithelial cells form barriers that compartmentalize the organs. Carcinomas are cancers stemming from epithelial cells and are the most common cancer type. The aim of this study was to understand the differentiation and malignant transformation of epithelial Madin-Darby canine kidney (MDCK) cells and to analyse the electrophysiological parameters which regulate their transport capacity. Emphasis was placed on comparing different culture environments, both in 2D and 3D. First, the effects of drugs or basal extracellular fluid composition on MDCK cell, cyst and lumen volumes were analysed using time-lapse microscopy. The results showed that MDCK cells were capable of both water secretion and reabsorption. The cells were able to perform these functions in a hyperpolarizing or depolarizing environment; change in osmolality of basal fluid was not required. Taken together, these results validate MDCK cells as a good basic model for studying kidney function. Next, the aim was to analyse the effect of 2D and 3D culture environments on the gene expression of untransformed MDCK and temperature sensitive ts-Src -transformed MDCK cells and the changes a single oncogene can induce. Microarray analysis revealed a decrease in the expression of survivin, an inhibitor of apoptosis protein, when switching the untransformed cells from 2D environment to 3D. This downregulation of survivin occurs in adult tissues as well, indicating that the cells grown in 3D are closer to the in vivo state than 2D cells. Src oncogene induced disintegration of cell junctions, but did not downregulate E-cadherin expression. The last part was to study further the factors controlling survivin expression and its significance to cell survival. MDCK cells grown in 3D did not suffer apoptosis if the cells remained in contact with the extracellular matrix. If MDCK cells were denied of ECM contacts they were more susceptible to apoptosis than survivin-expressing ts-Src MDCK cells. Finally, if cells were denied of cell-cell junctions, cells lacking survivin suffered apoptosis even though they had proper cell-matrix contacts. Taken together, these results highlighted the importance of cellular contacts to the cells: MDCK cells needed ECM contacts to differentiate and cell-cell contacts to avoid apoptosis. / Tiivistelmä Epiteelisolut ovat erikoistuneet toimimaan rajapintana elimen ja ympäristön välillä. Ihmisten yleisin syöpä on epiteelisoluista alkunsa saanut karsinooma. Tämän tutkimuksen tarkoituksena oli ymmärtää Madin-Darby-koiran munuaisen solujen (MDCK) erilaistumista ja pahanlaatuistumista sekä analysoida sähköfysiologisia tekijöitä, jotka säätelevät näiden solujen kuljetustoimintaa. Erityisenä kiinnostuksen kohteena oli erilaisten kasvuympäristöjen vertailu. Farmakologisten aineiden tai basaalisen, solunulkopuolisen nesteen koostumuksen vaikutusta MDCK-solujen, -kystan sekä luumenin kokoon tutkittiin valomikroskooppisten aikasarjojen avulla. Tulokset osoittivat MDCK-solujen olevan kykeneviä sekä veden eritykseen että absorptioon, niin hyperpolarisoivassa kuin depolarisoivassakin ympäristössä. Basaalisen nesteen osmolaliteetin muutosta ei tarvittu. Nämä tulokset osoittavat MDCK-solujen olevan hyvä munuaisen tutkimuksen perusmalli. Seuraavaksi analysoitiin kaksi- ja kolmiulotteisten (2D ja 3D) viljely-ympäristöjen vaikutusta ei-transformoitujen MDCK-solujen ja lämpötilaherkkien ts-Src-transformoitujen MDCK-solujen geenien ilmentymiseen sekä yhden onkogeenin aktivoimisen aikaansaamia muutoksia. Microarray-analyysi osoitti apoptoosin estäjän, surviviinin, ilmentymisen vähenemisen, kun kasvuympäristö vaihdettiin 2D-ympäristöstä 3D-ympäristöön. Koska surviviinin väheneminen on normaali tapahtuma aikuisissa kudoksissa, voitiin todeta, että 3D-ympäristössä kasvatetut solut ovat lähempänä luonnonmukaista olotilaa kuin 2D-ympäristössä kasvaneet. Src-onkogeeni sai aikaan soluliitosten hajoamisen, mutta ei vähentänyt E-kadheriinin ilmentymistä. Tutkimuksen viimeinen osa keskittyi surviviinin ilmentymistä säätelevien tekijöiden analysoimiseen ja surviviinin merkitykseen solujen eloonjäämiselle. 3D-ympäristössä kasvaneet MDCK-solut eivät kärsineet apoptoosista edellyttäen, että solut pysyivät kosketuksissa soluväliaineeseen. Jos solut irtautuivat soluväliaineesta, ne päätyivät herkemmin apoptoosiin kuin surviviinia ilmentävät ts-Src MDCK-solut. Mikäli solujen väliset liitokset pakotettiin avautumaan, solut joutuivat apoptoosiin, vaikka ne olivat kosketuksissa soluväliaineeseen. Yhteenvetona nämä tulokset korostavat solujen kontaktien merkitystä: MDCK-solut tarvitsevat soluväliainekontakteja erilaistumiseen ja solujen välisiä kontakteja välttyäkseen apoptoosilta.

Abstract Toll-like receptors (TLRs) are transmembrane proteins involved in the recognition of specific microbial structures and thus the activation of signaling cascades of innate immunity. Regulation of the innate immune response is a complex biological process involving the combined synergistic and antagonistic effects of distinct signaling mediators. Although TLR signaling has been widely studied in recent years, there remain many unexplored unique features of each TLR signaling pathway. The present study evaluated the activation and regulation of TLR4 and TLR2 signaling with the aim of better understanding the molecular mechanisms that control these inflammatory signaling pathways. In the present study, the signal transduction mechanisms of TLR4 and TLR2 in response to Escherichia coli LPS and Staphylococcus aureus LTA were evaluated in mouse macrophages. The inductions, interactions, and activations of the signaling molecules and mediators in the TLR pathways were studied by using several molecular biology and protein chemistry methods. In addition, the role of TLR4 and TLR2 in the regulation of the hepatic inflammatory reaction during endotoxemia was studied. Mouse macrophages were found to induce central proinflammatory mediators in response to LPS and LTA stimulation. Specific roles for PI 3-kinase and Btk were described. These kinases were found to be activated by LPS and LTA; moreover, PI 3-kinase and Btk were found to form specific interactions with TLRs and their intracellular signaling mediators. In addition, a unique IRF2 signaling pathway for LTA-induced TLR2 was found, resulting in the activation of signal transducers and activators of transcription (Stats) and IFN-α secretion. The secreted IFN-α was shown to regulate the LTA-induced inflammatory responses, thereby combining the LTA-induced IRF proteins into NF-κB pathway. The present study provides insight into the signal transduction mechanisms of TLRs. The understanding of these molecular mechanisms that control the activation of TLR signaling cascades will in the future help to predict predisposition and outcome in infectious diseases, and to control the course of disease at an earlier stage. / Tiivistelmä Toll:n kaltaiset reseptorit (TLR) ovat solukalvon proteiineja, jotka tunnistavat taudinaiheuttajien eli patogeenien spesifisiä rakenteita johtaen elimistön puolustusjärjestelmän, immuniteetin, aktivoitumiseen. Immuniteetin säätely on monimutkainen biologinen prosessi, joka tapahtuu kudosten, solujen ja erilaisten synnynnäiseen immuniteettiin liittyvien molekyylien vuorovaikutuksina. Tulehdusvasteen säätelyssä tasapaino positiivisten ja negatiivisten säätelysignaalien välillä on erittäin tärkeää, jotta autoimmuunisairauksien, akuuttien tai kroonisten tulehdusten sekä infektiosairauksien synty voitaisiin välttää. Tämän tutkimuksen tavoitteena oli saada lisätietoa TLR2 ja TLR4 proteiinien säätelemistä signaalireiteistä, niiden vasteista tiettyjä patogeenirakenteita vastaan ja ymmärtää paremmin synnynnäisen immuniteetin puolustusmekanismeja. Patogeenirakenteiden aiheuttamaa tulehdusvastetta tutkittiin pääosin soluviljelymallissa. Lisäksi selvitettiin immuunivasteen luonnetta fysiologisessa kokonaisuudessa ja sen korrelaatiota solutasolla nähtyihin vasteisiin käyttäen in vivo hiirimallia. Tutkimus tehtiin käyttäen useita molekyylibiologian ja proteiinikemian menetelmiä proteiini- ja mRNA-ekspressioiden sekä proteiini-interaktioiden tutkimiseen ja erilaisten aktiivisuuksien määrityksiin. Tulehdusvastetta tutkittiin etenkin sytokiinivastetta määrittämällä ja signaaliketjujen toimintaa analysoitiin estämällä spesifisesti niiden toimintaa. Tarkoituksena oli selvittää, mitkä tekijät ovat välttämättömiä kyseisten tulehdusta aiheuttavien bakteerien tunnistuksessa ja puolustusreaktiossa niitä vastaan. Tutkimuksessa havaittiin kahden kinaasin, PI 3-kinaasin ja Brutonin tyrosiinikinaasin, liittyvän oleellisesti TLR signaalireitteihin. Nämä TLR:ien stimulaation seurauksena aktivoituneet kinaasit muodostivat spesifisiä sidoksia TLR:ien ja niiden signaaliketjuihin liittyvien solunsisäisten signaalivälittäjien kanssa. Lisäksi TLR2 signaalireitillä havaittiin aktivoituvan tekijöitä, jotka johtivat interferoni-α välitteiseen tulehdusvasteen säätelyyn. TLR signaalireittien selvittäminen auttaa ymmärtämään tulehdussairauksien patofysiologiaa ja voi siten tulevaisuudessa johtaa parempien hoitomenetelmien kehittämiseen.