Abstract The epithelial cells form barriers that compartmentalize the organs. Carcinomas are cancers stemming from epithelial cells and are the most common cancer type. The aim of this study was to understand the differentiation and malignant transformation of epithelial Madin-Darby canine kidney (MDCK) cells and to analyse the electrophysiological parameters which regulate their transport capacity. Emphasis was placed on comparing different culture environments, both in 2D and 3D. First, the effects of drugs or basal extracellular fluid composition on MDCK cell, cyst and lumen volumes were analysed using time-lapse microscopy. The results showed that MDCK cells were capable of both water secretion and reabsorption. The cells were able to perform these functions in a hyperpolarizing or depolarizing environment; change in osmolality of basal fluid was not required. Taken together, these results validate MDCK cells as a good basic model for studying kidney function. Next, the aim was to analyse the effect of 2D and 3D culture environments on the gene expression of untransformed MDCK and temperature sensitive ts-Src -transformed MDCK cells and the changes a single oncogene can induce. Microarray analysis revealed a decrease in the expression of survivin, an inhibitor of apoptosis protein, when switching the untransformed cells from 2D environment to 3D. This downregulation of survivin occurs in adult tissues as well, indicating that the cells grown in 3D are closer to the in vivo state than 2D cells. Src oncogene induced disintegration of cell junctions, but did not downregulate E-cadherin expression. The last part was to study further the factors controlling survivin expression and its significance to cell survival. MDCK cells grown in 3D did not suffer apoptosis if the cells remained in contact with the extracellular matrix. If MDCK cells were denied of ECM contacts they were more susceptible to apoptosis than survivin-expressing ts-Src MDCK cells. Finally, if cells were denied of cell-cell junctions, cells lacking survivin suffered apoptosis even though they had proper cell-matrix contacts. Taken together, these results highlighted the importance of cellular contacts to the cells: MDCK cells needed ECM contacts to differentiate and cell-cell contacts to avoid apoptosis. / Tiivistelmä Epiteelisolut ovat erikoistuneet toimimaan rajapintana elimen ja ympäristön välillä. Ihmisten yleisin syöpä on epiteelisoluista alkunsa saanut karsinooma. Tämän tutkimuksen tarkoituksena oli ymmärtää Madin-Darby-koiran munuaisen solujen (MDCK) erilaistumista ja pahanlaatuistumista sekä analysoida sähköfysiologisia tekijöitä, jotka säätelevät näiden solujen kuljetustoimintaa. Erityisenä kiinnostuksen kohteena oli erilaisten kasvuympäristöjen vertailu. Farmakologisten aineiden tai basaalisen, solunulkopuolisen nesteen koostumuksen vaikutusta MDCK-solujen, -kystan sekä luumenin kokoon tutkittiin valomikroskooppisten aikasarjojen avulla. Tulokset osoittivat MDCK-solujen olevan kykeneviä sekä veden eritykseen että absorptioon, niin hyperpolarisoivassa kuin depolarisoivassakin ympäristössä. Basaalisen nesteen osmolaliteetin muutosta ei tarvittu. Nämä tulokset osoittavat MDCK-solujen olevan hyvä munuaisen tutkimuksen perusmalli. Seuraavaksi analysoitiin kaksi- ja kolmiulotteisten (2D ja 3D) viljely-ympäristöjen vaikutusta ei-transformoitujen MDCK-solujen ja lämpötilaherkkien ts-Src-transformoitujen MDCK-solujen geenien ilmentymiseen sekä yhden onkogeenin aktivoimisen aikaansaamia muutoksia. Microarray-analyysi osoitti apoptoosin estäjän, surviviinin, ilmentymisen vähenemisen, kun kasvuympäristö vaihdettiin 2D-ympäristöstä 3D-ympäristöön. Koska surviviinin väheneminen on normaali tapahtuma aikuisissa kudoksissa, voitiin todeta, että 3D-ympäristössä kasvatetut solut ovat lähempänä luonnonmukaista olotilaa kuin 2D-ympäristössä kasvaneet. Src-onkogeeni sai aikaan soluliitosten hajoamisen, mutta ei vähentänyt E-kadheriinin ilmentymistä. Tutkimuksen viimeinen osa keskittyi surviviinin ilmentymistä säätelevien tekijöiden analysoimiseen ja surviviinin merkitykseen solujen eloonjäämiselle. 3D-ympäristössä kasvaneet MDCK-solut eivät kärsineet apoptoosista edellyttäen, että solut pysyivät kosketuksissa soluväliaineeseen. Jos solut irtautuivat soluväliaineesta, ne päätyivät herkemmin apoptoosiin kuin surviviinia ilmentävät ts-Src MDCK-solut. Mikäli solujen väliset liitokset pakotettiin avautumaan, solut joutuivat apoptoosiin, vaikka ne olivat kosketuksissa soluväliaineeseen. Yhteenvetona nämä tulokset korostavat solujen kontaktien merkitystä: MDCK-solut tarvitsevat soluväliainekontakteja erilaistumiseen ja solujen välisiä kontakteja välttyäkseen apoptoosilta.

Abstract This thesis focuses on mammalian kidney development and in particular on the question of how two Wnt signalling pathway genes, an antagonistic Dkk1 and an agonistic ligand Wnt5a, regulate the process. Wnts are secreted ligands that are involved in many developmental processes, including gonadal differentiation and kidney development, but also in various diseases and malformations. Wnts form a large signalling family containing 19 different glycoprotein ligands in mammals. Wnt signalling occurs via two different intracellular pathways. A canonical pathway proceeds via beta-catenin, and a non-canonical pathway utilizes other signalling molecules. Dkk1 is an antagonist of the canonical pathway and Wnt5a is considered a ligand that activates the non-canonical signalling pathway. As part of the thesis, I have studied the role of Dkk1 in kidney morphogenesis using a conditional mouse model, in which the gene is deleted in a cell specific manner from the collecting ducts. Dkk1 deficiency increased renal papilla growth and the risk of hydronephrosis. Research pointed out that the lack of Dkk1 in the collecting ducts increased cell proliferation and disturbed the balance of canonical Wnt signalling, which led to an overgrowth of renal papilla. This led to functional phenotypes including increased water reabsorption and changes in ion secretion/absorption. These changes are most likely due to altered Wnt7b signalling. The second part of the thesis examines the role of the non-canonical Wnt5a gene in kidney development with a conventional knock out mouse model. At the time work began on the thesis, no corresponding kidney phenotype had been published. The primary finding in kidneys lacking Wnt5a was an altered basement membrane organization of the collecting ducts and glomeruli. The phenotype is most likely the reason behind morphological phenotypes which vary from bilateral kidney agenesis to duplex collecting system. Notably, during the course of this study we found a mutation in the human WNT5A gene of a CAKUT patient. This is the first time Wnts have been shown to organize kidney development via basement membrane formation. / Tiivistelmä Tämän väitöskirjan tarkoituksena on ollut tutkia munuaisen kehitystä ja kuinka kaksi Wnt-signalointireitin geeniä, signalointia estävä Dkk1 ja signalointia edistävä Wnt5a säätelevät sitä. Wnt ligandit ovat eritettäviä signaalimolekyylejä, jotka ovat osallisina monissa kehitysbiologissa prosesseissa kuten sukupuolen määräytymisessä ja munuaisen kehityksessä. Myös monissa taudeissa on havaittu muuntuneita Wnt geenien tuottotasoja. Wnt-geenit muodostava suuren signalointimolekyyliperheen, johon lukeutuu 19 jäsentä nisäkkäillä ja Wnt-signointi on jaettu perinteisesti kahteen signalointiryhmään. Dkk1 on kanonisen Wnt-signaloinnin estäjä ja Wnt5a:ta pidetään pääsaantiöisesti ei-kanonisena Wnt-ligandina. Väitöskirjassani olen tutkinut Dkk1 geenin toimintaa kohdennetussa Dkk1-poistogeenisessä hiiressä, jossa geenin toiminta on poistettu spesifisesti munuaisen kokoojaputkista. Dkk1:n puutos johtaa munuaisen papillan kasvuun ja lisää riskiä hydronefroksen muodostumiseen. Tutkimukset osoittivat että Dkk1:n puutos aiheuttaa lisääntynyttä solujakautumista kokoojaputkissa, jolloin Wnt-signaloinnin muutos aiheuttaa papillan ylikasvua. Ylikasvusta seuraa lisääntynyttä veden takaisin imeytymistä ja muutoksia ionien erittämisessä ja takaisin imeytymisessä. Todennäköisimmin muutokset johtuvat muuntuneesta Wnt7b signaloinnista, jota Dkk1 normaalisti säätelee. Väitöskirjan toisessa osassa tutkittiin ei-kanonisen reitin Wnt5a ligandin roolia munuaisen kehityksessä käyttäen poistogeenistä hiirimallia, jossa Wnt5a:n roolia munuaisenkehityksessä ei ollut julkaistu työn aloituksen aikaan. Wnt5a:n puutoksen havaittiin vaikuttavan tyvikalvon järjestymiseen kokoojaputkissa ja munuaiskeräsessä. Tyvikalvon häiriö on todennäköisin syy morfologisiin muutoksiin, jotka vaihtelevat molempien munuaisen puuttumisesta kaksois-kokoojatiehyen muodostumiseen. Työssä osoitetaan ensimmäistä kertaa kuinka Wnt-signalointireitin proteiinit säätelevät munuaisen kehitystä tyvikalvon muodostuksen kautta.