Carboxypeptidase Y (E.C. 3.4.12.1) was produced from Kluyveromyces fragilis ATCC 28244. The maximum growth and enzyme production were obtained during 24 hr of growth at the late logarithmic phase with optimized conditions (25$ sp circ $C, 300 rpm, pH 5) using YPD (1% yeast extract, 2% peptone, 2% dextrose, w/v) broth medium. A Fast Protein Liquid Chromatography (FPLC) was used for the enzyme purification. The enzyme was purified to 216 fold over the crude extract with a recovery of 18%. The apparent molecular weight of the purified enzyme was estimated to be 120 kDa on Native-PAGE and 56 kDa on SDS-PAGE suggesting that carboxypeptidase Y from Kluyveromyces fragilis consists of two subunits. The pH and temperature optima of the enzyme were pH 6.0 and 35$ sp circ$C, respectively. The enzyme activity was strongly inhibited by diisopropylphosphofluoridate (DIPF) and phenylmethylsulfonylfluoride (PMSF), and caused an average 50% loss of activity when incubated with various metal cations. / The apparent K$ sb{ rm m}$ and V$ sb{ rm max}$ values obtained for n-benzoyl-L-tyrosine-p-nitroanilide (BTPNA) and carboxybenzoxyphenylalanylalanine (Cbz-Phe-Ala) were 5.1 mM and 13.4 $ mu$mole/min/mg and 2.98 mM and 22.58 $ mu$mole/min/mg, respectively. Carboxypeptidase Y hydrolysis on the tryptic digests of $ alpha sb{ rm s1}$- and $ beta$-casein showed that the enzyme randomly removed five and three hydrophobic peptides, respectively and greatly reduced the size and heights of the other peptides analysed on Reversed Phase-High Performance Liquid Chromatography (RP-HPLC).

Tierärztl. Hochsch., Diss., 2004--Hannover.

Orientador: Jonas Contiero / Banca: Luis Henrique Souza Guimarães / Banca: Maria Antonia Pedrine Colabone Celligoi / Resumo: O interesse pela inulinase iniciou-se com a descoberta de sua habilidade de hidrolisar inulina, um polimero vegetal, em fmtose praticamente pura. A frutose é considerada uma alternativa segura como adoçante em relação à sacarose, sendo largamente utilizada na indústria de alimentos. As inulinases são geralmente tennoestáveis e comercialmente viáveis para aplicações industriais. Entretanto, uma produção contínua de frutose requer a utilização de uma inulinase imobilizada. Neste trabalho, o caldo fermentado, isento de células, de Kluyveromyces marxianus var. bulgaricus foi imobilizado em vários suportes: carvão ativado, diatomito, casca de ovo, amberlite, sílica de porosidade controlada e gelatina. A mais alta taxa de imobilização foi obtida em gelatina (82,60%). Os métodos restantes avaliados não foram bem sucedidos, seja pela ausência de ligação protéica ou perda de atividade provocados pelo processo de imobilização. O pH ótimo da inulinase imobilizada foi o mesmo da enzima livre (3,5). As temperaturas ótimas foram 55 °C para a enzima livre e 60 °C para a inulinase imobilizada. O gráfico de Arrhenius apresentou-se linear e as energias de ativação foram 56,20 KJ/mol.°K (enzima livre) e 20,27 KJ/mol.°K (enzima imobilizada). Os parâmetros cinéticos foram calculados pelo gráfico de LineweaverBurk e os valores de Km e Vmax foram de 20,68 mg/mL e 37,73 UA/mg para a enzima livre; e 50,05 mg/mL e 31,64 UA!mg para a enzima imobilizada, respectivamente. A estabilidade operacional da inulinase imobilizada foi avaliada em reator tubular de leito fixo, durante 782 horas, apresentando 58,12% de atividade enzimática residual. Foi realizada uma cromatografia de camada delgada para uma análise qualitativa dos produtos da reação / Abstract: The interest for inulinase began when it was discovered its ability to hydrolyse inulin, a vegetal polymer, in fructose practically pure. Fructose is considered as a safe altemative sweetener to sucrose, widely used in food industries. The inulinases are usually thermostable and cornmercially available for industrial applications. However, a continuous production of fructose requires the use of an immobilized inulinase. In this work, the crude enzyme broth free celis from Kluyveromyces marxianus var. bulgaricus was imrnobilized on various supports: activated carbon, diatomite, hen egg shell, amberlite, porous silica and gelatin. The highest irnrnobilization yield was obtained in gelatin (82,60%). The remaining methods screened were not successful either because no protem binding occurred or irnmobilization process resulted in activity loss. The optimum pH of immobilized inulinase remained the sarne as that of free enzyme (3,5). The optimum temperatures were 55 °C for free enzyrne and 60 °C for the imrnobilized inulmase. The Arrhenius plot were linear and activation energies were 56,20 KJ/mol.°K (Free enzyme) and 20,27 KJ/rnol.°K (Immobilized enzyme). The kinetic parameters were calculated from Lineweaver-Burk plots and the values of Km and Vmax were 20,68 mg/mL and 37,73 UA/rng for free inulinase; and 50,05 rng/rnL and 31,64 UA/rng for immobilized enzyme, respectively. The operational stability of the immobilized inulinase was studied in continuous fixed bed colurnn reactor for 782 hours with 58,12% of residual activity. Thin layer chromatography was used for qualitative analysis of the reaction products / Mestre

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O presente trabalho teve como principal objetivo avaliar o potencial de linhagens termotolerantes da espécie Kluyveromyces marxianus para produção de xilitol a partir do hidrolisado hemicelulósico de palha de arroz. Foi também objetivo deste trabalho estabelecer condições de tratamento alcalino diluído (desacetilação) previamente ao processo de hidrólise ácida da palha de arroz com vistas à obtenção de um hidrolisado com menor toxicidade. Numa primeira etapa do trabalho, foram avaliadas 4 cepas de K.marxianus (Y-6860, Y-6373, Y- 265 e Y-8287) quanto a produção de xilitol em meio semidefinido variando a temperatura de 30 a 40 °C. Com base nos resultados obtidos, foi selecionada a linhagem Y-6373, que apresentou os maiores valores de conversão de xilose em xilitol (YP/S = 0,70 g/g) e produtividade volumétrica (QP = 0,60 g/L.h) na temperatura de 40 °C. Esta linhagem foi então utilizada nos ensaios fermentativos a partir dos hidrolisados obtidos. Para obtenção do hidrolisado hemicelulósico, a palha de arroz foi primeiramente submetida a um tratamento alcalino, em escala de frascos Erlenmeyer, onde se avaliou o efeito da temperatura (50 - 70 °C) e da carga de NaOH (20 - 80 mg/g de biomassa) sobre a remoção de grupos acetil. De acordo com o modelo obtido, a máxima remoção de acetil (97,2 ± 3,4%) pôde ser alcançada empregando 70 °C; 80 mg de NaOH /g de palha por 45 min. Nestas condições do processo, o modelo previu remoções de lignina e de cinzas de 41,3 ± 4,3 e 62,3 ± 5,3%, respectivamente, sem perda significativa das frações açucaradas. Em maior escala (reator de 50L), o tratamento alcalino mostrou resultados de remoção de acetil próximos aos previstos pelo modelo. Com a palha desacetilada, foram então realizados ensaios de hidrólise ácida variando a concentração de H2SO4 (0,5 - 1,5% m/v) e tempo de residência (30 - 90 min) visando estabelecer as condições que maximizem a eficiência de hidrólise da hemicelulose (EHH). Nas condições otimizadas, (H2SO4 1,0% m/v e 85 minutos) foi alcançada uma EHH de 75% em frascos e de 76% em reator. Os resultados referentes à fermentabilidade do hidrolisado empregando a K. marxinuas Y-6373 demonstraram que independentemente da suplementação nutricional, a conversão de xilose em xilitol foi elevada ~ 0,87 g/g e superior a obtida em meio semidefinido contendo apenas xilose como fonte de carbono, porém os valores de produtividade volumétrica foram cerca de 6,5 vezes inferiores ~ 0,13 g/L.h, devido a baixa eficiência de utilização da xilose (XC) ~ 20%, após 72 h de cultivo. A fermentabilidade dos hidrolisados foi melhorada após o procedimento de destoxificação e os resultados variaram com o método empregado. Os melhores resultados foram obtidos em hidrolisado tratado com CaO (YP/S= 0,74 g/g; QP = 0,32 g/L.h e XC =92%). Neste trabalho, foi também demonstrado o efeito repressivo da glicose sobre a assimilação e conversão da xilose em xilitol por K. marxianus, uma vez que em meio semidefinido simulando as concentrações de xilose e glicose presentes no hidrolisado, os valores de XC e YP/S foram reduzidos em torno de 40%. De uma forma geral, conclui-se que a linhagem de K. marxianus selecionada neste estudo, apresenta grande potencial para a produção de xilitol em elevadas temperaturas, porém são ainda necessários estudos para otimizar as condições de produção de xilitol a partir de hidrolisados hemicelulósicos. / In this work the potential of thermotolerant strains of Kluyveromyces marxianus to produce xylitol from rice straw hemicellulosic hydrolyzed was evaluated. In addition, were also established conditions of diluted alkaline treatment (deacetylation) previously to the process of rice straw acid hydrolysis, aiming to decrease the toxicity of the hydrolysate . Initially, four yeast strains of K.marxianus (Y-6860, Y-6373, Y-2265 e Y-8287) were evaluated regarding to the xylitol production in a semi-defined medium, varying the temperature from 30 to 40 ºC. From these results, the strain Y-6373 was selected, due to high values of xylose conversion into xylitol (YP/S = 0.70 g/g) and volumetric productivity (QP = 0.60 g/L.h) at 40ºC. This strain was thus used in the fermentative tests employing the hemicellulosic hydrolysate obtained. The hemicellulosic hydrolysate of rice straw was prepared in two steps; firstly the rice straw was submitted to the alkaline treatment, which was carried out in Erlenmeyer flasks scale. In these experiments, the effects of temperature from 50 to 70 °C and NaOH load from 20 to 80 mg/g biomass on the removal of acetyl groups were evaluated. According to the model obtained, the maximum acetyl removal (97.2 ±3.4%) could be achieved by employing 70 ºC; 80 mg of NaOH/g of straw during 45 minutes. Under these conditions, the model predicted lignin and ashes removals of 41.3±4.3 and 62.3±5.3%, respectively, without significant loss of sugars. On a large scale (reactor of 50L), the alkaline treatment showed outcomes of acetyl removal near the ones predicted by the model. After, the deacetylating straw was submitted to acid hydrolysis process, varying the H2SO4 concentration from 0.5 to 1.5% w/v, and the residence time from 30 to 90 minutes, aiming to stablish the conditions that maximize the efficiency of hemicellulose hydrolysis (EHH). Under optimized conditions, (H2SO4 1.0% w/v and 85 minutes) 75% EHH was achieved in Erlenmeyers flasks and 76% in reactor. As regarding the hydrolysate fermentability employing K. marxinuas Y-6373, the results showed that, regardless of the nutritional supplementation, the conversion of xylose into xylitol was high ~ 0.87 g/g and superior in relation to the one obtained at a semidefined medium containing only xylose as a carbon source. Nevertheless, the values ofvolumetric productivity were approximately 6.5 times inferior ~ 0.13 g/L.h, due to the lowefficiency of xylose consumption (XC) ~ 20%, after 72h of cultivation. The hydrolysate fermentability was improved after detoxification and the results varied with the method employed. The best results were obtained on hydrolysate treated with CaO (YP/S= 0.74 g/g; QP = 0.32 g/L.h and XC = 92%). The glucose effect was further examined in semi-defined medium. The results showed that xylose assimilation and xylitol production by K. marxianus was repressed by glucose, since in a semi-defined media simulating the concentrations of xylose/glucose found in the hydrolyzed, the values of XC e YP/S were reduced in approximately 40%. Based on the results, was concluded that the strain of K. marxianus selected on this study, presents a great potential to produce xylitol at elevated temperatures. However, studies are still necessary to optimize the conditions of this bioconversion from the hemicellulosic hydrolysate.

O presente trabalho teve como principal objetivo estudar o desempenho fermentativo da levedura Kluyveromyces marxianus NRRL Y-6860 em meio semissintético, contendo glicose como fonte de carbono. Numa primeira etapa, avaliou-se o efeito de diferentes temperaturas (35, 40, 43 e 45ºC), assim como o efeito inibitório do etanol adicionado ao meio (0, 15, 30, 45, 60g/L) sobre os parâmetros do bioprocesso. A partir da temperatura de cultivo selecionada foi então avaliado o efeito da suplementação nutricional e da concentração de inóculo sobre o perfil fermentativo desta linhagem. Os ensaios foram realizados em frascos Erlenmeyer de 125 mL, contendo 50 mL de meio, 120 g/L de glicose, agitados a 100 rpm. Dentre as temperaturas avaliadas, os melhores resultados (consumo de 70% de glicose, produção de etanol de 38 g/L) foram obtidos a 43ºC, o que correspondeu a uma produtividade volumétrica em etanol (QP) de 3,2 g/L. h e eficiência de 80%. Nesta temperatura, os resultados da adição de etanol em diferentes concentraçõe sno inídio da fermentação revelaram qu eo aumento na concentração do álcool afetou negativamente a fermentabilidade de K. marxianus, constatando-se completa inibição quando foi adicionado 45 g/L de etanol. Posteriormente, avaliou-se o efeito dos nutrientes (KH2PO4 de 0,5 a 1,5 g/L; (NH4)2SO4 de 1,0 a 3,0 g/L; MgSO4 de 0,1 a 0,5 g/L e extrato de levedura de 3,0 a 7,0 g/L) e da concentração inicial de células (de 1,0 a 5,0 g/L) sobre a produção de etanol pela levedura. Os ensaios foram realizados de acordo com um planejamento fatorial fracionado 25-1, visando identificar e quantificar o efeito individual das variáveis experimentais e de suas interações sobre o bioprocesso, sendo avaliadas as respostas: máxima concentração de etanol e glicose consumida. Os resultados da análise estatística mostraram que a concentração inicial de células exerceu um efeito positivo sobre ambas as respostas, já o extrato de levedura apresentou um efeito negativo, enquanto que o KH2PO4 proporcionou um efeito positivo somente sobre a concentração máxima de etanol, ao nível de 90% de confiança. A análise estatística também revelou que os efeitos de interação entre as variáveis não foram significativas. Com base nestes resultados, concluiu-se que o desempenho fermentativo de K. marxianus NRRL Y-6860, a 43ºC, foi favorecido após estudo da composição nutricional e da concentração de inóculo, com aumento de 19, 24, 25 e 16% sobre o consumo de glicose, produção de etanol, QP e eficiência do processo, respectivamente, quando comparados aos resultados obtidos na primeira etapa do trabalho. Além disso, com os ensaios do planejamento foi possível reduzir o nível de (NH4)2SO4, MgSO4 e extrato de levedura. / In the present work the fermentation perfomance of the yeast Kluyveromyces marxianus NRRL Y-6860 in semi-synthetic medium containing glucose as carbon source was investigated. Initially, it was assessed the effect of different temperatures (35, 40, 43 and 45ºC) and the degree of ethanol toxicity (0, 15, 30, 45, 60 g/L) on the bioprocess parameters. From the selected temperature, it was then evaluated the effect of nutritional supplementation and inoculum concentration on the fermentation profile of this yeast. Fermentations assays were conducted in 125 mL Erlenmeyer flasks containing 50 mL of medium, 120 g/L glucose, at 100 rpm agitation speed. Among all temperatures evaluated the best results (70% consumption of glucose, 40 g/L of ethanol) were obtained at 43ºC, corresponding to volumetric ethanol productivity (QP) of 3.2 g/L.h and 80% efficiency. The results of ethanol toxicity in the fermentation at 43ºC, showed that increasing alcohol concentration decreased the fermentability of K. marxianus, being observed a complete inhibitiion when 45 g/L of ethanol was added in the medium. Afterward, the effect of nutrients (KH2PO4 0.5 to 1.5 g/L, (NH4)2SO4 from 1.0 to 3.0 g/L, MgSO4 from 0.1 to 0.5 g/L yeast extract and 3.0 to 7.0 g/L) and the initial concentration of cells (1.0 to 5.0 g/L) on the ethanol production by K. marxianus was investigated. The assays were perfomed according to a fractional factorial design 25-1, to identify and quantify the individual variables effects and their interactions on the bioprocess. The satistical analysis results showed that the initial cell concentrations ahd a positive effect on maximum ethanol concentration and consumed glucose. On the other hand, yeast extract had negative effect, while KH2PO4 concentration provided a positive effect only on the ethanol maximum concentration, at 90% confidence level. Statistical analysis also revealed that the interaction effects between variables were not significant. Based on these results, it was concluded the fermentation perfomance of K. marxianus NRRL Y-6860, at 43ºC, was favored after study the nutritional composition and inoculum concentration, since increased 19, 24, 25 and 16% of glucose consumption, ethanol production, QP and process efficiency, respectively, when compared to results obtained in the first phase of the present work. Furthermore, with the experimental design was possible to reduce th elevel of (NH4)2SO4, MgSO4 and yeast extract.

O presente trabalho teve como principal objetivo estudar o desempenho fermentativo da levedura Kluyveromyces marxianus NRRL Y-6860 em meio semissintético, contendo glicose como fonte de carbono. Numa primeira etapa, avaliou-se o efeito de diferentes temperaturas (35, 40, 43 e 45ºC), assim como o efeito inibitório do etanol adicionado ao meio (0, 15, 30, 45, 60g/L) sobre os parâmetros do bioprocesso. A partir da temperatura de cultivo selecionada foi então avaliado o efeito da suplementação nutricional e da concentração de inóculo sobre o perfil fermentativo desta linhagem. Os ensaios foram realizados em frascos Erlenmeyer de 125 mL, contendo 50 mL de meio, 120 g/L de glicose, agitados a 100 rpm. Dentre as temperaturas avaliadas, os melhores resultados (consumo de 70% de glicose, produção de etanol de 38 g/L) foram obtidos a 43ºC, o que correspondeu a uma produtividade volumétrica em etanol (QP) de 3,2 g/L. h e eficiência de 80%. Nesta temperatura, os resultados da adição de etanol em diferentes concentraçõe sno inídio da fermentação revelaram qu eo aumento na concentração do álcool afetou negativamente a fermentabilidade de K. marxianus, constatando-se completa inibição quando foi adicionado 45 g/L de etanol. Posteriormente, avaliou-se o efeito dos nutrientes (KH2PO4 de 0,5 a 1,5 g/L; (NH4)2SO4 de 1,0 a 3,0 g/L; MgSO4 de 0,1 a 0,5 g/L e extrato de levedura de 3,0 a 7,0 g/L) e da concentração inicial de células (de 1,0 a 5,0 g/L) sobre a produção de etanol pela levedura. Os ensaios foram realizados de acordo com um planejamento fatorial fracionado 25-1, visando identificar e quantificar o efeito individual das variáveis experimentais e de suas interações sobre o bioprocesso, sendo avaliadas as respostas: máxima concentração de etanol e glicose consumida. Os resultados da análise estatística mostraram que a concentração inicial de células exerceu um efeito positivo sobre ambas as respostas, já o extrato de levedura apresentou um efeito negativo, enquanto que o KH2PO4 proporcionou um efeito positivo somente sobre a concentração máxima de etanol, ao nível de 90% de confiança. A análise estatística também revelou que os efeitos de interação entre as variáveis não foram significativas. Com base nestes resultados, concluiu-se que o desempenho fermentativo de K. marxianus NRRL Y-6860, a 43ºC, foi favorecido após estudo da composição nutricional e da concentração de inóculo, com aumento de 19, 24, 25 e 16% sobre o consumo de glicose, produção de etanol, QP e eficiência do processo, respectivamente, quando comparados aos resultados obtidos na primeira etapa do trabalho. Além disso, com os ensaios do planejamento foi possível reduzir o nível de (NH4)2SO4, MgSO4 e extrato de levedura. / In the present work the fermentation perfomance of the yeast Kluyveromyces marxianus NRRL Y-6860 in semi-synthetic medium containing glucose as carbon source was investigated. Initially, it was assessed the effect of different temperatures (35, 40, 43 and 45ºC) and the degree of ethanol toxicity (0, 15, 30, 45, 60 g/L) on the bioprocess parameters. From the selected temperature, it was then evaluated the effect of nutritional supplementation and inoculum concentration on the fermentation profile of this yeast. Fermentations assays were conducted in 125 mL Erlenmeyer flasks containing 50 mL of medium, 120 g/L glucose, at 100 rpm agitation speed. Among all temperatures evaluated the best results (70% consumption of glucose, 40 g/L of ethanol) were obtained at 43ºC, corresponding to volumetric ethanol productivity (QP) of 3.2 g/L.h and 80% efficiency. The results of ethanol toxicity in the fermentation at 43ºC, showed that increasing alcohol concentration decreased the fermentability of K. marxianus, being observed a complete inhibitiion when 45 g/L of ethanol was added in the medium. Afterward, the effect of nutrients (KH2PO4 0.5 to 1.5 g/L, (NH4)2SO4 from 1.0 to 3.0 g/L, MgSO4 from 0.1 to 0.5 g/L yeast extract and 3.0 to 7.0 g/L) and the initial concentration of cells (1.0 to 5.0 g/L) on the ethanol production by K. marxianus was investigated. The assays were perfomed according to a fractional factorial design 25-1, to identify and quantify the individual variables effects and their interactions on the bioprocess. The satistical analysis results showed that the initial cell concentrations ahd a positive effect on maximum ethanol concentration and consumed glucose. On the other hand, yeast extract had negative effect, while KH2PO4 concentration provided a positive effect only on the ethanol maximum concentration, at 90% confidence level. Statistical analysis also revealed that the interaction effects between variables were not significant. Based on these results, it was concluded the fermentation perfomance of K. marxianus NRRL Y-6860, at 43ºC, was favored after study the nutritional composition and inoculum concentration, since increased 19, 24, 25 and 16% of glucose consumption, ethanol production, QP and process efficiency, respectively, when compared to results obtained in the first phase of the present work. Furthermore, with the experimental design was possible to reduce th elevel of (NH4)2SO4, MgSO4 and yeast extract.

O presente trabalho teve como principal objetivo selecionar uma linhagem termotolerante de Kluyveromyces marxianus e avaliar a sua aplicação em processos de produção de etanol a partir da celulignina de palha de arroz. Inicialmente, foram avaliadas oito diferentes linhagens de K. marxianus em meio semissintético contendo 50 g/L de glicose sob temperatura de 45 °C. De acordo com os principais parâmetros fermentativos obtidos, a linhagem K. marxianus NRRL Y-6860 foi selecionada e o efeito da oxigenação do meio sobre os parâmetros fermentativos desta levedura foi realizado de acordo com um planejamento experimental 22. Os resultados revelaram que a produção de etanol foi favorecida nas menores condições de agitação e aeração estudadas (100 rpm e relação Vfrasco/Vmeio de 2,5) sendo obtido um valor de conversão de glicose em etanol (YP/S) de 0,44 g/g e produtividade volumétrica em etanol (QP) de 3,63 g/L.h. Nestas condições, K. marxianus NRRL Y-6860 foi também capaz de fermentar elevada concentração de glicose (112 g/L), apresentando valores de YP/S = 0,42 g/g e QP = 3,24 g/L.h. Numa segunda etapa, ensaios de sacarificação da celulignina (8% m/v) permitiram definir a carga de Cellubrix (25 FPU/g) e Novozyme 188 (25 UI/g) as quais promoveram um rendimento de hidrólise de aproximadamente 50 % em 12 horas. A celulignina foi obtida após o pré-tratamento da palha de arroz com H2SO4 diluído e apresentou a seguinte composição (g/100g de matéria seca): celulose (54,9), hemicelulose (7,9), lignina (24,9) e cinzas (8,0). Para os ensaios de sacarificação e fermentação da celulignina com a levedura K. marxianus NRRL Y-6860 duas estratégias foram avaliadas: 1) sacarificação e fermentação em separado (SHF), com e sem inativação das enzimas e 2) sacarificação e fermentação simultânea (SSF) em que o inóculo e as enzimas foram adicionados no início do processo. Os resultados revelaram que na estratégia SHF a inativação das enzimas antes da inoculação não influenciou o desempenho fermentativo da levedura. Além disso, o emprego de um maior teor de celulignina (12 % m/v) proporcionou um ganho de 42 % na produtividade total do processo (QPT) em relação ao teor de 8 % (m/v), atingindo o valor de 0,97 g/L.h. O emprego da estratégia SSF a partir de 8 % (m/v) de celulignina permitiu um incremento de 177 % e 287 % nos valores de QPT quando comparados ao processo SHF com 12 e 8 % de celulignina (m/v), respectivamente. Ensaios de SSF com Saccharomyces cerevisiae mostraram que para ambas as temperaturas avaliadas (30 °C ou 45 °C) a termotolerante K. marxianus NRRL Y-6860 mostrou-se superior com relação a produtividade total do processo. Com os resultados do presente trabalho pode-se concluir que a levedura termotolerante K. marxianus NRRL Y-6860 é um micro-organismo em potencial para produção de etanol celulósico a partir da estratégia SSF devido aos elevados valores de produtividade volumétrica (QPT = 2,69 g/L.h) obtidos a partir da celulignina de palha de arroz. / This work aimed to select a thermotolerant strain of Kluyveromyces marxianus and evaluate its application on ethanol production by using rice straw cellulignin. Initially, were evaluated eight different strains of K. marxianus on semi-synthetic media containing 50 g/L of glucose at 45 °C. According to the main fermentation parameters, the strain K. marxianus NRRL Y-6860 was selected and the effect of oxygenation on ethanol production by this yeast was investigated through a 22 factorial design. The best results of ethanol yield factor (YP/S = 0.44 g/g) and ethanol volumetric productivity (QP = 3.63 g/L.h) were found at the lowest agitation and aeration conditions (100 rpm and 2.5 Vflask/Vmedium ratio) employed. Under this conditions, K. marxianus NRRL Y-6860 was also able to ferment at high glucose concentration (112 g/L), with values of YP/S = 0.42 g/g and QP = 3.24 g/L.h. In a second step, the effect of Cellubrix loading and its supplementation with Novozyme 188 on the cellulignin saccharification were evaluated. The results showed that the highest hydrolysis yield (50 %) was attained when a load of Cellubrix (25 FPU/g dry matter) and Novozyme 188 (25 IU/g dry matter) was used. The cellulignin obtained from dilute sulfuric acid pretreatment of rice straw showed the following composition (g/100g dry matter): cellulose (54.9), hemicellulose (7.9), lignin (24.9) and ash (8.0). For the studies of cellulignin saccharification and fermentation with K. marxianus NRRL Y-6860 two strategies were evaluated: 1) Separate Hydrolysis and Fermentation (SHF), with and without inactivation of enzymes, which inoculum was added after the hydrolysis step and 2) Simultaneous Saccharification and Fermentation (SSF), which inoculum and enzymes were added at the beginning of the process. The results revealed that the enzyme inactivation step prior to inoculation in SHF did not influence the yeast\'s fermentation performance. In addition, the use of a higher loading of cellulignin (12 % w/v) increased the overall ethanol productivity (QPT) in 42 %, reaching a value of 0.97 g/L.h as compared to the loading of 8 % (w/v). The SSF process from 8 % (w/v) of cellulignin increased the values of QPT in 177 % and 287 % when compared to SHF loading of 12 and 8 % (w/v), respectively. By using Saccharomyces cerevisiae in SSF process under different temperatures (30 °C or 45 °C) the overall ethanol productivity was lower in relation with the thermotolerant K. marxianus NRRL Y-6860. Based on the experimental results of this work, it can be concluded that K. marxianus NRRL Y-6860 herein selected represents a potential microorganism to application on ethanol production from lignocellulosic materials in SSF process due to its high fermentative potential at elevated temperatures.

O presente trabalho teve como principal objetivo selecionar uma linhagem termotolerante de Kluyveromyces marxianus e avaliar a sua aplicação em processos de produção de etanol a partir da celulignina de palha de arroz. Inicialmente, foram avaliadas oito diferentes linhagens de K. marxianus em meio semissintético contendo 50 g/L de glicose sob temperatura de 45 °C. De acordo com os principais parâmetros fermentativos obtidos, a linhagem K. marxianus NRRL Y-6860 foi selecionada e o efeito da oxigenação do meio sobre os parâmetros fermentativos desta levedura foi realizado de acordo com um planejamento experimental 22. Os resultados revelaram que a produção de etanol foi favorecida nas menores condições de agitação e aeração estudadas (100 rpm e relação Vfrasco/Vmeio de 2,5) sendo obtido um valor de conversão de glicose em etanol (YP/S) de 0,44 g/g e produtividade volumétrica em etanol (QP) de 3,63 g/L.h. Nestas condições, K. marxianus NRRL Y-6860 foi também capaz de fermentar elevada concentração de glicose (112 g/L), apresentando valores de YP/S = 0,42 g/g e QP = 3,24 g/L.h. Numa segunda etapa, ensaios de sacarificação da celulignina (8% m/v) permitiram definir a carga de Cellubrix (25 FPU/g) e Novozyme 188 (25 UI/g) as quais promoveram um rendimento de hidrólise de aproximadamente 50 % em 12 horas. A celulignina foi obtida após o pré-tratamento da palha de arroz com H2SO4 diluído e apresentou a seguinte composição (g/100g de matéria seca): celulose (54,9), hemicelulose (7,9), lignina (24,9) e cinzas (8,0). Para os ensaios de sacarificação e fermentação da celulignina com a levedura K. marxianus NRRL Y-6860 duas estratégias foram avaliadas: 1) sacarificação e fermentação em separado (SHF), com e sem inativação das enzimas e 2) sacarificação e fermentação simultânea (SSF) em que o inóculo e as enzimas foram adicionados no início do processo. Os resultados revelaram que na estratégia SHF a inativação das enzimas antes da inoculação não influenciou o desempenho fermentativo da levedura. Além disso, o emprego de um maior teor de celulignina (12 % m/v) proporcionou um ganho de 42 % na produtividade total do processo (QPT) em relação ao teor de 8 % (m/v), atingindo o valor de 0,97 g/L.h. O emprego da estratégia SSF a partir de 8 % (m/v) de celulignina permitiu um incremento de 177 % e 287 % nos valores de QPT quando comparados ao processo SHF com 12 e 8 % de celulignina (m/v), respectivamente. Ensaios de SSF com Saccharomyces cerevisiae mostraram que para ambas as temperaturas avaliadas (30 °C ou 45 °C) a termotolerante K. marxianus NRRL Y-6860 mostrou-se superior com relação a produtividade total do processo. Com os resultados do presente trabalho pode-se concluir que a levedura termotolerante K. marxianus NRRL Y-6860 é um micro-organismo em potencial para produção de etanol celulósico a partir da estratégia SSF devido aos elevados valores de produtividade volumétrica (QPT = 2,69 g/L.h) obtidos a partir da celulignina de palha de arroz. / This work aimed to select a thermotolerant strain of Kluyveromyces marxianus and evaluate its application on ethanol production by using rice straw cellulignin. Initially, were evaluated eight different strains of K. marxianus on semi-synthetic media containing 50 g/L of glucose at 45 °C. According to the main fermentation parameters, the strain K. marxianus NRRL Y-6860 was selected and the effect of oxygenation on ethanol production by this yeast was investigated through a 22 factorial design. The best results of ethanol yield factor (YP/S = 0.44 g/g) and ethanol volumetric productivity (QP = 3.63 g/L.h) were found at the lowest agitation and aeration conditions (100 rpm and 2.5 Vflask/Vmedium ratio) employed. Under this conditions, K. marxianus NRRL Y-6860 was also able to ferment at high glucose concentration (112 g/L), with values of YP/S = 0.42 g/g and QP = 3.24 g/L.h. In a second step, the effect of Cellubrix loading and its supplementation with Novozyme 188 on the cellulignin saccharification were evaluated. The results showed that the highest hydrolysis yield (50 %) was attained when a load of Cellubrix (25 FPU/g dry matter) and Novozyme 188 (25 IU/g dry matter) was used. The cellulignin obtained from dilute sulfuric acid pretreatment of rice straw showed the following composition (g/100g dry matter): cellulose (54.9), hemicellulose (7.9), lignin (24.9) and ash (8.0). For the studies of cellulignin saccharification and fermentation with K. marxianus NRRL Y-6860 two strategies were evaluated: 1) Separate Hydrolysis and Fermentation (SHF), with and without inactivation of enzymes, which inoculum was added after the hydrolysis step and 2) Simultaneous Saccharification and Fermentation (SSF), which inoculum and enzymes were added at the beginning of the process. The results revealed that the enzyme inactivation step prior to inoculation in SHF did not influence the yeast\'s fermentation performance. In addition, the use of a higher loading of cellulignin (12 % w/v) increased the overall ethanol productivity (QPT) in 42 %, reaching a value of 0.97 g/L.h as compared to the loading of 8 % (w/v). The SSF process from 8 % (w/v) of cellulignin increased the values of QPT in 177 % and 287 % when compared to SHF loading of 12 and 8 % (w/v), respectively. By using Saccharomyces cerevisiae in SSF process under different temperatures (30 °C or 45 °C) the overall ethanol productivity was lower in relation with the thermotolerant K. marxianus NRRL Y-6860. Based on the experimental results of this work, it can be concluded that K. marxianus NRRL Y-6860 herein selected represents a potential microorganism to application on ethanol production from lignocellulosic materials in SSF process due to its high fermentative potential at elevated temperatures.