Würzburg, Univ., Diss., 2008. / Zsfassung in dt. Sprache.

Les phosphoinositides (PI) sont impliqués dans de nombreux processus biologiques cellulaires, tels que la régulation du cytosquelette d'actine, le trafic vésiculaire membranaire et les voies de signalisation médiées par des récepteurs membranaires. Le métabolisme des phosphoinositides est un processus hautement régulé par un ensemble de PI-kinases et PI-phosphatases. Des mutations dans ces enzymes sont associées à des maladies tels que le syndrome de Lowe, le diabète de type 2, les désordres bipolaires et le cancer. SHIP2 (SH2 domain-containing inositol polyphosphate 5-phosphatase type 2) est une PtdIns(3,4,5)P3 5-phosphatase qui est impliquée dans le métabolisme du glucose par son action régulatrice sur la cascade de signalisation de l’insuline, ainsi que dans le contrôle de l’obésité induite par un régime riche en graisses. Au cours de ce travail, nous avons généré des souris permettant une inactivation conditionnelle de cette enzyme. A l’aide de ce nouvel outil nous avons pu confirmer le rôle physiologique de SHIP2 dans le contrôle du métabolisme du glucose, ainsi que l’effet bénéfique de son inactivation sur la prise de poids sous régime riche en graisses. Nos résultats montrent également que l’inactivation spécifique de SHIP2 dans les neurones n’entraîne pas de résistance à l’obésité sous régime riche en graisses, et que son inactivation spécifiquement dans les cellules  du pancréas conduit à une légère augmentation de la sécrétion d’insuline en réponse au glucose. Par ailleurs, nous avons aussi généré des souris invalidées pour deux autres 5-phosphatases de phosphoinositides dont le rôle in vivo n’était pas encore élucidé: INPP5E (Inositol polyphosphate 5-phosphatase E) et PIPP (Proline-rich inositol polyphosphate 5-phosphatase). Alors que les souris invalidées pour PIPP sont viables et ne présentent pas d’anomalies apparentes, l’invalidation totale d’INPP5E conduit à une mortalité embryonnaire ou périnatale. Cette mortalité est associée au développement de nombreuses anomalies caractéristiques de ciliopathies, tels que des kystes rénaux, des anomalies cérébrales et des défauts squelettiques. Ensembles, nos résultats indiquent qu’INPP5E joue un rôle dans la stabilité du cil primaire, une organelle émergeant du côté apical de certains types cellulaires, qui joue un rôle essentiel dans l’initiation de différentes voies de signalisation. L’invalidation inductible d’INPP5E chez la souris adulte a conduit au développement d’un phénotype similaire à celui des modèles murins du syndrome de Bardet-Biedl (BBS), une ciliopathie humaine caractérisée notamment par la présence d’une obésité et d’une dystrophie rétinienne. Finalement, nous avons participé à l’étude de mutations dans le gène INPP5E humain, qui ont été identifiés chez des patients atteints de ciliopathies comme le syndrome MORM (Mental Retardation, Truncal Obesity, Retinal Degeneration and Micropenis) et le syndrome de Joubert.

University, Diss., 2005--Würzburg.

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Programmed cell death (PCD) is a highly evolved mechanism of cellular suicide that is aberrantly activated following neural injury. Two fundamental PCD signaling pathways termed the extrinsic (caspase-8-mediated) and intrinsic (caspase-9-mediated) pathways, have been described. While each pathway is initiated by distinct cellular stimuli, both pathways culminate in the activation of downstream executioner caspases. Previous efforts to isolate the in vivo contribution of each pathway have been hindered by the embryonic lethality of casp8 and casp9 null mice. In the present study, I overcame this obstacle to directly assess the contribution of each pathway following two well-characterized forms of acute neural injury; excitotoxic destruction of CA1 pyramidal neurons, and the loss of motor neurons following facial nerve transection. To determine the role of caspase-8, I constructed several lines of mice in which caspase-8 was conditionally ablated within the relevant neuronal populations. The results obtained from these animals definitively demonstrate that caspase-8 is not required by either motor neurons or CA1 pyramidal neurons to undergo PCD following injury. Therefore, these findings have provided the first direct experimental evidence to counter the widely held dogma of caspase-8 as the central effector of death receptor-mediated signaling within neurons. With respect to the intrinsic pathway, several lines of evidence suggest that the apoptosome predominantly regulates the death of motor neurons. I tested this hypothesis by performing facial axotomies in mice containing a point mutation introduced (“knocked in”) into the genomic locus of cytochrome c which abolishes its ability to activate the intrinsic pathway. Homozygous cytochrome c knock-in mice displayed a significant enhancement in motor neuron survival in comparison to control littermates following injury. However, the level of motor neuron protection differed from that previously reported in mice either overexpressing anti-apoptotic or lacking pro-apoptotic members of the Bcl-2 family. Therefore, the results of this study directly demonstrate the influence of the apoptosome on injury-induced neuronal PCD isolated from upstream Bcl-2 family-mediated effects. In addition, my results have provided the first evidence that activation of the apoptosome is required for the release of apoptosis inducing factor (AIF) from the mitochondria of injured motor neurons in vivo.

One of the many recorded adaptive responses in respiratory chain complex I deficient cells is the over-expression of the small metal binding proteins, metallothioneins (MTs). The antioxidant properties of MTs putatively protect the deficient cells against oxidative damage, thus limiting further damage and impairment of enzymes involved in energy production. Moreover, the role of metallothioneins in supplying metal cofactors to enzymes and transcription factors in order to promote energy metabolism was previously proposed, which could accompany their role as antioxidants. This view is supported by the observations that MT knockout mice tend to become moderately obese, implying a lower energy metabolic rate. Hence, the involvement of metallothioneins in mitochondrial function and disease cannot be ignored. However, this association is still very vague due to the diversity of their functions and the complexity of the mitochondrion. The use of systems biology technology and more specifically metabolomics technology was thus employed to clarify this association by investigating the metabolic differences between wild type and MT knockout mice in unchallenged conditions as well as when mitochondrial function (energy metabolism) was challenged with exercise and/or a high-fat diet. The metabolic differences between these mice were also studied when complex I of the respiratory chain was inhibited with rotenone. The metabolome content of different tissues and bio-fluids were examined in an untargeted fashion using three standardized analytical platforms and the data mined using modern metabolomics and related statistical methods. Clear metabolic differences were found between the wild type and MT knockout mice during unchallenged conditions. These metabolic differences were persisted and were often amplified when mitochondrial metabolism was specifically challenged through exercise, high-fat intake or complex I inhibition. The data pointed to an overall reduced metabolic rate in the MT knockout mice and possible insulin resistance after the interventions which imply (and confirm) the involvement of MTs in promoting energy metabolism in the wild type mice. / Thesis (Ph.D. (Biochemistry))--North-West University, Potchefstroom Campus, 2012

LINC, the human homologue of an evolutionary conserved complex, regulates the transcription of a set of genes essential during the G2/M transition (Osterloh et al., 2007; Schmit et al., 2007). One component of the LINC core module is LIN-9. LIN-9 is essential for the transcriptional activation of LINC target genes and also promotes differentiation in association with pRB (Gagrica et al., 2004). However, nothing is known about its function in vivo. Histological and molecular analysis revealed that Lin9 is ubiquitously expressed throughout embryonic development and in all examined adult organs. Additionally, Lin9 mRNA is expressed in ES cells and blastocysts. Moreover the analogous distribution of the other LINC components suggested that they all function in the same cells and most likely in the same pathway. To deeper investigate the role of LIN9 in cell cycle and differentiation in vivo, a Lin9 gene trap mouse model (GT) was successfully generated and examined. Heterozygouse Lin9GT/+ mice were inconspicuous and develop normally. However, homozygouse knockout embryos were never obtained. The Lin9GT/GT embryos die at peri-implantation, probably due to a defect in the development of the epiblast, which could be shown with in situ hybridization with specific lineage markers. In vitro, the ICM of Lin9-deficient blastocysts did not develop properly. These data suggest that the loss of Lin9 leads to embryonic lethality at peri-implantation, and indicates that LIN9 is required for proper formation of the epiblast. In parallel, the first conditional Lin9 mouse model based on the Cre-loxP technology was generated. The Lin9fl/fl allele can be deleted by Cre-recombinase, in vivo and in vitro. Therefore an inducible system with Lin9fl/fl mice harboring Cre-ERT2 was established. The MEFs generated from these transgenic mice carried a nearly complete knockout upon induction with tamoxifen. Deletion of LIN9 in MEFs had a major impact upon the cell cycle and growth rates. Specifically, they arrested in G2/M phase and stopped to proliferate. Taken together, I was able to generate a lin9 gene trap and a lin9 conditional knockout mouse model. All results obtained so far demonstrate, that Lin9 is an essential gene for embryonic development and cell cycle control. It will be of great interest to further investigate Lin9-deficiency to gain insights into the mechanism of cell cycle control in early embryonic development and cell differentiation. / LINC, das humane Homolog eines evolutionär konservierten Komplexes, reguliert die Transkription von Genen, die essentiell für die G2/M Transition sind (Osterloh et al., 2007; Schmit et al., 2007). Eine Komponente des LINC Komplexes ist LIN-9. LIN-9 ist für die transkriptionelle Aktivierung LINC spezifischer Zielgene essentiell und kann, in Assoziation mit pRB, die Differenzierung humaner Zellen fördern (Gagrica et al., 2004). Bisher ist jedoch nichts über die in vivo Funktion LIN9s bekannt. Histologische und molekulare Analysen der Maus machen deutlich, dass Lin9 während der embryonalen Entwicklung und in allen untersuchten adulten Organen ubiquitär exprimiert wird. Zusätzlich wird Lin9 mRNA in ES Zellen und in Blastocysten exprimiert. Außerdem legt die analoge Verteilung anderer LINC Komponenten nahe, dass sie sehr wahrscheinlich gemeinsam in den gleichen Zellen und Signalwegen agieren. Um die Funktion des LIN9 Proteins im Zellzyklus und der Differenzierung in vivo genauer zu erforschen, wurde ein Lin9 „Gene Trap“ Maus Modell (GT) generiert und untersucht. Heterozygote Lin9GT/+ Mäuse sind unauffällig und entwickeln sich normal. Allerdings wurden keine Lin9 knockout Embryonen erhalten. Lin9GT/GT Embryonen sterben in der peri-Implantationsphase, vermutlich auf Grund eines Entwicklungsdefekts des Epiblasten, was mit in situ Hybridisierung von Abstammungslinien spezifischen Markern gezeigt werden konnte. Die ICM Lin9 defizienter Blastocysten entwickelte sich in vitro nicht richtig. Diese Daten machen deutlich, dass der Verlust von Lin9 zu embryonaler Letalität im Peri-Implantations-stadium führt, und zeigt dass Lin9 für die richtige Ausbildung des Epiblasten benötigt wird. Gleichzeitig wurde das erste konditionelle Lin9 Maus Modell, basierend auf der Cre-loxP Technologie, generiert. Das Lin9fl/fl Allele kann in vivo und in vitro mit der Cre-Recombinase deletiert werden. Deshalb wurde ein induzierbares System mit Lin9fl/fl Mäusen, die zusätzlich Cre-ERT2 tragen, etabliert. Die MEFs dieser transgenen Mäuse trugen nach Induktion mit Tamoxifen einen kompletten Lin9 Knockout. Die Deletion von LIN9 hat dramatische Auswirkung auf den Zellzyklus und die Wachstumsrate der MEFs. Neben der Akkumulation in der G2/M Phase des Zellzyklus kommt es zu einem vollständigen Proliferationsstop. Zusammenfassend war es möglich, ein Lin9 „Gene Trap“ und ein konditionelles Knockout Maus Modell zu generieren. Beide Mausmodelle belegen, dass Lin9 ein essenzielles Gen für die Embryonalentwicklung und die Kontrolle des Zellzyklus ist. Die weitere Erforschung der LIN9 Defizienz wird dazu beitragen, grundlegende Mechanismen der frühen Zellzykluskontrolle und der embryonalen Entwicklung zu verstehen.

Die NO-sensitive Guanylyl-Cyclase (NO-GC) ist der wichtigste Rezeptor für das freigesetzte Signalmolekül NO und katalysiert die Bildung des second Messenger cGMP. Die NO/cGMP Signalkaskade ist im kardiovaskulären System essentiell für die Hemmung der Thrombozytenaggregation und des Tonus der glatten Gefäßmuskulatur und trägt damit zur Regulation des Blutdrucks bei. In der Arbeitsgruppe wurden Mauslinien generiert, bei denen die NO-GC ubiquitär (GCKO) oder spezifisch in glatten Muskelzellen (SM-GCKO) ausgeschaltet ist. Beide Mausstämme zeigen eine arterielle Hypertonie mit einem Anstieg des systolischen Blutdrucks um 30 mmHg im Vergleich zu den jeweiligen Kontrolltieren. Neben cGMP ist auch cAMP als weiterer second messenger in einer Reihe von Regulationsprozessen im kardiovaskulären System involviert. Die Intensität und Dauer eines cAMP-Signals wird zum einen durch seine Synthese durch die Adenylyl-Cyclasen, zum anderen durch seine Hydrolyse durch die Phosphodiesterasen (PDE) bestimmt. Dabei spielt die PDE3 als cGMP-inhibierte, cAMP-abbauende PDE eine wichtige Rolle im sogenannten cGMP/cAMP-Crosstalk. Ein wichtiges Instrument zur Untersuchung PDE3-abhängiger Prozesse ist der spezifische Hemmstoff Milrinon. Innerhalb dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass die PDE3-Expression abhängig ist von der Expression des cGMP-produzierenden Enzyms NO-GC: So zeigte sich in Thrombozyten wie auch in glatten Gefäßmuskelzellen nach Deletion der NO-GC im Vergleich zu den Kontrolltieren eine Reduktion der PDE3 um die Hälfte. Diese Reduktion der PDE3-Expression war sowohl in den glatten Muskelzellen von GCKO wie auch von SM-GCKO-Mäusen zu finden. Weiterhin konnte dargestellt werden, dass die Down-Regulation der PDE3 in glatter Gefäßmuskulatur in SM-GCKO-Mäusen parallel zur Reduktion der NO-GC und nicht parallel zum daraus resultierenden Anstieg des Blutdrucks verläuft. Die Reduktion der PDE3-Expression ging mit einer Verminderung der Aktivität in den Thrombozyten und glatten Muskelzellen des GCKOs einher. In Herzmuskelgewebe dagegen änderten sich Expression und Aktivität der PDE3 nicht. Der spezifische PDE3-Hemmstoff Milrinon führte zu einem weiteren Anstieg des systolischen Blutdrucks in den KO-Linien, nicht aber in Kontrolltieren. Zusammenfassend spielt die PDE3 eine wichtige Rolle im cGMP/cAMP-Crosstalk sowohl in Thrombozyten als auch in glatten Gefäßmuskelzellen von Mäusen. / Role of PDE3 on cGMP/cAMP crosstalk in mice deficient in NO-sensitive guanylyl cyclase

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