Magdeburg, Univ., Diss., 2001. / Computerdatei im Fernzugriff.

Magdeburg, Universiẗat, Diss., 2001.

Regensburg, Univ., Diss., 2008.

Techn. University, Diss., 2004--Dresden.

Aachen, Techn. Hochsch., Thesis (doctoral), 2000.

Compartmentalization of cell membranes, in particular of the apical membrane of columnar epithelia, is the topic of this thesis. The first part characterizes the apical membrane and its specialized organization and morphology, whereas the second part focuses on the formation of this unique plasma membrane domain during epithelial polarization. The apical membrane of columnar epithelia is enriched in glycosphingolipids, a class of lipids that are known to interact with cholesterol to form liquid ordered domains, also termed "rafts", in cell membranes. Imaging the apical surface of untreated and raft lipid depleted MDCK cells with atomic force microscopy revealed that raft lipids are involved in the formation and/or maintenance of microvilli, actin based protrusions of the apical plasma membrane, indicating a regulatory link between membrane domains and the cytoskeleton. Furthermore, antibody patching and photobleaching experiments performed during the work of this thesis suggest that the organization into raft and non-raft domains is very different in the apical membrane of MDCK cells compared to the plasma membrane of a fibroblast. In fact, the data support the hypothesis that the apical membrane could be a percolating raft membrane in which rafts constitute the major phase and non-raft domains exist as isolated entities. The second part of this thesis analyses the segregation of apical and basolateral membrane domains during epithelial polarization. This segregation can either be achieved by generating scaffolded domains prior to junction formation or by polarized secretory and endocytic membrane traffic after the establishment of cell junctions. While most apical and basolateral marker proteins in MDCK cells follow the latter mechanism, this thesis reports that the apical marker gp135 is confined to the dorsal face already in single attached cells. The unknown antigen was purified and identified as podocalyxin. Analysis of a series of domain mutants revealed that the C-terminal PDZ-binding motif of podocalyxin is mainly responsible for its special localization, which it shares with the PDZ protein NHERF-2. Knocking down podocalyxin by RNA interference resulted in retardation of cell growth and epithelial polarization. Taken together, the data suggest that podocalyxin and NHERF-2 could be part of an early apical polarity scaffolding system based on PDZ-binding and PDZ-containing proteins.

Introduction: 23 million patients worldwide suffer from heart failure. These patients depend on cardiac research, because cardiac research enables the development of new therapeutic strategies and –targets. In cardiomyocytes, the compartmentalization of cAMP and cGMP depends on many factors. T-tubuli and PDEs are responsible for the division of cells in microdomains in which localized and specific cAMP and cGMP-signaling occurs. The aim of this thesis was to develop a method to answer the open questions that remain about the physiological and pathophysiological significance of cAMP/cGMP compartmentalization. Methods: I used the zebrafish as a model, because the transparency of zebrafish larvae enabled non-invasive fluorescent imaging in cardiomyocytes in the living animal. I cloned the Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET) sensors EPAC1-camps for cAMP and cGi500 for cGMP and injected them into zebrafish fertilized embryos. Then I used the F0 generation for Fluorescence Lifetime Imaging (FLIM) -FRET-measurements of cAMP and cGMP. Ca2+ is an important downstream mediator of cAMP and cGMP, because Ca2+ regulates cardiac contraction. Therefore, I also cloned the Ca2+ sensor GCaMP6 and used the dye Fluo-4 AM to include intracellular Ca2+ in the imaging. Results: The cloned sensors for cAMP, cGMP and Ca2+ were successfully injected into the zebrafish and showed expression in individual cardiomyocytes. I developed a protocol to mount the living zebrafish embryos and to measure intracellular cAMP and cGMP with FLIM-FRET in vivo with high spatial resolution. I characterized the sensors in their functionality by showing that the sensors react to changes in intracellular concentrations of cAMP and cGMP. The results of this study include evidence that zebrafish have mechanisms that lead to cAMP/cGMP compartmentalization in the absence of T-tubuli, and these mechanisms keep compartmentalization constant even under extreme cAMP or cGMP increasing drug treatment. Furthermore, I imaged intracellular Ca2+ by confocal microscopy and developed a protocol to use Fluo-4 AM for Ca2+ imaging. Conclusion: The method used in this thesis should allow the investigation of subcellular cAMP/cGMP compartmentalization and Ca2+ and to subsequently answer open questions in the field, for example whether a change of cAMP compartmentalization leads to the pathological phenotypes of cardiac disease or if a changed compartmentalization of cAMP in cardiac disease influences Ca2+ concentrations and therefore contraction. Additionally, this method can be used to learn more about cAMP, cGMP und Ca2+ during regeneration in the heart, because the zebrafish cardiomyocytes can regenerate. / Einleitung: Weltweit sind mehr als 23 Millionen unter Herzinsuffizienz leidende Patienten auf die kardiologische Grundlagenforschung angewiesen, da diese die Voraussetzung für eine bessere Versorgung durch adaptierte und neue Behandlungswege schafft. In Kardiomyozyten hängt die Kompartimentierung von cAMP und cGMP von vielen Faktoren ab. T-Tubuli und PDEs werden unter anderem für die Aufteilung der Zellen in Mikrodomänen, in denen lokalisierte und spezifische cAMP- und cGMP-Signalgebung stattfinden kann, verantwortlich gemacht. Das Ziel dieser Arbeit war die Etablierung einer Methode, mithilfe derer offene Fragen bezüglich der physiologischen und insbesondere der pathophysiologischen Relevanz der cAMP- und cGMP Kompartimentierung beantwortet werden können. Methode: Als Modell diente der Zebrafisch, da die Transparenz von Zebrafisch Embryonen eine nicht-invasive Bildgebung von Fluoreszenz in Kardiomyozyten im lebenden Tier ermöglicht. Dafür klonierte ich die Förster Resonance Energy Transfer (FRET) -Sensoren EPAC1-camps als cAMP-Sensor und cGi500 als cGMP-Sensor und injizierte diese in befruchtete Zebrafisch Embryonen. Anschließend benutzte ich die F0-Generation für Fluorescence Lifetime Imaging (FLIM) -FRET-Messungen von cAMP und cGMP. Da Ca2+ als wichtiger downstream Mediator von cAMP und cGMP die kardiale Kontraktion reguliert, klonierte ich außerdem den Ca2+-Sensor GCaMP6 und benutzte den Farbstoff Fluo-4 AM, um intrazelluläres Ca2+ darzustellen. Ergebnisse: Die klonierten Sensoren für cAMP, cGMP und Ca2+ konnten erfolgreich in den Zebrafisch injiziert werden und zeigten alle Expression in einzelnen Kardiomyozyten. Ich entwickelte ein Protokoll, dass die Fixierung von lebenden Zebrafisch Embryonen und nachfolgender Bildgebung von cAMP und cGMP mit hoher zellulärer Auflösung mit FLIM-FRET in vivo erlaubte. Ich konnte eine funktionelle Charakterisierung der Sensoren durchführen, indem ich zeigte, dass sie auf Konzentrationsänderungen von intrazellulärem cAMP und cGMP reagieren sowie zeigen, dass Zebrafische trotz fehlender T-Tubuli eine signifikante cAMP- und cGMP Kompartimentierung aufweisen, auch unter extremen Bedingungen nach Gabe von cAMP/cGMP stimulierenden Substanzen in hoher Dosierung. Ich konnte zudem subzelluläres Ca2+ durch konfokale Mikroskopie bildgebend darstellen und entwickelte ein Protokoll, um mit Fluo-4 AM eine schnelle Möglichkeit zu haben, Ca2+ mit in die Messungen einzubeziehen. Ausblick: Die in dieser Arbeit benutzte Methode bietet eine gute Möglichkeit, subzelluläre cAMP- und cGMP-Kompartimentierung und Ca2+ zu untersuchen und damit zum Beispiel die Fragen zu beantworten, ob eine veränderte cAMP/cGMP Kompartimentierung zu Herzkrankheiten wie Hypertrophie führt oder ob eine veränderte cAMP Kompartimentierung den zellulären Ca2+ Haushalt und damit die kardiale Kontraktion beeinflusst. Darüber hinaus kann das von mir etablierte Protokoll dazu genutzt werden, mehr über cAMP, cGMP und Ca2+ während der Regeneration im Herzen zu lernen, da der Zebrafisch über ausgeprägte Regenerationsfähigkeiten verfügt.

Introduction: 23 million patients worldwide suffer from heart failure. These patients depend on cardiac research, because cardiac research enables the development of new therapeutic strategies and –targets. In cardiomyocytes, the compartmentalization of cAMP and cGMP depends on many factors. T-tubuli and PDEs are responsible for the division of cells in microdomains in which localized and specific cAMP and cGMP-signaling occurs. The aim of this thesis was to develop a method to answer the open questions that remain about the physiological and pathophysiological significance of cAMP/cGMP compartmentalization. Methods: I used the zebrafish as a model, because the transparency of zebrafish larvae enabled non-invasive fluorescent imaging in cardiomyocytes in the living animal. I cloned the Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET) sensors EPAC1-camps for cAMP and cGi500 for cGMP and injected them into zebrafish fertilized embryos. Then I used the F0 generation for Fluorescence Lifetime Imaging (FLIM) -FRET-measurements of cAMP and cGMP. Ca2+ is an important downstream mediator of cAMP and cGMP, because Ca2+ regulates cardiac contraction. Therefore, I also cloned the Ca2+ sensor GCaMP6 and used the dye Fluo-4 AM to include intracellular Ca2+ in the imaging. Results: The cloned sensors for cAMP, cGMP and Ca2+ were successfully injected into the zebrafish and showed expression in individual cardiomyocytes. I developed a protocol to mount the living zebrafish embryos and to measure intracellular cAMP and cGMP with FLIM-FRET in vivo with high spatial resolution. I characterized the sensors in their functionality by showing that the sensors react to changes in intracellular concentrations of cAMP and cGMP. The results of this study include evidence that zebrafish have mechanisms that lead to cAMP/cGMP compartmentalization in the absence of T-tubuli, and these mechanisms keep compartmentalization constant even under extreme cAMP or cGMP increasing drug treatment. Furthermore, I imaged intracellular Ca2+ by confocal microscopy and developed a protocol to use Fluo-4 AM for Ca2+ imaging. Conclusion: The method used in this thesis should allow the investigation of subcellular cAMP/cGMP compartmentalization and Ca2+ and to subsequently answer open questions in the field, for example whether a change of cAMP compartmentalization leads to the pathological phenotypes of cardiac disease or if a changed compartmentalization of cAMP in cardiac disease influences Ca2+ concentrations and therefore contraction. Additionally, this method can be used to learn more about cAMP, cGMP und Ca2+ during regeneration in the heart, because the zebrafish cardiomyocytes can regenerate. / Einleitung: Weltweit sind mehr als 23 Millionen unter Herzinsuffizienz leidende Patienten auf die kardiologische Grundlagenforschung angewiesen, da diese die Voraussetzung für eine bessere Versorgung durch adaptierte und neue Behandlungswege schafft. In Kardiomyozyten hängt die Kompartimentierung von cAMP und cGMP von vielen Faktoren ab. T-Tubuli und PDEs werden unter anderem für die Aufteilung der Zellen in Mikrodomänen, in denen lokalisierte und spezifische cAMP- und cGMP-Signalgebung stattfinden kann, verantwortlich gemacht. Das Ziel dieser Arbeit war die Etablierung einer Methode, mithilfe derer offene Fragen bezüglich der physiologischen und insbesondere der pathophysiologischen Relevanz der cAMP- und cGMP Kompartimentierung beantwortet werden können. Methode: Als Modell diente der Zebrafisch, da die Transparenz von Zebrafisch Embryonen eine nicht-invasive Bildgebung von Fluoreszenz in Kardiomyozyten im lebenden Tier ermöglicht. Dafür klonierte ich die Förster Resonance Energy Transfer (FRET) -Sensoren EPAC1-camps als cAMP-Sensor und cGi500 als cGMP-Sensor und injizierte diese in befruchtete Zebrafisch Embryonen. Anschließend benutzte ich die F0-Generation für Fluorescence Lifetime Imaging (FLIM) -FRET-Messungen von cAMP und cGMP. Da Ca2+ als wichtiger downstream Mediator von cAMP und cGMP die kardiale Kontraktion reguliert, klonierte ich außerdem den Ca2+-Sensor GCaMP6 und benutzte den Farbstoff Fluo-4 AM, um intrazelluläres Ca2+ darzustellen. Ergebnisse: Die klonierten Sensoren für cAMP, cGMP und Ca2+ konnten erfolgreich in den Zebrafisch injiziert werden und zeigten alle Expression in einzelnen Kardiomyozyten. Ich entwickelte ein Protokoll, dass die Fixierung von lebenden Zebrafisch Embryonen und nachfolgender Bildgebung von cAMP und cGMP mit hoher zellulärer Auflösung mit FLIM-FRET in vivo erlaubte. Ich konnte eine funktionelle Charakterisierung der Sensoren durchführen, indem ich zeigte, dass sie auf Konzentrationsänderungen von intrazellulärem cAMP und cGMP reagieren sowie zeigen, dass Zebrafische trotz fehlender T-Tubuli eine signifikante cAMP- und cGMP Kompartimentierung aufweisen, auch unter extremen Bedingungen nach Gabe von cAMP/cGMP stimulierenden Substanzen in hoher Dosierung. Ich konnte zudem subzelluläres Ca2+ durch konfokale Mikroskopie bildgebend darstellen und entwickelte ein Protokoll, um mit Fluo-4 AM eine schnelle Möglichkeit zu haben, Ca2+ mit in die Messungen einzubeziehen. Ausblick: Die in dieser Arbeit benutzte Methode bietet eine gute Möglichkeit, subzelluläre cAMP- und cGMP-Kompartimentierung und Ca2+ zu untersuchen und damit zum Beispiel die Fragen zu beantworten, ob eine veränderte cAMP/cGMP Kompartimentierung zu Herzkrankheiten wie Hypertrophie führt oder ob eine veränderte cAMP Kompartimentierung den zellulären Ca2+ Haushalt und damit die kardiale Kontraktion beeinflusst. Darüber hinaus kann das von mir etablierte Protokoll dazu genutzt werden, mehr über cAMP, cGMP und Ca2+ während der Regeneration im Herzen zu lernen, da der Zebrafisch über ausgeprägte Regenerationsfähigkeiten verfügt.

Compartmentalization of cell membranes, in particular of the apical membrane of columnar epithelia, is the topic of this thesis. The first part characterizes the apical membrane and its specialized organization and morphology, whereas the second part focuses on the formation of this unique plasma membrane domain during epithelial polarization. The apical membrane of columnar epithelia is enriched in glycosphingolipids, a class of lipids that are known to interact with cholesterol to form liquid ordered domains, also termed "rafts", in cell membranes. Imaging the apical surface of untreated and raft lipid depleted MDCK cells with atomic force microscopy revealed that raft lipids are involved in the formation and/or maintenance of microvilli, actin based protrusions of the apical plasma membrane, indicating a regulatory link between membrane domains and the cytoskeleton. Furthermore, antibody patching and photobleaching experiments performed during the work of this thesis suggest that the organization into raft and non-raft domains is very different in the apical membrane of MDCK cells compared to the plasma membrane of a fibroblast. In fact, the data support the hypothesis that the apical membrane could be a percolating raft membrane in which rafts constitute the major phase and non-raft domains exist as isolated entities. The second part of this thesis analyses the segregation of apical and basolateral membrane domains during epithelial polarization. This segregation can either be achieved by generating scaffolded domains prior to junction formation or by polarized secretory and endocytic membrane traffic after the establishment of cell junctions. While most apical and basolateral marker proteins in MDCK cells follow the latter mechanism, this thesis reports that the apical marker gp135 is confined to the dorsal face already in single attached cells. The unknown antigen was purified and identified as podocalyxin. Analysis of a series of domain mutants revealed that the C-terminal PDZ-binding motif of podocalyxin is mainly responsible for its special localization, which it shares with the PDZ protein NHERF-2. Knocking down podocalyxin by RNA interference resulted in retardation of cell growth and epithelial polarization. Taken together, the data suggest that podocalyxin and NHERF-2 could be part of an early apical polarity scaffolding system based on PDZ-binding and PDZ-containing proteins.